重醫(yī)大級(jí)碩士研究生蛋白質(zhì)組學(xué)試題附答案

1、重慶醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士研究生蛋白質(zhì)組學(xué)試題姓名 魏俊 學(xué)號(hào)：2011120028 所在大班：蛋白質(zhì)組學(xué)5班專(zhuān)業(yè)： 在職醫(yī)學(xué)影像 一、解釋?zhuān)ü?5分）1、MALDI TOF MS（10分）答：即基質(zhì)輔助激光解析離子化/飛行時(shí)間質(zhì)譜，為近年來(lái)快速發(fā)展的一種新型軟電離生物質(zhì)譜，該儀器主要由兩部分組成：基質(zhì)附助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）?；|(zhì)輔助激光解吸離子化是利用一定波長(zhǎng)的激光脈沖，在極短的時(shí)間間隔，對(duì)含被測(cè)樣品靶物的一個(gè)微小區(qū)域提供高能量，從固相直接獲得離子的電離方法。該方法特別適用于對(duì)熱敏感化合物或不揮發(fā)化合物的離子化。飛行時(shí)間質(zhì)量分析器的離子分離是用非磁

2、方式達(dá)到，離子在離子源中形成后被電場(chǎng)加速，進(jìn)入真空無(wú)場(chǎng)漂移區(qū)，具有不同質(zhì)荷比的離子因其通過(guò)漂移區(qū)的時(shí)間不同而實(shí)現(xiàn)分離。先后到達(dá)檢測(cè)器產(chǎn)生信號(hào)。按照儀器構(gòu)造不同，又可分為線性飛行時(shí)間質(zhì)量分析器和反射飛行時(shí)間分析器?；|(zhì)輔助激光解吸離子化/飛行時(shí)間質(zhì)譜譜圖中的主要信號(hào)是完整的分子離子峰，因此單電荷分子離子峰占主要地位，隨著分析量增加，雙電荷離子相對(duì)豐度增加，并出現(xiàn)多電荷離子。MALDI-TOF-MS的中心技術(shù)：依據(jù)樣品的質(zhì)荷比（m/z）的不同來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)得樣品分子的分子量。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高及分辨率高等特點(diǎn)。近年來(lái)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域蛋白質(zhì)組研究中必不可缺的重要關(guān)鍵技

3、術(shù)之一，用于檢測(cè)和堅(jiān)定多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、高聚物以及多種合成聚合物的強(qiáng)有力的工具。2、免疫共沉淀（5分）Co-Immunoprecipitation（Co-IP），是以抗體-抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法?；驹恚寒?dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能被沉淀下來(lái)。該技術(shù)可用于鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合以及進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)分析，還可用來(lái)篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。二、 問(wèn)答題（共85

4、分）1、Western Blotting 的流程（10分）。Western Blotting實(shí)驗(yàn)流程第一步：蛋白樣品制備        蛋白抽提質(zhì)量的好壞直接決定著Western結(jié)果的好壞，因此，根據(jù)標(biāo)本類(lèi)型和檢測(cè)類(lèi)型選擇合適的蛋白制備方法是至關(guān)重要的。作為沃爾森的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品，我們?yōu)槟峁㏑IPA改良型試劑盒以提取細(xì)胞或組織的總蛋白。        RIPA改良型試劑盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、裂解緩沖液Lys

5、is Buffer、PMSF等，可在非變性條件下從哺乳動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞中提取總蛋白，獲得的總蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后續(xù)研究。 第二步：蛋白定量        為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，收集的蛋白樣品均應(yīng)測(cè)定蛋白濃度。蛋白濃度的測(cè)定方法，應(yīng)根據(jù)組織細(xì)胞裂解或勻漿所使用的方法及裂解液的不同選用，因?yàn)槿ス竸┖瓦€原劑等對(duì)不同蛋白濃度測(cè)定方法的影響差別很大。如使用沃爾森公司生產(chǎn)的RIPA改良型試劑盒，建議您使用BCA法測(cè)定蛋白濃度（WB0003，WB0004）。 

6、第三步：電泳(1) SDS-PAGE凝膠配制        沃爾森的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（WB0006）提供了所需的試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方，我們也為您提供了制膠所需的各種組分：30% Acr-Bis(29:1)（WB0014）； 40% Acr-Bis(39:1)（WB0015）； PMSF(100mM)（WB0016） ；0.5M Tris-HCl,pH6.8（WB0017）； 1.5M Tris-HCl,pH8.8（W0018）。 (2) 樣

7、品處理        每80L樣品加入20L的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（WB0005），混勻。置于100的水浴加熱10min，14000g離心20min，取上清液進(jìn)行電泳。(3) 上樣與電泳 第四步：轉(zhuǎn)膜        轉(zhuǎn)膜緩沖液可以參考分子克隆自行配制。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。    &

8、#160;   轉(zhuǎn)膜效果可以通過(guò)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)觀察轉(zhuǎn)膜效果，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。也可以用沃爾森的麗春紅染色液（WB0008，WB0009）對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果，并用鉛筆在膜上做出適當(dāng)標(biāo)記。還可以用沃爾森的蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)試劑盒（WB0010）對(duì)轉(zhuǎn)膜后的PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。 第五步：封閉        麗春紅染色后可用鉛筆在膜上做出適當(dāng)標(biāo)記，然后用預(yù)先準(zhǔn)備好的WB洗滌液（WB0011）漂洗35min，將膜上的紅色洗去。（注意

9、：以后所有的步驟均要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。）棄去洗液后，加入10%的脫脂奶粉（建議使用：完達(dá)山脫脂奶粉；奶粉可用WB洗滌液溶解），在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60min。如背景較高，可以在4 封閉過(guò)夜。 第六步：孵育1一抗孵育        參考一抗的說(shuō)明書(shū)，按比例稀釋一抗。在室溫下孵育2小時(shí)，然后用WB洗滌液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。2二抗孵育        參考二抗的說(shuō)明書(shū)，按比例稀釋二抗。在

10、室溫下孵育1小時(shí)，然后用WB洗滌液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。 第七步：顯色        建議選用Pierce公司生產(chǎn)的ECL發(fā)光液。 第八步：顯影        ECL發(fā)光液處理過(guò)的膜，用保鮮袋包裹后，與X光片一起置于暗合中。根據(jù)熒光的強(qiáng)弱進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間的曝光，取出X光片置于顯影液，定影液中顯影（WB0012）。 2、血漿/血清蛋白質(zhì)組研究中需要著重注意的問(wèn)題（10分）。1、血漿/血清樣品選擇去血小板的血

11、漿由于避免血小板的激活作用，減少了蛋白質(zhì)的體外降解，因而較血清更適合一定的肽組學(xué)研究；去血小板的EDTA血漿或枸櫞酸血漿樣品，更適合分析低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)；如果要使用一定的蛋白酶抑制劑，一定要在早期加入，而且要謹(jǐn)慎使用，因?yàn)橐种苿┑募尤肟赡軐?duì)MS分析造成一定的干擾，而且一些小分子的抑制劑與蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)的亞型，這些都將使得分析結(jié)果變得復(fù)雜。2、樣品的收集與貯存為減少血小板的污染，血液樣品在分析前最好用0.2m的低蛋白質(zhì)結(jié)合膜過(guò)濾，樣品分裝冰凍儲(chǔ)存，減少融化-再冰凍的循環(huán)；樣品應(yīng)分裝并貯存在液氮中，減少或不加蛋白酶抑制劑，以減少對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。3、去除高豐度蛋白和分級(jí)技術(shù)血漿/血清樣品

12、中蛋白質(zhì)種類(lèi)很多，而且所含蛋白質(zhì)具有較大的動(dòng)力學(xué)范圍，其中有許多豐度較高但不含有特殊生物學(xué)信息的蛋白質(zhì)，這將會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分析造成極大的困難，甚至根本不能檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)，因此，通過(guò)對(duì)原始蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫和分步分離減少樣品中蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，可以極大簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)和分析，提高對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和識(shí)別的靈敏度和準(zhǔn)確度。4、多維策略的運(yùn)用鳥(niǎo)槍測(cè)序法(Shotgun sequencing)，即高豐度蛋白去除 + 全蛋白酶解 + 二維液相色譜(陽(yáng)離子/陰離子交換色譜 + 反相色譜)分離 + 質(zhì)譜鑒定(離子阱或Q-TOF串聯(lián)質(zhì)譜)3、藥物蛋白質(zhì)組學(xué)定義及主要研究領(lǐng)域。試舉例說(shuō)明其在藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)

13、中的應(yīng)用（10分）。藥物蛋白質(zhì)組學(xué)就是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在藥物研發(fā)中的應(yīng)用。藥物蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究領(lǐng)域：臨床前研究-發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點(diǎn)，以及針對(duì)這些靶點(diǎn)的全部可能的化合物，以及應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究藥物作用機(jī)制和毒理學(xué)；臨床研究方面-發(fā)現(xiàn)藥物作用的特異蛋白作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標(biāo)志物，或以蛋白質(zhì)譜的差異將患者分類(lèi)并給予個(gè)體化治療。藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)：闡明藥物的作用機(jī)制；藥物毒理作用機(jī)制。耐藥性及個(gè)體化治療的研究；中藥現(xiàn)代化中的研究應(yīng)用藥物蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用舉例：（1）研究人員通過(guò)比較給藥前后的蛋白質(zhì)組，找到了藥物阿霉素抗乳腺癌的一個(gè)作用靶標(biāo)Hsp

14、27。（2）瘧原蟲(chóng)入侵血紅細(xì)胞的阻斷靶點(diǎn)探測(cè)：半胱氨酸蛋白水解酶是瘧原蟲(chóng)生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化學(xué)探針I(yè)125-DCG-04打靶，然后通過(guò)抗DCG-04的生物素純化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶類(lèi)的亞蛋白質(zhì)組；通過(guò)酶活性分析，最終發(fā)現(xiàn)在瘧原蟲(chóng)的入侵血紅細(xì)胞的裂殖期，僅有一個(gè)有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白質(zhì)falcipain 1；從數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到falcipain 1的抑制劑YA29-Eps，結(jié)果證實(shí)YA29-Eps可阻斷瘧原蟲(chóng)的入侵紅細(xì)胞。4、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)與功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和內(nèi)容的差異，以及在臨床研究和應(yīng)用上的特點(diǎn)與作用（10分）。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)又稱(chēng)

15、組成蛋白質(zhì)組學(xué)，這是一種針對(duì)有基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的生物體或組織、細(xì)胞，建立其蛋白質(zhì)或亞蛋白質(zhì)組(或蛋白質(zhì)表達(dá)譜)及其蛋白質(zhì)組連鎖群的一種全景式的蛋白組學(xué)研究，從而獲得對(duì)有機(jī)體生命活動(dòng)的全景式認(rèn)識(shí)。* SWISS-PROT（1986）是專(zhuān)門(mén)的、含高度處理的七萬(wàn)多個(gè)蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)*另一相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)TrEMBL：含有從EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的核苷酸序列自動(dòng)翻譯過(guò)來(lái)的蛋白質(zhì)序列 蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)復(fù)雜混合物的分析是在數(shù)據(jù)庫(kù)及匹配工具幫助下進(jìn)行部分序列測(cè)定，非通過(guò)完整序列測(cè)定來(lái)實(shí)現(xiàn)鑒定射線晶體學(xué)和核磁共振光譜學(xué)加強(qiáng)了蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的研究，同時(shí)也產(chǎn)生structural proteomics*“Protein D

16、ata Bank”是第一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，包含一萬(wàn)多個(gè)結(jié)構(gòu)* 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展：主要集中在增加結(jié)構(gòu)測(cè)定的通量和啟動(dòng)整個(gè)蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)分析系統(tǒng)計(jì)劃功能蛋白質(zhì)組學(xué)指在特定時(shí)間、特定環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件下基因組活躍表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，即與某一功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，是總蛋白質(zhì)組的一部分。例如： 與某一生理現(xiàn)象或病理過(guò)程相關(guān)的所有蛋白質(zhì)（比如炎癥、腫瘤等）。它從局部入手，研究蛋白質(zhì)組的各個(gè)功能亞群體，將多個(gè)亞群體組合起來(lái)，逐步描繪出接近于生命、細(xì)胞的“全部蛋白質(zhì)”的蛋白質(zhì)組圖譜。界于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組研究之間。既能闡明某一群體蛋白質(zhì)的功能，亦能豐富總蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，是從生

17、物大分子(蛋白質(zhì)、基因)水平）到細(xì)胞水平研究的重要橋梁環(huán)節(jié) 。是一個(gè)相對(duì)較新的領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)相互作用、生物化學(xué)功能、細(xì)胞功能和系統(tǒng)功能等的研究 研究方法蛋白質(zhì)芯片、噬菌體展示技術(shù)、酵母雙雜交。5、蛋白質(zhì)組學(xué)在心血管基礎(chǔ)和臨床研究中的目的和意義（10分）。從蛋白質(zhì)水平研究相關(guān)心血管疾病的發(fā)病機(jī)制；應(yīng)用心血管疾病蛋白標(biāo)記物來(lái)更早、更準(zhǔn)確地檢測(cè)心血管疾病，尤其是急性冠脈綜合征(ACS)；蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)源的信息作為目前患者診斷的補(bǔ)充；蛋白質(zhì)組檢測(cè)獲得的信息有利于個(gè)體化治療，為其提供新的治療靶位；蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)工具和信息用于治療的各個(gè)階段，可以適時(shí)評(píng)估治療的效果和校正治療方案。6、目前的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在

18、醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)和不足（10分）。答：蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病的研究中占有十分重要的地位，旨在運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段，通過(guò)比較正常和病理情況下細(xì)胞、組織或體液中蛋白質(zhì)在組成成分、表達(dá)水平、表達(dá)位置和修飾狀態(tài)上的差異，尋找疾病診斷和預(yù)后的特異性蛋白質(zhì)，包括特異性抗原及相關(guān)抗原、受體、酶等，以及藥物治療的靶標(biāo)等。通過(guò)對(duì)疾病相關(guān)功能蛋白質(zhì)進(jìn)行定性、定量和表征研究，深入了解這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，揭示疾病過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的活動(dòng)規(guī)律，為疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的闡明和早期診斷及治療提供理論依據(jù)和解決途徑。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)主要內(nèi)容是以系統(tǒng)生物學(xué)的思路構(gòu)建蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)策略與各種功能基因組學(xué)技術(shù)

19、、臨床試驗(yàn)診斷與治療技術(shù)相結(jié)合的全新技術(shù)平臺(tái)、在疾病的預(yù)防、早期診斷和治療等方面推進(jìn)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的結(jié)合，以期在人類(lèi)重要疾病的預(yù)防方面取得重大突破。由于臨床蛋白質(zhì)促學(xué)具有廣闊的應(yīng)用前景而備受臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)、科研機(jī)構(gòu)和藥品研究與發(fā)展部門(mén)的高度關(guān)注。特別是臨床蛋白質(zhì)組研究計(jì)劃，NIH醫(yī)學(xué)研究指南以及HUPO三個(gè)國(guó)際合作項(xiàng)目的啟動(dòng)與實(shí)施，極大地推動(dòng)臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作的快速發(fā)展，其研究對(duì)象是直接來(lái)自臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐的實(shí)驗(yàn)樣本材料。（1）臨床蛋白質(zhì)組學(xué)是將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)研究，它主要圍繞疾病的預(yù)防、早期診斷和治療等方面開(kāi)展研究，其中惡性腫瘤是臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)重點(diǎn)研究對(duì)象。由于腫瘤生

20、物標(biāo)志物對(duì)早期診斷具有重要價(jià)值，所以臨床蛋白質(zhì)組學(xué)的主要目標(biāo)之一是尋找合適的腫瘤生物標(biāo)志物，多分子生物標(biāo)志物已成為尋找腫瘤生物標(biāo)志物的一個(gè)研究趨勢(shì)。（2）臨床蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)新近出現(xiàn)的一個(gè)分支學(xué)科，它側(cè)重蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究，并圍繞著疾病的預(yù)防、早期診斷和治療等方面開(kāi)展研究；主要包括以下幾個(gè)方面： 疾病動(dòng)物模型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究、 尋找疾病的生物標(biāo)志物和藥物治療靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)?？傊?，蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病的研究中占有極重要的地位，該研究旨在運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段，通過(guò)比較正常和病理情況下細(xì)胞、組織或體液中蛋白質(zhì)在組成成分、表達(dá)水平、表達(dá)位置和修飾狀態(tài)上的差異，尋找疾病診斷和預(yù)后的特

21、異性蛋白質(zhì)，包括特異性抗原及相關(guān)抗原、受體、酶以及藥物治療的靶標(biāo)等。通過(guò)對(duì)疾病相關(guān)功能蛋白質(zhì)進(jìn)行定性、定量和表征研究，深入了解這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，揭示疾病過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)規(guī)律，為疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制機(jī)理的闡明和早期診斷及治療提供理論依據(jù)和解決途徑。由于蛋白質(zhì)組是一個(gè)動(dòng)態(tài)、變化的整體，生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)不能像核酸一樣通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)增加樣品量，因此其復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于基因組。盡管雙向凝膠電泳在蛋白質(zhì)組研究中已被廣泛應(yīng)用，但這種方法還存在局限性。首先，雖然固相化PH梯度等電聚焦電泳技術(shù)的出現(xiàn)已使雙向凝膠電泳的重復(fù)性得到改善，但重復(fù)性仍然是雙向凝膠電泳方法存在的主要問(wèn)題。同樣的操作人員，

22、同樣的樣品，同樣的儀器，幾次操作，所得到的雙向凝膠電泳圖譜很難一模一樣；其次，雙向凝膠電泳分析時(shí)部分蛋白質(zhì)的丟失，特別是疏水性蛋白質(zhì)和相對(duì)分子質(zhì)量大于10×103蛋白質(zhì)的丟失，使得雙向凝膠電泳作為通用的蛋白質(zhì)分離展示方法有一定局限性。對(duì)于一些低豐度蛋白和極端PI值的蛋白不能很好分離; 再次，通過(guò)雙向凝膠電泳分離的蛋白點(diǎn)不一定只代表一種蛋白.雙向電泳的通量、靈敏度和規(guī)?；写谶M(jìn)一步加強(qiáng)。二維凝膠電泳有分離容量的先天限制，染色轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)操作困難費(fèi)時(shí)，低峰度蛋白難以辨別，和質(zhì)譜技術(shù)的連用已成為瓶頸。因此，國(guó)際上開(kāi)始重視研究以色譜電泳質(zhì)譜為主的技術(shù)平臺(tái)。另一方面，酵母雙雜交技術(shù)雖已經(jīng)被用

23、于研究蛋白質(zhì)連鎖群和蛋白質(zhì)功能網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，但仍缺乏快速、高校的手段獲取復(fù)雜蛋白質(zhì)相互作用的多維信息。蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)研究雖已有應(yīng)用，但仍困難重重。蛋白質(zhì)是機(jī)體生理、病理活動(dòng)功能的直接執(zhí)行者，對(duì)于它的性質(zhì)和數(shù)量變化的精確把握是揭示機(jī)體生理變化和疾病病因、發(fā)病機(jī)制的重要切入點(diǎn)。與傳統(tǒng)的單一蛋白質(zhì)研究方法相比，組學(xué)技術(shù)可大大提高診斷的敏感性和特異性，蛋白質(zhì)組學(xué)的這一技術(shù)特點(diǎn)無(wú)疑在醫(yī)學(xué)研究中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)，它可以跟蹤機(jī)體最細(xì)微的生理病理變化，通過(guò)對(duì)疾病特異性蛋白質(zhì)的尋找，使疾病的早期診斷成為可能。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為正常生理研究、疾病診斷，尤其是早期診斷方面提供了廣闊的技術(shù)平臺(tái)，在指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后等

24、方面具有巨大發(fā)揮空間。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在各個(gè)領(lǐng)域、各個(gè)方面，例如，神經(jīng)生理學(xué)方面，由于大腦高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能，傳統(tǒng)研究方法已難以適應(yīng)亟待發(fā)展的科研及臨床需求，而蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)給神經(jīng)科學(xué)研究帶來(lái)新的動(dòng)力；腫瘤的早期診斷及預(yù)后判斷是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中涉及最多的領(lǐng)域，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，有可能發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)既可作為腫瘤診斷的分子標(biāo)記，又可作為治療和藥物開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)；另外，心腦血管系統(tǒng)功能變化來(lái)自于心肌和血管系統(tǒng)蛋白質(zhì)的變化，這些變化也許可以通過(guò)聯(lián)合使用一系列蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)證實(shí)。但蛋白質(zhì)組學(xué)在臨床應(yīng)用的研究尚處于起步階段，還存在許多不足。例如，臨床樣本

25、都是各種細(xì)胞或組織混雜，狀態(tài)不一，病變組織與正常組織的差異比較，往往是多種細(xì)胞甚至組織蛋白質(zhì)組混合物的比較，而蛋白質(zhì)組研究需要的通常是單一的細(xì)胞類(lèi)型；質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快，也最具活力和潛力的技術(shù)，對(duì)于蛋白質(zhì)鑒定而言，高通量、高靈敏度和高精度是三個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，但一般的質(zhì)譜技術(shù)卻難以將三者合一；雙向凝膠電泳是分離蛋白質(zhì)的有效手段，但做過(guò)的人一定會(huì)抱怨它的繁瑣、不穩(wěn)定和低靈敏度等缺點(diǎn)。然而蛋白質(zhì)組學(xué)在技術(shù)層面不斷有新的進(jìn)步，激光捕獲顯微解剖(LCM) 、雙向凝膠電泳質(zhì)譜等新技術(shù)的發(fā)展使蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷得到完善。現(xiàn)階段，蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法具有多技術(shù)并存、各有優(yōu)勢(shì)和局限的特點(diǎn)，難以像基因

26、組研究一樣形成比較一致的方法，除了發(fā)展新方法，更強(qiáng)調(diào)各種方法的整合和互補(bǔ)。另外，蛋白質(zhì)組學(xué)與其它學(xué)科的交叉也將日益顯著和重要，這種交叉是新技術(shù)新方法的活水之源。7、鼻咽癌蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容和成果（10分）。1）NPC相關(guān)蛋白質(zhì)及標(biāo)志物篩選（1）NPC及正常鼻咽上皮（NP）的蛋白質(zhì)表達(dá)譜 腫瘤蛋白質(zhì)組表達(dá)譜及其蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，是深入開(kāi)展腫瘤蛋白質(zhì)組相關(guān)研究的基礎(chǔ)。 通過(guò)NPC蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究工作建立了NPC細(xì)胞系、LCM來(lái)源的NPC和正常鼻咽上皮細(xì)胞的2DE參考圖譜，構(gòu)建了首個(gè)鼻咽癌2DE數(shù)據(jù)庫(kù)， NPC與NP的差異表達(dá)譜（2）NPC與NP的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究腫瘤細(xì)胞與其起源的正常細(xì)胞的比較

27、蛋白質(zhì)組學(xué)研究是發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的最直接和合理的方式之一 采用組織樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要障礙是組織的異質(zhì)性 如：NPC 組織中常含大量的浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞和其它間質(zhì)細(xì)胞為提高腫瘤標(biāo)志物篩選的準(zhǔn)確性，有必要從組織中純化靶細(xì)胞用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究 * NPC血清蛋白質(zhì)組學(xué)尋找NPC的特異抗原 通過(guò)對(duì)差異蛋白質(zhì)stathmin、14-3-3和annexin I的臨床病理意義的研究，發(fā)現(xiàn)： *它們的表達(dá)與NPC轉(zhuǎn)移、分化或預(yù)后相關(guān)，有望成為鑒別NPC分化程度、預(yù)測(cè)NPC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的分子標(biāo)志物，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)價(jià)值2）NPC發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究（1）NPC不同階段和分化程度的蛋白質(zhì)組學(xué)

28、研究腫瘤分化過(guò)程中蛋白質(zhì)組動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究對(duì)于腫瘤診斷和治療具有十分重要意義。近年，以福爾馬林固定-石蠟包埋（formalin fixed paraffin embedded，F(xiàn)FPE）組織為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)打破了以新鮮組織標(biāo)本為研究對(duì)象的傳統(tǒng)模式，其優(yōu)勢(shì)是豐富的標(biāo)本庫(kù)存和完善的臨床資料（2）腫瘤間質(zhì)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究近年，腫瘤與腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)之間的相互作用對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展所起的支持與促進(jìn)作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 對(duì)純化的鼻咽癌間質(zhì)和正常鼻咽間質(zhì)進(jìn)行研究和比較，6-10B不表達(dá)Periostin，轉(zhuǎn)移潛能低，即差異蛋白Periostin，* 在NPC間質(zhì)高表達(dá)

29、，* 它通過(guò)與Integrin V5結(jié)合，來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，表明腫瘤微環(huán)境的蛋白質(zhì)組變異在鼻咽癌發(fā)病中發(fā)揮重要作用。（3）NPC放療抵抗的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 目前鼻咽癌的主要治療手段是放射治療 但是，部分 NPC 對(duì)放療抗拒，但其機(jī)制仍然不甚清楚 因此尋找鼻咽癌放療抗拒相關(guān)的蛋白質(zhì)，不僅有助于揭示鼻咽癌放療抗拒的機(jī)制，且能為鼻咽癌放療敏感性預(yù)測(cè)及鼻咽癌的個(gè)體放療提供科學(xué)依據(jù)研究結(jié)果提示：14-3-3和Maspin的下調(diào)及GRP78和Mn-SOD的上調(diào)與放療抵抗相關(guān)，這四個(gè)蛋白質(zhì)有望作為預(yù)測(cè)鼻咽癌放療反應(yīng)的標(biāo)志物，上調(diào)14-3-3表達(dá)可降低CNE2-IR細(xì)胞的放射抗拒性 （4）在NPC發(fā)生

30、發(fā)展中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)的組學(xué)研究 如：P53、TGF-、RKIP、磷酸化蛋白質(zhì)組 p53基因在多種人類(lèi)腫瘤中存在高頻率突變，但鼻咽癌中p53基因突變的頻率很低，同時(shí)鼻咽癌中出現(xiàn)p53蛋白質(zhì)的高表達(dá)或聚集。p53干擾的蛋白質(zhì)組學(xué)研究為揭示NPC細(xì)胞中p53蛋白聚集和功能異常的機(jī)制，以及p53基因在NPC發(fā)病中的作用提供了新線索。鼻咽癌細(xì)胞系HNE1和HNE2經(jīng)抗p53抗體免疫共沉淀、SDS-PAGE分離、質(zhì)譜鑒定蛋白。n 鼻咽癌組織與正常鼻咽上皮組織的差異磷酸化蛋白質(zhì)組分析n 鼻咽癌血清比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究n 蛋白組學(xué)方法識(shí)別RKIP轉(zhuǎn)移鼻咽癌轉(zhuǎn)移抑制蛋白n 不同分化程度的鼻咽癌組織定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究n 鼻咽癌14-3-3蛋白的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)研究n 鼻咽癌放射抵抗蛋白質(zhì)組學(xué)組織芯片 n 血清蛋白質(zhì)組學(xué)（SERPA）方法發(fā)現(xiàn)肺鱗癌患者Tim、Mn-SOD和Prx 陽(yáng)性率明顯高于健康