胡蘿卜素的提取

1、胡蘿卜素提取的設(shè)計(jì)方案一，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)柱色譜法、薄層色譜法的原理及其方法。2、掌握從胡蘿卜中分離提純胡蘿卜素的原理和方法。3、學(xué)會(huì)用色譜法從胡蘿卜中提取胡蘿卜素并鑒定之。4、初步了解胡蘿卜素的來源以及生產(chǎn)方法。二，實(shí)驗(yàn)原理：胡蘿卜素可通過化學(xué)合成，植物提取和微生物發(fā)酵3種方法生產(chǎn)，根據(jù)生產(chǎn)方式不同分為化學(xué)合成胡蘿卜素和天然胡蘿卜素兩大類。本實(shí)驗(yàn)是從胡蘿卜中提取天然胡蘿卜素。而提取的方法可選擇色譜法。因?yàn)樯V法是分離、純化和鑒定有機(jī)化合物的重要方法之一。具有極其廣泛的用途。色譜法的基本原理是利用混合物中各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其他親和作用性能的差異，使混合物的溶

2、液流經(jīng)該物質(zhì)， 進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配等作用，從而將各組分開。流動(dòng)的混合物溶液稱為流動(dòng)相，固定的物質(zhì)稱為固定相（可以是固體或液體）。根據(jù)組分在固定相中的作用原理不同，可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、排阻色譜等；根據(jù)操作條件的不同，又可分為柱色譜、紙色譜、薄層色譜、氣相色譜及高效液相色譜等類型。1、柱色譜法柱色譜（柱上層析）常用的有吸附柱色譜和分配柱色譜兩類。前者常用氧化鋁、硅膠作固定相。在分配柱色譜中以硅膠、硅藻土和纖維素作為支持劑，以吸收大量的液體作固定相，而支持劑本身不起分離作用。吸附柱色譜通常在玻璃管中填入表面積很大，經(jīng)過活化的多孔性或粉狀固體吸附劑 。 當(dāng)待分離混合物溶液流過吸附

3、柱時(shí)，各種成分同時(shí)被吸附在柱的上端。當(dāng)洗脫劑流下時(shí)，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脫的速度也不同，于是形成不同層次，即溶質(zhì)在柱中自上而下按對(duì)吸附劑親和力大小分別形成若干色帶，再用溶劑洗脫時(shí)， 已經(jīng)分開的溶質(zhì)可以從柱上分別洗出收集 ； 或者將柱吸干 ， 擠出后按色帶分割開 ， 再用溶劑將各色帶中的溶質(zhì)萃取出來。對(duì)于柱上不顯色的化合物分離時(shí)，可用紫外光照射后所呈現(xiàn)的熒光來檢查，或在用溶劑洗脫是分別收集洗脫液，逐個(gè)加以鑒定。2、薄層色譜法薄層色譜法（ThinLayerChomatography，縮寫TLC）是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也用于跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。它兼?zhèn)淞酥V和紙

4、色譜的優(yōu)點(diǎn)。薄層色譜是在載玻片上才、均勻鋪上一薄層吸附劑，制成薄板，用毛細(xì)管將樣品點(diǎn)在起點(diǎn)處，把此薄層板置于盛有展開劑的展開槽內(nèi)，浸入深度為0.5cm，待展開劑前沿利頂端約1cm附近時(shí)取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色，測(cè)定斑點(diǎn)位置，計(jì)算比移值（Rf）。由于層析是在薄層上進(jìn)行的，故稱為薄層層析。薄層色譜常用的有吸附色譜和分配色譜兩類。一般能用硅膠或活性氧化鋁薄層色譜分開的物質(zhì)，也能用硅膠或氧化鋁柱色譜分開，凡能用硅藻土和纖維素作支持劑的分配柱色譜能分開的物質(zhì)；也可分別用硅藻土和纖維素薄層色譜展開， 因此，薄層色譜常用作柱色譜的先導(dǎo)。同時(shí)也可以用吸收劑非極性大孔吸附樹脂，具本實(shí)驗(yàn)的類胡蘿卜

5、素具有末端帶環(huán)的長鏈結(jié)構(gòu)，故平均孔徑為290300A的X-5大孔吸附樹脂更利于他們的吸附和吸附過程中的傳質(zhì)。3、胡蘿卜素的分離-胡蘿卜素分子中的碳骨架是由8個(gè)異戊二烯單位連接而成的，是四萜類化合物。它的分子中有一個(gè)較長的-共軛體系，能吸收不同波長的可見光，因而，呈現(xiàn)一定的顏色，-胡蘿卜素是黃色物質(zhì)，所以，又叫做多烯色素。 -胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)式如下：胡蘿卜素是最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)多烯色素。后來，又發(fā)現(xiàn)了許多在結(jié)構(gòu)上與胡蘿卜素類似的色素，于是就把這類物質(zhì)叫做胡蘿卜色素類化合物，或者叫做類胡蘿卜素。這類化合物大都難溶于水，易溶于弱極性或非極性的有機(jī)溶劑，因此又把這類物質(zhì)叫做脂溶性色素。胡蘿卜素是一種天然的食

6、物色素，主要存在于深色蔬菜，綠色、紅色、深綠色的蔬菜中和黃色的， 橘色的水果(如胡蘿卜、菠菜、生菜、馬鈴薯、 番薯、 西蘭花、哈蜜瓜和冬瓜 )等有色植物中。胡蘿卜素與維生素A結(jié)構(gòu)相近，活性較高的有、胡蘿卜素，其中胡蘿卜素活性最高。胡蘿卜素是一種脂溶性色素，脂肪有助于它被人體的吸收。胡蘿卜素的主要作用是：1它是高效的維生素a源，在體內(nèi)，根據(jù)體內(nèi)維生素A量的多少，胡蘿卜素可自動(dòng)分解而補(bǔ)充維生素A的不足。而且，胡蘿卜素食一種十分安全的維生素A原，可較多地貯存在肝臟內(nèi)，根據(jù)人體內(nèi)維生素A的水平，胡蘿卜素可自動(dòng)逐步轉(zhuǎn)化為維生素A，不會(huì)由于維生素A過量而中毒。2對(duì)體內(nèi)氧自由基的清除作用。氧自由基是引起腫瘤

7、、衰老、 心血管疾病的主要原因之一。天然胡蘿卜素的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使它充當(dāng)了體內(nèi)氧自由基的“清道夫 ”，從而起到防癌、抗衰老的重要作用。3免疫保護(hù)作用 ,天然胡蘿卜素可提高體內(nèi)各種免疫淋巴細(xì)胞的數(shù)量和增殖反應(yīng)能力 ， 增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用和中性細(xì)胞的吞噬作用，從而鞏固了人體的防御體系，起到祛病防身的作用。胡蘿卜素用途十分廣泛 ,在醫(yī)藥方面具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老提高免疫力等作用; 在食品和飲料添加劑方面更是一種非常重要的天然色素, 是世界公認(rèn)的優(yōu)秀有營養(yǎng)的添加劑; 在化妝品領(lǐng)域, 其優(yōu)良的著色性能使口紅、胭脂色澤自然豐滿, 又能起到營養(yǎng)和保護(hù)皮膚作用 ; 在飼料中添加可使畜禽強(qiáng)壯,

8、排卵和受孕能力加強(qiáng) 。 -胡蘿卜素的分子式均為C40 H56 ， 分子量為536.85，熔點(diǎn)184，深紅紫至暗紅色有光澤的斜6面體或板狀微結(jié)晶的晶體或晶性粉末。-胡蘿卜素具有兩邊反向?qū)ΨQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)中包含兩個(gè) -紫羅酮環(huán)和四個(gè)異戊二烯。本實(shí)驗(yàn)的-胡蘿卜素是全反式 -胡蘿卜素。-胡蘿卜素是不飽和碳?xì)浠衔铮y溶于甲醇、乙醇，可溶于乙醚、石油醚、正已烷、丙酮，易溶于氯仿、二硫化碳、苯等有機(jī)溶劑。根據(jù)上面的性質(zhì)，胡蘿卜素常用的提取方法有：有機(jī)溶劑提取液法 ，酶反應(yīng)法， 微波輔助提取法，超聲波輔助提取法，超臨界流體萃取法等。本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑提取法，故可利用石油醚 、丙酮、無水甲醇、乙酸乙酯和

9、無水乙醇等弱極性溶劑作為提取劑將它們從植物材料中浸提出來。然后，根據(jù)它們對(duì)吸附劑吸附能力的差異，用柱色譜進(jìn)行分離，用薄層色譜檢測(cè)分離效果。本實(shí)驗(yàn)采用的是以丙酮有機(jī)溶劑萃取類胡蘿卜素，以石油醚為洗脫劑，柱內(nèi)填充為硅膠進(jìn)行柱色譜分離，然后在以（1：9）丙酮一石油醚溶液為展開劑進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)分離效果。三、儀器和試劑儀器三角瓶（50ml）、分液漏斗（150ml）、蒸餾瓶（ 50ml）、普通蒸餾裝置（或減壓蒸餾裝置）、漏斗、色譜柱、硅膠薄層板、量筒、燒杯、層析缸。試劑胡蘿卜、丙酮、石油醚 （bp3060）、硅膠（層析用，200300目）、無水硫酸鈉、石油醚（ bp6090）、丙酮：石油醚（1：9）（V

10、/V）。四、實(shí)驗(yàn)裝置圖五、實(shí)驗(yàn)步驟1、含胡蘿卜素石油醚溶液的制備將新鮮胡蘿卜洗凈、擦干 ,切去尾部，切碎。稱取碎鮮胡蘿卜10g于小研缽中 ,研碎。碎胡蘿卜移至50mL三角燒瓶中，每次用丙酮10mL萃取2次，再用石油醚（bp3060）萃取固體兩次，每次10mL。把石油醚溶液加到丙酮液中。在分液漏斗中將混合液與50mL飽和氯化鈉溶液振蕩，分去下層，用蒸餾水洗滌上層液兩次，每次50mL，分去水，用無水硫酸鈉干燥石油醚液（約1h）,把混合液倒入50mL圓底燒瓶中，熱水浴加熱蒸餾，除去溶劑，得固體。在制得的固體物加入3mL石油醚（bp6090 ）拌硅膠1g，在通風(fēng)櫥內(nèi)抽干，得黃色硅膠顆粒，待上柱。2、裝

11、柱和分離(裝置如圖1)取20cm*1cm色譜柱一根，垂直裝置，以50ml三角燒瓶作洗脫液的接受器。用鑷子取少許脫脂棉放于干凈的色譜柱底部，輕輕塞緊， 再在脫脂綿上蓋一層厚0.5cm的海石砂 （或用一張比柱內(nèi)徑略小的濾紙代替），關(guān)閉活塞，向柱內(nèi)倒入石油醚（bp6090）至約為柱高的34處，打開活塞，控制流出速度為1滴 /s。通過一干燥的玻璃漏斗慢慢加入層析硅膠。用洗耳球輕輕敲打柱身，使填裝緊密。當(dāng)裝填到3/4時(shí)，再在上面加一層0.5cm厚的海石砂，操作時(shí)一直保持上述流速，注意不能使液面低于砂子的上層。當(dāng)液面流至離海石砂面1cm時(shí)，立即從玻璃漏斗加入已制備好的含胡蘿卜素的黃色硅膠，隨后用0.5ml

12、石油醚洗下管壁的硅膠，如此連續(xù)23次，直至洗凈為止，然后在色譜柱上裝上滴液漏斗，用石油醚（bp6090）作洗脫劑進(jìn)行洗脫，洗1滴/s 。當(dāng)有一黃色的譜帶分出，待黃色組分絕大部分洗出時(shí)，把洗脫劑換成1：9丙酮一石油醚（bp6090）混液作洗脫劑進(jìn)行洗脫，控制流出速度如前（這混液洗脫劑有助于混合物中極性較大的組分移動(dòng)） ，又可分出兩個(gè)黃色組分。在45 90min內(nèi)，柱中物料將全部洗脫出來。觀察這些物料通過柱子的移動(dòng)情況。在三角燒瓶中收集3份洗出液。用紙色譜、薄層色譜對(duì)各段洗出液進(jìn)行色譜分析。3. 薄層色譜法樣品：柱色譜法中洗脫出的份樣品液展開劑：1：9丙酮一石油醚溶液薄層板的制備：取3片載波體，洗

13、凈，晾干。在50ml燒杯中放置3g硅膠G，逐漸加入0.5%cmC水溶液8ml，調(diào)成均勻的糊狀，將此糊狀物傾于上述潔凈的載玻片圣桑， 用手將帶漿的載玻片在水平的桌面上做上下輕微的顫動(dòng)，并不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)方向，制成厚薄均勻，表面光潔的平整的薄層板，然后放在水平桌面上 ， 在室溫放置晾干后放入烘箱中，緩慢升溫至110，恒溫0.5h，取出，稍冷后置干燥器中備用。點(diǎn)樣：取出上述制好的薄層板，分別在距一端點(diǎn)1cm處用鉛筆輕輕劃一橫線作為起始線。用毛細(xì)管吸取少量樣品液，在一塊板的起點(diǎn)線上點(diǎn)第一個(gè)色帶的樣品液，根據(jù)柱色譜分離的色帶，依次點(diǎn)樣，如果樣點(diǎn)顏色較淺，可重復(fù)點(diǎn)樣，重復(fù)點(diǎn)樣前必須待前次樣點(diǎn)揮干后進(jìn)行。樣點(diǎn)直徑不

14、超過2mm。展開：待樣點(diǎn)干燥后，小心地放入已加入展開劑的250ml廣口瓶中進(jìn)行展開。在瓶的內(nèi)壁貼一張高5cm，環(huán)繞周長4/5的濾紙，下面浸入展開劑中，以使容器內(nèi)被展開劑蒸氣飽和。點(diǎn)樣一端浸入展開劑0.5cm（樣點(diǎn)不浸泡在展開劑中）。蓋好瓶塞，觀察展開劑前沿上升離板的上端1cm處取出，盡快用鉛筆在展開劑上升的前沿處劃一記號(hào)，晾干后，量出展開劑和樣點(diǎn)移動(dòng)的距離，計(jì)算Rf值。六、注意事項(xiàng)1、本實(shí)驗(yàn)采取的工藝不同于其他工藝，體現(xiàn)在原料粉碎時(shí)加入了穩(wěn)定劑（ 5ml氨水和35ml乙醇）來防止胡蘿卜素被氧化，由此可提高提取率。2、色譜柱填裝緊密與否，對(duì)分離效果很有影響。若柱中留有氣泡或各部分松緊不勻（更不能

15、有斷層或暗溝）時(shí)，會(huì)影響滲濾速度和顯色的均勻。但如果填裝時(shí)過分敲擊，又會(huì)因太緊密而流速太慢。3、加入砂子的目的是。在加料是不致把吸附劑沖起，影響分離效果。4、為了保持色譜柱的均一性，使整個(gè)吸附劑浸泡在溶液或溶液中是必要的。否則當(dāng)柱中溶液流干是。柱身干裂，影響滲濾和顯色的均一性。5、若不用滴液漏斗，也可用每次倒入10ml洗脫劑的方法進(jìn)行洗脫。6、載玻片上涂層要均勻，既不應(yīng)有紋路、帶團(tuán)粒，也不應(yīng)有能看到玻璃的薄涂料點(diǎn)。7、點(diǎn)樣用的毛細(xì)管必須專用，不得弄混。8、點(diǎn)樣時(shí)，使毛細(xì)管液面剛好接觸到薄層（濾紙）既可，均勻點(diǎn)樣過重而使薄層破壞。七、參考文獻(xiàn)（1.） 姜文候，單志萍等，-胡蘿卜素的應(yīng)用、市場(chǎng)和天然型產(chǎn)品的發(fā)酵法生產(chǎn)，食品與發(fā)酵工業(yè)，1994.3，P6561（2.）&