染色質(zhì)免疫沉淀

1、染色質(zhì)免疫沉淀染色質(zhì)免疫沉淀基因型決定表型基因型決定表型破壞了基因型也就改變了表型破壞了基因型也就改變了表型但是，也有一些無(wú)法解釋的現(xiàn)象但是，也有一些無(wú)法解釋的現(xiàn)象 在相應(yīng)的基因堿基序列沒(méi)有發(fā)生變化的情在相應(yīng)的基因堿基序列沒(méi)有發(fā)生變化的情況下，一些生物體的表型卻發(fā)生了改變。況下，一些生物體的表型卻發(fā)生了改變。 什么是表觀遺傳學(xué)什么是表觀遺傳學(xué)?是是DNA及其染色質(zhì)環(huán)境的穩(wěn)定改變，這些可遺傳的及其染色質(zhì)環(huán)境的穩(wěn)定改變，這些可遺傳的變化并不涉及變化并不涉及DNA序列的突變。序列的突變。表觀遺傳修飾表觀遺傳修飾 在不影響在不影響DNA序列的情況下改變基因組的修飾，不僅序列的情況下改變基因組的修飾，不

2、僅可以影響個(gè)體的發(fā)育，而且還可以遺傳下去。這類變異被可以影響個(gè)體的發(fā)育，而且還可以遺傳下去。這類變異被稱為稱為“表觀遺傳修飾表觀遺傳修飾”，并被認(rèn)為是導(dǎo)致遺傳物質(zhì)一致的，并被認(rèn)為是導(dǎo)致遺傳物質(zhì)一致的孿生子出現(xiàn)個(gè)體差異的主要原因。孿生子出現(xiàn)個(gè)體差異的主要原因。染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑 染色質(zhì)重塑在廣義上是指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)整或重新塑染色質(zhì)重塑在廣義上是指染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)調(diào)整或重新塑造染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在一些核內(nèi)因子作用下，染色質(zhì)造染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在一些核內(nèi)因子作用下，染色質(zhì)DNA與其與其包繞的包繞的核心組蛋白核心組蛋白之間親和力的變化或相對(duì)位置的改變使之間親和力的變化或相對(duì)位置的改變使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得較為松

3、散，得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得較為松散，DNA更易于暴露。染色質(zhì)重更易于暴露。染色質(zhì)重塑就是通過(guò)這樣的變化來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。塑就是通過(guò)這樣的變化來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。 在狹義上，染色質(zhì)重塑專指由在狹義上，染色質(zhì)重塑專指由ATP提供能量的、通過(guò)依賴提供能量的、通過(guò)依賴于于ATP的染色質(zhì)重塑復(fù)合物改變組蛋白與的染色質(zhì)重塑復(fù)合物改變組蛋白與DNA的結(jié)合狀態(tài)，的結(jié)合狀態(tài)，在靠近核心組蛋白的在靠近核心組蛋白的DNA表面建立特殊的構(gòu)象，使轉(zhuǎn)錄因表面建立特殊的構(gòu)象，使轉(zhuǎn)錄因子較易于接近子較易于接近DNA的過(guò)程。的過(guò)程。 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展使染色質(zhì)重塑研究得以進(jìn)步染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的發(fā)展使染色質(zhì)重塑研究得以進(jìn)步實(shí)驗(yàn)?zāi)?/p>

4、的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的基本原理與關(guān)學(xué)習(xí)掌握染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的基本原理與關(guān)鍵的操作步驟。鍵的操作步驟。實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程一、交聯(lián)及染色質(zhì)一、交聯(lián)及染色質(zhì)DNA剪切條件的優(yōu)化剪切條件的優(yōu)化準(zhǔn)備一瓶接近長(zhǎng)滿的準(zhǔn)備一瓶接近長(zhǎng)滿的HeLa細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入37%的甲醛至終濃的甲醛至終濃度為度為1%，輕輕搖勻，在，輕輕搖勻，在37孵育孵育10分鐘分鐘。 甲醛的作用甲醛的作用 細(xì)胞的用量細(xì)胞的用量 交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷至棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷至4帶蛋白酶抑制劑帶蛋白酶抑制劑PMSF的的1PBS洗細(xì)胞兩洗細(xì)胞兩次，刮細(xì)

5、胞到一個(gè)次，刮細(xì)胞到一個(gè)2ml離心管，離心管，2000rpm，4離心離心4min收集細(xì)胞。收集細(xì)胞。 甲醛的作用甲醛的作用 在各種交聯(lián)試劑中，甲醛（在各種交聯(lián)試劑中，甲醛（HCHO）的應(yīng)用最為廣泛。甲醛的濃度、）的應(yīng)用最為廣泛。甲醛的濃度、作用時(shí)間及交聯(lián)的溫度等均可能影響交聯(lián)的程度。甲醛可以通過(guò)賴氨酸、作用時(shí)間及交聯(lián)的溫度等均可能影響交聯(lián)的程度。甲醛可以通過(guò)賴氨酸、精氨酸和組氨酸以及那些精氨酸和組氨酸以及那些DNA的氨基和亞氨基基團(tuán)之間的交聯(lián)，高效地的氨基和亞氨基基團(tuán)之間的交聯(lián)，高效地在體內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)在體內(nèi)交聯(lián)蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-RNA以及蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，形成生物復(fù)蛋白質(zhì)

6、，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。除此之外，合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠實(shí)地保留可以忠實(shí)地保留染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且在溫和條件下交聯(lián)很容易逆轉(zhuǎn)。通常交聯(lián)所用的甲醛染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且在溫和條件下交聯(lián)很容易逆轉(zhuǎn)。通常交聯(lián)所用的甲醛終濃度為終濃度為1%，在，在12-37作用作用30min。但是如果反應(yīng)溫度超過(guò)。但是如果反應(yīng)溫度超過(guò)30，本底，本底就可能增加。因此，當(dāng)必須在高溫進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，則應(yīng)減少作用時(shí)間或甲就可能增加。因此，當(dāng)必須在高溫進(jìn)行交聯(lián)時(shí)，則應(yīng)減少作用時(shí)間或甲醛濃度。過(guò)度交聯(lián)將影響細(xì)胞的裂解，并且在超聲處理時(shí)不能獲得理想醛濃度。過(guò)度交聯(lián)將影響細(xì)胞的裂解，并且在超

7、聲處理時(shí)不能獲得理想長(zhǎng)度的長(zhǎng)度的DNA片段及影響片段及影響DNA的溶解。對(duì)于特別容易進(jìn)行交聯(lián)的目的蛋白的溶解。對(duì)于特別容易進(jìn)行交聯(lián)的目的蛋白質(zhì)（例如，組蛋白）需減少交聯(lián)時(shí)間或甲醛濃度。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被質(zhì)（例如，組蛋白）需減少交聯(lián)時(shí)間或甲醛濃度。甲醛的交聯(lián)反應(yīng)可被加入的甘氨酸終止。加入的甘氨酸終止。細(xì)胞的用量細(xì)胞的用量 通常通常2.5108細(xì)胞足夠進(jìn)行細(xì)胞足夠進(jìn)行4次免疫沉淀。因此，一般為了保證用量，次免疫沉淀。因此，一般為了保證用量，采取培養(yǎng)多瓶細(xì)胞，胰酶消化，收集在采取培養(yǎng)多瓶細(xì)胞，胰酶消化，收集在50ml離心管中，培養(yǎng)液重懸，計(jì)離心管中，培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)。（一般分裝數(shù)。（一般分裝1107

8、細(xì)胞于一個(gè)細(xì)胞于一個(gè)EP管，用于免疫沉淀反應(yīng)）。管，用于免疫沉淀反應(yīng)）。 交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響交聯(lián)條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 對(duì)于不同的細(xì)胞類型，甲醛的濃度、交聯(lián)的長(zhǎng)度或者交聯(lián)的溫度都對(duì)于不同的細(xì)胞類型，甲醛的濃度、交聯(lián)的長(zhǎng)度或者交聯(lián)的溫度都需要調(diào)整。如果交聯(lián)不充分，會(huì)導(dǎo)致不完全固定，則需要調(diào)整。如果交聯(lián)不充分，會(huì)導(dǎo)致不完全固定，則DNA片段的平均長(zhǎng)片段的平均長(zhǎng)度會(huì)小于度會(huì)小于500bp。交聯(lián)過(guò)度時(shí)細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，就算延長(zhǎng)。交聯(lián)過(guò)度時(shí)細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，就算延長(zhǎng)超聲波作用時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致重要原料的丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)短，則交聯(lián)超聲波作用時(shí)間也會(huì)導(dǎo)致重要原料的丟失。交聯(lián)時(shí)間如果過(guò)短

9、，則交聯(lián)不完全，產(chǎn)生假陰性，交聯(lián)時(shí)間通常為不完全，產(chǎn)生假陰性，交聯(lián)時(shí)間通常為5分鐘到分鐘到1個(gè)小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)個(gè)小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)而定。實(shí)驗(yàn)而定。 3. 用用500l預(yù)熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的預(yù)熱至室溫帶有蛋白酶抑制劑的SDS裂解液裂解液重懸并裂解細(xì)胞，冰浴重懸并裂解細(xì)胞，冰浴10分鐘；分鐘；超聲波處理剪切染色質(zhì)超聲波處理剪切染色質(zhì)DNA，使其形成，使其形成300-1000 bp即大約相當(dāng)于即大約相當(dāng)于2-5個(gè)核小體長(zhǎng)度的片段；個(gè)核小體長(zhǎng)度的片段； 超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng) 設(shè)置超聲破碎的條件設(shè)置超聲破碎的條件 酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別酶

10、消化與超聲消化相比較的區(qū)別 超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng)超聲條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響及超聲注意事項(xiàng) 超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生超聲波是使用機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響泡沫，這都會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，進(jìn)而影響ChIP的效率。的效率。所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)所以在超聲波斷裂染色質(zhì)時(shí)，要在冰上進(jìn)行，且要設(shè)計(jì)時(shí)斷時(shí)續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深斷時(shí)續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。總超聲時(shí)入管中，但不接觸管底或側(cè)壁，以免產(chǎn)生泡沫。總超聲時(shí)間也不要太

11、長(zhǎng)，以免蛋白降解。間也不要太長(zhǎng)，以免蛋白降解。 設(shè)置超聲破碎的條件設(shè)置超聲破碎的條件超聲處理的條件通?？梢栽O(shè)置為超聲處理的條件通常可以設(shè)置為10秒每次，共秒每次，共3-4次，功率次，功率為為50W時(shí)設(shè)置為最大功率的時(shí)設(shè)置為最大功率的30%，采用，采用2mm超聲頭。不同的超聲頭。不同的超聲處理儀器的設(shè)置不太一樣，摸索超聲條件時(shí)，可以先固超聲處理儀器的設(shè)置不太一樣，摸索超聲條件時(shí)，可以先固定其他條件，先確定每次超聲多長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致明顯發(fā)熱，定其他條件，先確定每次超聲多長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)導(dǎo)致明顯發(fā)熱，然后摸索不同的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可然后摸索不同的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可以使

12、大部分基因組以使大部分基因組DNA斷裂成斷裂成200-1000bp大小。需要注意的大小。需要注意的是每次的超聲體積和細(xì)胞用量宜固定，否則就不能使用一個(gè)是每次的超聲體積和細(xì)胞用量宜固定，否則就不能使用一個(gè)相對(duì)比較固定的超聲條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。相對(duì)比較固定的超聲條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別酶消化與超聲消化相比較的區(qū)別Micrococcal Nuclease可以將染色質(zhì)切成一到幾個(gè)核小體，比超聲波處理可以將染色質(zhì)切成一到幾個(gè)核小體，比超聲波處理的結(jié)果更精致，更均一。另外，酶反應(yīng)的條件比較溫和，對(duì)的結(jié)果更精致，更均一。另外，酶反應(yīng)的條件比較溫和，對(duì)DNA和和DNA-蛋白復(fù)合物的損傷較

13、小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質(zhì)適用于蛋白復(fù)合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質(zhì)適用于新鮮的細(xì)胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時(shí)，經(jīng)常采用沒(méi)經(jīng)過(guò)新鮮的細(xì)胞或組織樣品和冰凍樣品。在研究組蛋白時(shí)，經(jīng)常采用沒(méi)經(jīng)過(guò)甲醛固定的甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。因?yàn)椋┑难芯糠椒?。因?yàn)镹-ChIP沒(méi)經(jīng)過(guò)甲沒(méi)經(jīng)過(guò)甲醛固定，超聲波處理會(huì)打斷組蛋白和醛固定，超聲波處理會(huì)打斷組蛋白和DNA的結(jié)合，所以只能選擇酶處理的結(jié)合，所以只能選擇酶處理染色質(zhì)的方法。對(duì)于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有染色質(zhì)的方法。對(duì)于甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用

14、酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。Millipore公司公司有商品化的有商品化的Micrococcal Nuclease處理的處理的ChIP試劑盒（試劑盒（EZ-Enzyme）提）提供。供。 Enzyme和和sonication處理結(jié)果比較處理結(jié)果比較 超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實(shí)驗(yàn)組可采用不同的超聲波處理?xiàng)l超聲處理的條件需要優(yōu)化，各實(shí)驗(yàn)組可采用不同的超聲波處理?xiàng)l件，比較剪切效果。按以下步驟操作比較各種條件下的剪切效果：件，比較剪切效果。按以下步驟操作比較各種條件下的剪切效果：a. 將超聲處理過(guò)的樣品離心收集上清（將超聲處理過(guò)的樣品離心收集

15、上清（ 4 13000rpm離心離心10分鐘），分鐘），加入加入10l 0.5 M EDTA、20l 1M Tris-HCl、2l 20mg/ml蛋白酶蛋白酶K，45 孵育孵育0.5-1 小時(shí)；小時(shí)；b. 酚酚/氯仿抽提氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于一次，乙醇沉淀并重溶于20l的的ddH2O中，中，1.2% 瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳檢查。凝膠電泳檢查。實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組12345678超聲次數(shù)超聲次數(shù)3691136911超聲功率超聲功率15W15W15W15W25W25W25W25W此頁(yè)內(nèi)容不在正此頁(yè)內(nèi)容不在正常的常的ChIP步驟中步驟中酚酚/氯仿抽提步驟氯仿抽提步驟 按照按照1：1體積比加酚體積比加酚

16、/氯仿充分混勻后離心，取上層水相氯仿充分混勻后離心，取上層水相至新管，加入至新管，加入1/10體積體積3M Nacl，2倍體積無(wú)水乙醇，大轉(zhuǎn)倍體積無(wú)水乙醇，大轉(zhuǎn)數(shù)離心數(shù)離心5min5. 將超聲處理過(guò)的樣品在將超聲處理過(guò)的樣品在4 13000rpm離心離心10分鐘收集上清，分鐘收集上清，10倍稀倍稀釋，將其移入一新的釋，將其移入一新的2ml EP管中；管中；6. 按照每按照每2ml稀釋后液體加入稀釋后液體加入75l的比例加入的比例加入蛋白蛋白A-瓊脂糖瓊脂糖/鮭精鮭精DNA (50%混懸液混懸液)，4搖動(dòng)搖動(dòng)30分鐘，預(yù)處理，分鐘，預(yù)處理，短暫離心短暫離心(700-1000rpm 4，小于小于1

17、分鐘分鐘)，收集上清液；，收集上清液； Beads的選擇的選擇 Input的設(shè)置的設(shè)置7. 向向2ml上清液中加入適量的抗乙?；M蛋白上清液中加入適量的抗乙?；M蛋白H3的抗體的抗體(20l)，4搖動(dòng)搖動(dòng)過(guò)夜，陰性對(duì)照組不加抗體同樣搖動(dòng)過(guò)夜；過(guò)夜，陰性對(duì)照組不加抗體同樣搖動(dòng)過(guò)夜； 抗體的選擇抗體的選擇 對(duì)照的設(shè)置對(duì)照的設(shè)置 二、免疫沉淀染色質(zhì)二、免疫沉淀染色質(zhì)DNA片段片段 Beads的選擇的選擇 利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過(guò)抗原利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)形成抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用抗體復(fù)合物，然后使用Agarose beads或或Magna be

18、ads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過(guò)多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，片段。再經(jīng)過(guò)多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。洗脫免疫沉淀復(fù)合物。Magna beads是近是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新型年來(lái)出現(xiàn)的一種新型beads，它使用方便，不像，它使用方便，不像Agarose beads那樣容易破裂，所以在操作過(guò)程中更簡(jiǎn)單，而且免去那樣容易破裂，所以在操作過(guò)程中更簡(jiǎn)單，而且免去了離心的步驟，節(jié)省不少時(shí)間。了離心的步驟，節(jié)省不少時(shí)間。Millipore公司最新推出的公司最新推出的Magna

19、ChIP試劑盒就是采用這種試劑盒就是采用這種Magna beads。 免疫共沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀免疫共沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀input設(shè)置設(shè)置在進(jìn)行免疫沉淀步驟前的樣品在進(jìn)行免疫沉淀步驟前的樣品染色質(zhì)免疫沉淀抗體的選擇染色質(zhì)免疫沉淀抗體的選擇ChIP Validated 對(duì)照的設(shè)置對(duì)照的設(shè)置 ChIP實(shí)驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)立實(shí)驗(yàn)至少應(yīng)設(shè)立3種對(duì)照：未經(jīng)免疫沉淀的超聲種對(duì)照：未經(jīng)免疫沉淀的超聲處理樣本（處理樣本（input）；陽(yáng)性對(duì)照。一般用組蛋白抗體或）；陽(yáng)性對(duì)照。一般用組蛋白抗體或anti-RNA Polymerase II抗體這些比較保守的在所有細(xì)胞中都能抗體這些比較保守的在所有細(xì)胞中都能結(jié)合基因的蛋

20、白的抗體；結(jié)合基因的蛋白的抗體； 陰性對(duì)照。即用一種無(wú)關(guān)抗體陰性對(duì)照。即用一種無(wú)關(guān)抗體（或相應(yīng)動(dòng)物的免疫前血清），與抗目的蛋白質(zhì)抗體同時(shí)分（或相應(yīng)動(dòng)物的免疫前血清），與抗目的蛋白質(zhì)抗體同時(shí)分別與交聯(lián)染色質(zhì)樣本進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)；別與交聯(lián)染色質(zhì)樣本進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)；選擇不與目的蛋選擇不與目的蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域作對(duì)照，即白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域作對(duì)照，即“基因組對(duì)照基因組對(duì)照”。 另外，還應(yīng)根據(jù)對(duì)另外，還應(yīng)根據(jù)對(duì)ChIP的不同的特殊應(yīng)用設(shè)立不同的實(shí)的不同的特殊應(yīng)用設(shè)立不同的實(shí)驗(yàn)對(duì)照。例如，試圖檢測(cè)目的蛋白質(zhì)是否與某一推測(cè)的結(jié)合驗(yàn)對(duì)照。例如，試圖檢測(cè)目的蛋白質(zhì)是否與某一推測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，則必須將此位

21、點(diǎn)突變后作為對(duì)照；又如，欲測(cè)定位點(diǎn)結(jié)合，則必須將此位點(diǎn)突變后作為對(duì)照；又如，欲測(cè)定突變細(xì)胞株中目的蛋白質(zhì)與基因組突變細(xì)胞株中目的蛋白質(zhì)與基因組DNA結(jié)合情況時(shí)，必須用結(jié)合情況時(shí)，必須用野生型細(xì)胞株作對(duì)照等。野生型細(xì)胞株作對(duì)照等。 8. 加加60l蛋白蛋白A-瓊脂糖瓊脂糖/鮭精鮭精DNA(50%混懸液混懸液)，4搖搖1小時(shí)；小時(shí)；短暫離心短暫離心(700-1000rpm，4，小于，小于1分鐘分鐘) 收集沉淀，分別用低收集沉淀，分別用低鹽免疫復(fù)合物洗液、高鹽免疫復(fù)合物洗液、鹽免疫復(fù)合物洗液、高鹽免疫復(fù)合物洗液、LiCl免疫復(fù)合物洗免疫復(fù)合物洗液洗滌沉淀各一次，每種液體每次用液洗滌沉淀各一次，每種液

22、體每次用1ml，搖動(dòng)，搖動(dòng)3-5分鐘后短暫分鐘后短暫離心收集沉淀。然后用同樣的方法用離心收集沉淀。然后用同樣的方法用TE緩沖液洗滌沉淀兩次緩沖液洗滌沉淀兩次三、三、PCR鑒定結(jié)合于乙酰化組蛋白鑒定結(jié)合于乙?；M蛋白H3的的DNA片段片段10. 向上步所得沉淀中加入向上步所得沉淀中加入250l洗脫液洗脫液(1% SDS, 0.1M NaHCO3)，震蕩，室溫孵育震蕩，室溫孵育15分鐘，離心收集上清；分鐘，離心收集上清；11.加入加入10l 0.5M EDTA、和、和2l 20mg/ml蛋白酶蛋白酶K，45孵育小時(shí)；孵育小時(shí)；12.酚酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20l的的ddH2O中，取中，取1l作模作模板，按以下配方加樣，板，按以下配方加樣，PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組以及擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組以及Input組的組的GAPDH啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增條件啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增條件951分鐘，分鐘，9530秒、秒、5530秒、秒、7230秒、秒、30個(gè)循環(huán)，個(gè)循環(huán)，725分鐘，分鐘，1.5%瓊脂糖電泳檢查結(jié)果。瓊脂糖電泳檢查結(jié)果。 此步此步DNA純化可以選擇適當(dāng)?shù)募兓梢赃x擇適當(dāng)?shù)腄NA純化試劑盒純化試劑盒 PCR的策略的策略 PCR的策略的