蛋白質(zhì)通性、純化與表征

1、蛋白質(zhì)通性、純化與表征蛋白質(zhì)通性、純化與表征一、 蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)和等電點蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。 等電點：蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零等電點：蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零的的pH值稱為等電點。值稱為等電點。在等電點時，蛋白質(zhì)在電場中不移動在等電點時，蛋白質(zhì)在電場中不移動,溶解度最小，粘度溶解度最小，粘度最大?？梢杂萌芙舛确?，聚焦電泳法等測定等電點。最大?？梢杂萌芙舛确?，聚焦電泳法等測定等電點。二、 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)分子直徑在蛋白質(zhì)分子直徑在1-1001-100nmnm之間，在水溶液中具有之間，在水溶液中具有膠體溶膠體

2、溶液液的通性。的通性。1 1、穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素：穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素：蛋白質(zhì)表面極性基團形成的水化膜將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔蛋白質(zhì)表面極性基團形成的水化膜將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔開，不會互相碰撞凝聚而沉淀；開，不會互相碰撞凝聚而沉淀；兩性電解質(zhì)非等電狀態(tài)時，帶同種電荷，構(gòu)成穩(wěn)定的雙兩性電解質(zhì)非等電狀態(tài)時，帶同種電荷，構(gòu)成穩(wěn)定的雙電層，互相排斥不致聚集沉淀。電層，互相排斥不致聚集沉淀。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜半透膜，因此可以應用，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。一旦電荷被中和或水化膜被破壞，蛋白質(zhì)顆粒聚

3、集，便從一旦電荷被中和或水化膜被破壞，蛋白質(zhì)顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。溶液中析出沉淀。2、沉淀蛋白質(zhì)的方法沉淀蛋白質(zhì)的方法鹽析法鹽析法:大量的中性鹽（大量的中性鹽（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），），使蛋白使蛋白質(zhì)質(zhì)脫去水化層脫去水化層而聚集沉淀；不引起變性。而聚集沉淀；不引起變性。有機溶劑沉淀法：有機溶劑沉淀法：破壞水化膜，降低介電常數(shù)，丙酮、乙醇等；破壞水化膜，降低介電常數(shù)，丙酮、乙醇等；重金屬鹽沉淀：重金屬鹽沉淀：pHpI時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，與重金屬離子時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，與重金屬離子（Hg2+.Pb2+.Cu2+等）結(jié)成不溶性沉淀；等）結(jié)成不溶性沉淀；生物堿試劑

4、和某些酸類沉淀法：生物堿試劑和某些酸類沉淀法：pH小于小于pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，時，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：易與生物堿試劑和酸類的負離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸；單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸；加熱變性沉淀法。加熱變性沉淀法。三、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 純化的實質(zhì)：增加制品的純度或比活性純化的實質(zhì)：增加制品的純度或比活性 一般程序：前處理、粗分級分離、細分級分離、結(jié)晶保一般程序：前處理、粗分級分離、細分級分離、結(jié)晶保存存電泳電泳 前前處處理理粗粗分分離離細細分分離離生物組織

5、生物組織 無細胞提取液無細胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速離心解、差速離心選擇性沉淀法選擇性沉淀法親和親和層析層析離子交離子交換層析換層析精制后的蛋白質(zhì)精制后的蛋白質(zhì)凝膠凝膠過濾過濾疏水疏水層析層析吸附吸附層析層析1、前處理（、前處理（pretreatment）：）：將組織和細胞破碎將組織和細胞破碎動物組織和細胞：電動搗碎機動物組織和細胞：電動搗碎機、勻漿器、超聲波處理；勻漿器、超聲波處理；植物組織和細胞：石英砂植物組織和細胞：石英砂+提取液研磨或用纖維素酶處理；提取液研磨或用纖維素酶處理；細菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽細菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處

6、理（分解肽聚糖）聚糖）如果所要蛋白質(zhì)集中在某一細胞組分，用差速離心法收集細胞的某如果所要蛋白質(zhì)集中在某一細胞組分，用差速離心法收集細胞的某一組分（表一組分（表75）；）；如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當?shù)慕橘|(zhì)提如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當?shù)慕橘|(zhì)提取。取。2、粗分級分離（、粗分級分離（roughfractionation)一般用選擇性沉淀法。一般用選擇性沉淀法。（NH4）2SO4分級沉淀法（鹽析）分級沉淀法（鹽析）等電點選擇性沉淀法等電點選擇性沉淀法有機溶劑分級沉淀法有機溶劑分級沉淀法3、細分級分離（、細分級分離（finefractionation)層析法

7、：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親層析法：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相和層析、疏水層析（反相HPLC）電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳等）、等電聚焦、雙向電泳薄膜電泳等）、等電聚焦、雙向電泳密度梯度離心密度梯度離心4、結(jié)晶（晶體保存）、結(jié)晶（晶體保存）結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度的一的一個指標，也是判斷制品是否有活性的指標。純度越高，溶液越濃，個指標，也是判斷制品是否有活性的指標。純度越高，溶液越濃，越

8、容易結(jié)晶。越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機溶劑、結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機溶劑、調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH。四、 蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小的差異透析法：將樣品裝在透析袋里，半透膜阻留透析法：將樣品裝在透析袋里，半透膜阻留prpr分子，而讓分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以達到除去蛋白質(zhì)溶液中小分小的溶質(zhì)分子和水通過，以達到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。子（鹽、低分子酸等）。透析和超過濾法：都是利用蛋白質(zhì)不能通過半透透析和超過濾法：都是利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜膜的性質(zhì)除去樣品中的小分子非蛋白物質(zhì)的性質(zhì)除去樣品中的小分子

9、非蛋白物質(zhì)超過濾法：施以一定的壓力強迫小分子物質(zhì)通過半透膜，超過濾法：施以一定的壓力強迫小分子物質(zhì)通過半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應的蛋白質(zhì)分子。而按半透膜的篩孔大小截留相應的蛋白質(zhì)分子。凝膠過濾法（分子篩層析法）凝膠過濾法（分子篩層析法）凝膠過濾常用的介質(zhì)凝膠過濾常用的介質(zhì)：在層析柱內(nèi)裝填帶有小孔的凝膠顆粒。在層析柱內(nèi)裝填帶有小孔的凝膠顆粒。交聯(lián)葡聚糖（交聯(lián)葡聚糖（Sephadex，是由葡聚糖與環(huán)氧氯丙烷，是由葡聚糖與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形成的有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物）。交聯(lián)形成的有三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物）。 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠凝膠過濾的原理凝膠過濾的原理（二）根據(jù)

10、溶解度差異的分離法蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析蛋白質(zhì)的鹽溶與鹽析鹽溶：是指在適當?shù)闹行喳}濃度溶液中，蛋白質(zhì)溶解度會提高的現(xiàn)象，鹽溶：是指在適當?shù)闹行喳}濃度溶液中，蛋白質(zhì)溶解度會提高的現(xiàn)象，稱鹽溶。稱鹽溶。鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽（高鹽濃度）時，會破壞蛋白鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽（高鹽濃度）時，會破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層（即破壞了蛋白質(zhì)在水溶液的穩(wěn)定性因素）質(zhì)分子表面的水化層（即破壞了蛋白質(zhì)在水溶液的穩(wěn)定性因素）導致蛋白質(zhì)的溶解度降低發(fā)生沉淀析出，稱鹽析。導致蛋白質(zhì)的溶解度降低發(fā)生沉淀析出，稱鹽析。常用的飽和硫酸銨沉淀法分離純化蛋白質(zhì)就是利用鹽析的原理，不同常用的飽和硫酸銨沉淀法分離

11、純化蛋白質(zhì)就是利用鹽析的原理，不同的蛋白質(zhì)對飽和硫酸銨的要求不同，所以，可以通過飽和硫酸銨的蛋白質(zhì)對飽和硫酸銨的要求不同，所以，可以通過飽和硫酸銨的分級沉淀法分離各種蛋白質(zhì)。的分級沉淀法分離各種蛋白質(zhì)。（三） 根據(jù)電荷性質(zhì)的差異1、電泳法、電泳法 電泳：帶電荷的蛋白質(zhì)或核酸分子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳。電泳：帶電荷的蛋白質(zhì)或核酸分子在電場中移動的現(xiàn)象稱為電泳。 帶正電荷向負極泳動，而帶負電荷向正極泳動，分子量小的蛋白質(zhì)帶正電荷向負極泳動，而帶負電荷向正極泳動，分子量小的蛋白質(zhì)泳動快，分子量大的泳動慢，于是蛋白質(zhì)被分離。泳動快，分子量大的泳動慢，于是蛋白質(zhì)被分離。影響因素影響因素電荷、粒子的大

12、小和溶液的粘度電荷、粒子的大小和溶液的粘度電場強度電場強度溶液的溶液的pH2.聚丙烯酰胺凝膠電泳基本原理基本原理：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，根據(jù)被分離以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，根據(jù)被分離物質(zhì)所帶電荷的多少、分子形狀、分子大物質(zhì)所帶電荷的多少、分子形狀、分子大小的不同，在電場的作用下產(chǎn)生不同的移小的不同，在電場的作用下產(chǎn)生不同的移動速度而分離的方法。動速度而分離的方法。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑和加速劑的作用甲叉雙丙烯酰胺在催化劑和加速劑的作用下聚合而成。網(wǎng)狀的大小決定于單體丙烯下聚合而成。網(wǎng)狀的大小決定于單體丙烯酰胺和甲叉雙丙

13、烯酰胺的濃度及兩者的比酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度及兩者的比例。例。SDS(sodium dodecyl sulfate)若果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入若果在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS，SDS是一種陰離子表面是一種陰離子表面活性劑，活性劑，幾乎能破壞蛋白質(zhì)中所有的非共價鍵，從而使多亞基蛋幾乎能破壞蛋白質(zhì)中所有的非共價鍵，從而使多亞基蛋白質(zhì)解聚，并使多肽鏈呈伸展狀態(tài)，消除了蛋白質(zhì)形狀對遷移率白質(zhì)解聚，并使多肽鏈呈伸展狀態(tài)，消除了蛋白質(zhì)形狀對遷移率的影響；的影響；SDS能以能以1:2比例與肽鏈中的氨基酸殘基結(jié)合，使變性蛋白質(zhì)帶上比例與肽鏈中的氨基酸殘基結(jié)合，使變性蛋白質(zhì)帶上大量的凈負電荷，多肽鏈

14、上帶的負電荷量遠超過蛋白質(zhì)分子原有大量的凈負電荷，多肽鏈上帶的負電荷量遠超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，結(jié)果所有的電荷量，因而掩蓋了不同蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，結(jié)果所有的的SDS蛋白質(zhì)復合物，電泳時都以幾乎同樣的電荷質(zhì)量比向正極蛋白質(zhì)復合物，電泳時都以幾乎同樣的電荷質(zhì)量比向正極移動并具有相同的構(gòu)象，所以同一電泳條件下，分子量成為決定移動并具有相同的構(gòu)象，所以同一電泳條件下，分子量成為決定蛋白質(zhì)泳動速率的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳動蛋白質(zhì)泳動速率的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳動越慢。越慢。（1）基本原理）基本原理根據(jù)蛋白質(zhì)分子的等電點進行分

15、離。利用這種技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物根據(jù)蛋白質(zhì)分子的等電點進行分離。利用這種技術(shù)分離蛋白質(zhì)混合物是在具有是在具有pH梯度的介質(zhì)中進行，在外加電場作用下，各種蛋白質(zhì)梯度的介質(zhì)中進行，在外加電場作用下，各種蛋白質(zhì)將移向并聚集（停留）在等于其等電點的將移向并聚集（停留）在等于其等電點的pH梯度處，并形成一個梯度處，并形成一個很窄的區(qū)帶。很窄的區(qū)帶。（2）優(yōu)點及主要用途）優(yōu)點及主要用途加樣位置和體積不受嚴格限制，分辨率很高，可測定加樣位置和體積不受嚴格限制，分辨率很高，可測定pI，分離速度快，分離速度快，分離的蛋白質(zhì)不變性。分離的蛋白質(zhì)不變性?？捎糜诘鞍踪|(zhì)和兩性分子的分離分析和蛋白質(zhì)可用于蛋白質(zhì)和兩性分子

16、的分離分析和蛋白質(zhì)pI的測定。的測定。（3）基本操作）基本操作1、膠的制備、膠的制備(需兩性電解質(zhì)）需兩性電解質(zhì)）2、加樣和電泳、加樣和電泳3、染色和脫色、染色和脫色4、離子交換層析法：（1 1）基本原理）基本原理 利用被分離物質(zhì)的電荷與利用被分離物質(zhì)的電荷與層析載體電荷的相互作用達到分離純化。層析載體電荷的相互作用達到分離純化。 基質(zhì)：纖維素、交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、基質(zhì)：纖維素、交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、層析載體由基質(zhì)和帶電基團組成層析載體由基質(zhì)和帶電基團組成層析載體的種類：層析載體的種類：陽離子交換劑（帶負電）陽離子交換劑（帶負電）如：磺丙基（強酸型）如：磺丙基（強酸型）SP-Sephad

17、ex-O-(CH2)3-SO3H陰離子交換劑（帶正電）陰離子交換劑（帶正電）如：二乙基氨基乙基（中強堿型）如：二乙基氨基乙基（中強堿型）蛋白質(zhì)與離子交換劑間的主要作用：靜電蛋白質(zhì)與離子交換劑間的主要作用：靜電引力引力（2 2）基本操作）基本操作1 1、樣品準備、樣品準備2 2、離子交換劑和層析柱的制備、離子交換劑和層析柱的制備選擇合適的離子交換劑，進行預處理，柱床體積為樣品體積選擇合適的離子交換劑，進行預處理，柱床體積為樣品體積的的2-52-5倍。倍。3 3、上樣。、上樣。4 4、目的蛋白的洗脫、目的蛋白的洗脫洗脫方式有逐步提高洗脫液的鹽濃度（離子強度）和逐步提洗脫方式有逐步提高洗脫液的鹽濃度

18、（離子強度）和逐步提高洗脫液的高洗脫液的pHpH。5 5、洗脫液的鑒定和回收、洗脫液的鑒定和回收蛋白質(zhì)成分常用蛋白質(zhì)成分常用280nm280nm紫外吸收法監(jiān)測紫外吸收法監(jiān)測（四） 親和層析親和層析：利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子親和層析：利用蛋白質(zhì)分子對其配體分子特有的識別能力，建立起來的一種有效的特有的識別能力，建立起來的一種有效的純化方法。純化方法。配基：酶的底物、輔酶、抑制劑、效應物配基：酶的底物、輔酶、抑制劑、效應物及其結(jié)構(gòu)類似物，激素與受體蛋白，抗原及其結(jié)構(gòu)類似物，激素與受體蛋白，抗原與抗體等。與抗體等。親和層析的原理：親和層析的原理：親和層析的原理親和層析的原理五、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的

19、測定1、凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠或稱為凝膠顆粒，其內(nèi)部為凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠或稱為凝膠顆粒，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠顆粒中具有大量微孔，這些微孔只允許較小的分子凝膠顆粒中具有大量微孔，這些微孔只允許較小的分子進入凝膠顆粒內(nèi)部，而大于膠粒微孔的分子則被排阻在外進入凝膠顆粒內(nèi)部，而大于膠粒微孔的分子則被排阻在外洗脫時大分子隨洗脫液先流下來，洗脫液體積?。恍》窒疵摃r大分子隨洗脫液先流下來，洗脫液體積?。恍》肿釉陬w粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大脫體積大測定蛋白質(zhì)分子量一般用交聯(lián)葡聚糖作為凝膠，商品名：測定蛋白質(zhì)分子量一般用交聯(lián)葡聚糖作為凝膠，商品名：Sephadex測得幾種標準蛋白質(zhì)的洗脫體積測得幾種標準蛋白質(zhì)的洗脫體積Ve以相對分子質(zhì)量對數(shù)（以相對分子質(zhì)量對數(shù)（logM）對）對Ve作圖，得標準曲線作圖，得標準曲線再測出未知樣品洗脫體積再測出未知樣品洗脫體積Ve從標準曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量從標準曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量2.SDSPAGE（十二烷基硫酸鈉