snp分子標記作業(yè)

1、v 單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于單個核苷酸堿基的改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象，即SNP。v 它包括單堿基的轉(zhuǎn)換、 顛換、 插入及缺失等形式。（1）密度高SNP在人類基因組的平均密度估計為 11000 bp , 在整個基因組的分布達 3106個。（2）富有代表性某些位于基因內(nèi)部的SNP 有可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達水平, 因此, 它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作用因素。（3）遺傳穩(wěn)定性 與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標記相比, SNP

2、具有更高的遺傳穩(wěn)定性。（4）易實現(xiàn)分析的自動化SNP標記在人群中只有兩種等位型(allele) 。這樣在檢測時只需一個“ + - ”或“全無”的方式,這使得基于SNP的檢測分析方法易實現(xiàn)自動化。 v基于以下基于以下9 種基本原理種基本原理:1.以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ); 1.1 限制性片段長度多態(tài)性法 （RFLP ）; 1.2 單鏈構(gòu)象多態(tài)性法 （SSCP ）; 1.3 變性梯度凝膠電泳 （DGGE ）;2. 等位基因特異等位基因特異PCR（AS-PCR）; 3. RT-PCR; 4. 等位基因特異性雜交等位基因特異性雜交; 5. 引物延伸法引物延伸法-單堿基延伸法單堿基延伸法; 6. DNA

3、直接測序法直接測序法;7. 飛行質(zhì)譜儀飛行質(zhì)譜儀 (MALDI- TOFMS )檢測檢測;8. 變性高效液相色譜變性高效液相色譜 ( DH PLC )法法； 研究所用的個凹葉木蘭個體的嫩芽樣品（表）于年分別隨機采自四川雷波縣麻咪澤省級自然保護區(qū)（個）和美姑縣美姑大風頂國家級自然保護區(qū)（個）。樣品采集后即置于有硅膠的密封袋中保存，防止DNA降解。引物篩選所用正對照楊樹葉片采自四川大學望江校園內(nèi)。 基因組 采用大連寶生（）公司的 提取試劑盒分批提取。對所提取的基因組 標號，貯存于冰箱中備用。3、1引物來源 美國加州大學戴維斯分校實驗室從的毛果楊數(shù)據(jù)庫中下載了毛果楊的單基因序列，并將其與擬南芥基因序

4、列對比，發(fā)現(xiàn)其中一段共有序列。由于毛果楊（楊柳科）與擬南芥（十字花科）為系統(tǒng)位置跨度很大的兩種植物，該段序列共有的現(xiàn)象說明了此段序列具有高度的保守性，故推斷在凹葉木蘭的基因序列中也應(yīng)存在該段序列。3、2引物設(shè)計與選擇 實驗室為這一研究設(shè)計出對引物。在本研究中，隨機選取了對引物（表），并從已提取的凹葉木蘭樣品基因組中隨機選擇一個作為模板、以楊樹模板為正對照，對對引物進行復(fù)選，最終選定了條帶清晰、無雜帶的號引物（圖）用于本實驗。 引物選定后，以所提取的凹葉木蘭基因組 為模板，用選定的號引物進行目的片段擴增。由于要對所擴增的目的片段進行測序，為避免酶引起的堿基突變而造成測序結(jié)果不準確，本實驗選用體積

5、比為的酶與高保真酶混合酶。 擴增條件：預(yù)變性；變性， ， 延伸，循環(huán)次。擴增后，采用膠回收試劑盒對目的片段進行回收，進而進行之后的連接、轉(zhuǎn)化等步驟；對暫時不用回收的產(chǎn)物進行編號并貯存于冰箱。 由于本實驗中的產(chǎn)物濃度達不到直接測序的要求，故采用傳統(tǒng)的連接、轉(zhuǎn)化、涂板、檢測、再測序的方法。 具體過程為：將回收的目的片段連接到載體中（連接體系見表），再將連接了目的片段的載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞內(nèi)，置于培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)；將菌液均勻地涂在加入氨芐（）的固體培養(yǎng)基上，于條件下培養(yǎng)；對生長狀況良好的單菌落進行挑菌，最后進行菌落檢測，程序同反應(yīng)體系，模板為槍頭挑取的微量菌體，的加入量為，其余成分不變。選擇菌落檢測為

6、陽性的菌液送北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司測序 測序結(jié)果利用數(shù)據(jù)庫中的在線序列比對軟件以及網(wǎng)頁中在線序列比對軟件進行樣本序列與引物所對毛果楊序列的同源性比對以及樣本序列間相似性比對，找出位點。利用軟件計算樣本核苷酸多樣性指數(shù)，該指數(shù)越高則遺傳多樣性越高。7、結(jié)果分析7、1測序結(jié)果與毛果楊相似性比對 對個樣本進行測序，最終得到條有效序列（表）。表測序結(jié)果顯示，所測片段長度均為512，與實驗中根據(jù)毛果楊序列所設(shè)計的引物所對原始片段長度（）相符。軟件進行相似比對結(jié)果顯示，本實驗所得凹葉木蘭序列的確與毛果楊序列相似，相似區(qū)域達。利用在線比對軟件，將引物所對毛果楊序列片段與測序序列一一進行比對，相似度分別為、和（表）。個樣品的序列與毛果楊序列的相似性一致。7、2 位點檢測 運用在線比對軟件，對測序結(jié)果進行樣本間縱向比較。結(jié)果顯示（表），樣本間同源