臨床病原體檢測

1、臨床病原體檢測云南省第一人民醫(yī)院云南省第一人民醫(yī)院 毛小琴毛小琴 教學(xué)目的要求教學(xué)目的要求o了解細菌耐藥的產(chǎn)生機制o熟悉臨床感染常見的病原體檢測方法o掌握臨床常見病原體的標(biāo)本采集和運送 主要教學(xué)內(nèi)容主要教學(xué)內(nèi)容o感染的變遷及當(dāng)前感染的情況o細菌的耐藥性及耐藥機理o臨床關(guān)注的耐藥菌的監(jiān)測報o臨床標(biāo)本采集注意事項及細菌培養(yǎng)的報告制度感染的變遷及當(dāng)前感染的情況o疾病譜的變遷（G染色陽性菌為主G染色陰性菌為主）o新傳染病的陸續(xù)出現(xiàn)（如：嗜肺軍團菌，SARS冠狀病毒）o一些已絕跡的老傳染病死灰復(fù)燃（如：梅毒、結(jié)核等）o多重耐藥株的出現(xiàn)o醫(yī)院感染及條件致病菌感染的增加一、臨床常見病原體的檢測方法o直接涂片

2、顯微鏡檢查（最簡單、快速、直觀）o 病原微生物的分離培養(yǎng)與鑒定（確診方法）o 病原體特異性抗原或抗體檢測（如：沙門氏菌屬的血清血清凝集、肥達試驗等）o 分子生物學(xué)方法（如：基因探針技術(shù)和PCR技術(shù)）o 其他方法（如：動物接種和細胞培養(yǎng)法-主要用于病毒等） 二、細菌的耐藥性及耐藥機制o耐藥菌株的現(xiàn)狀o耐藥機制耐藥機制（包括遺傳機制和理化機制）l遺傳機制 -固有耐藥性（與生俱來） 生物基礎(chǔ)是什么？（缺乏抗生素的作用位點；缺乏抗生素的轉(zhuǎn)運機制；具有耐藥基因；具有天然屏障） -獲得性耐藥（后天獲得） 主要途徑有哪些？（自身突變和基因交換）l理化機制理化機制（重點） -滅活酶或鈍化酶的產(chǎn)生 -藥物作用靶

3、位的改變 -膜通透性改變 -主動外排作用 -存在抗生素抑制旁路 -生物被膜的屏障作用 -缺乏藥物的轉(zhuǎn)運機制-舉例ESBLs,MRSA,Pae抗菌藥物修飾酶通透屏障外排機制靶位改變其他b-內(nèi)酰胺類+牽制機制氯霉素+紅霉素+林可霉素+氨基糖苷類+四環(huán)素+氟喹諾酮類+萬古霉素+磺胺類+旁路途徑利福平+ 表1 部分抗菌藥物耐藥的生化機制 三、常見耐藥菌的監(jiān)測o目的和意義 -指導(dǎo)臨床用藥，預(yù)測抗菌治療的效果，更合理地選擇抗生素。 -細菌耐藥性監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查 -耐藥機制研究的重要手段直接目的o耐藥性檢測的方法耐藥性檢測的方法 -紙片擴散法（定性檢測） 如：最常用的KB法 -稀釋法（定量檢測） 如：瓊脂

4、稀釋法、微量肉湯稀釋法 -E-test法（定量檢測） 此為結(jié)合稀釋法和擴散法原理和特點而設(shè)計的一種簡便、精確的測定MIC的方法。缺點：價格昂貴。o幾個重要的概念幾個重要的概念l藥物敏感性試驗簡稱藥敏試驗，是指檢測細菌對抗菌藥物的敏感性（或耐藥性）的一種體外試驗。 警告：體外試驗結(jié)果與體內(nèi)效果不一定一致。lMIC：最低抑菌濃度，即抑制細菌生長所需要的最低藥物濃度。lMIC90：抑制90%試驗菌株生長所需要的最低藥物濃度。lMIC50：抑制50%試驗菌株生長所需要的最低藥物濃度。l敏感（susceptible,S) -指用常規(guī)劑量的抗菌藥物在體內(nèi)能夠達到的濃度可以治愈細菌引起的感染，禁忌證除外。l

5、中介（intermediate,I) -指抗菌藥物對試驗菌株的MIC值可接近血和組織中可達到的藥物濃度，但抑菌速率低于敏感株。l耐藥（resistant,R) -指允許的最大劑量的抗菌藥物在組織或血液中的濃度仍達不到抑菌目的。o臨床常見耐藥菌的監(jiān)測l耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的篩選測定 -是目前導(dǎo)致醫(yī)院感染的重要病原菌 -定義和判讀標(biāo)準(zhǔn)：l超廣譜b-內(nèi)酰胺酶（ESBL）檢測 -目前只用于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和奇異變形桿菌。 -判讀方法及標(biāo)準(zhǔn)（按CLSI-2010執(zhí)行） -ESBL陽性菌株的藥敏結(jié)果處置 青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南都需報告為耐藥，無論體外藥敏結(jié)果是敏

6、感還是耐藥！l高水平氨基糖苷類藥物耐藥（HLAR）和萬古霉素耐藥腸球菌的篩選 -目的和意義：判斷聯(lián)合用藥的可行性和效果 -測試藥物：GN、鏈霉素、萬古霉素（必須用稀釋法測MIC值） -檢測方法：紙片擴散法（臨床實驗室最常用）、稀釋法（包括瓊脂法和肉湯法）、E-test法 -結(jié)果處置：若為耐藥，則氨基糖苷類抗生素與作用于細胞壁合成藥物（如：青霉素類和萬古霉素）聯(lián)合不出現(xiàn)協(xié)同。l耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）的篩選測定 -目的和意義：早期及時篩選出此類肺炎鏈球菌，指導(dǎo)臨床合理用藥。 -篩選方法：1ug苯唑青霉素紙片篩選 -判斷方法：若抑菌圈20mm，則測試菌對青霉素G敏感；若抑菌圈19mm，則提示

7、該菌對青霉素耐藥或中度敏感，需用稀釋法或E-test進一步測其MIC值。 四、臨床標(biāo)本采集和運送 （重點掌握）o血液標(biāo)本 -采血時機采血時機:盡可能在應(yīng)用抗菌藥物前采集。最好的時機是預(yù)計寒戰(zhàn)或體溫驟升之前。（關(guān)鍵?。P(guān)鍵！） -采集標(biāo)本數(shù)：建議采集兩次，最好三次，每次時間間隔大約1小時。 -血液量：成人10ml；兒童2-5ml；嬰幼兒和新生兒最多能取1-2ml。 -每次取血后注入兩個血培養(yǎng)瓶（即一個需氧瓶和一個厭氧瓶）。若沒有血培養(yǎng)瓶，則置于含有抗凝劑聚茴香腦磺酸鈉（SPS）的無菌瓶或試管中送檢。-皮膚消毒：靜脈穿刺前必須對穿刺部位用殺菌劑仔細消毒（非常重要?。?，并需等待皮膚上的消毒劑完全揮

8、發(fā)?？捎?%碘酊、10%皮維碘、70%酒精、含0.5%氯已定的70%酒精。 注意事項：l必須一人一針！l 如果病人在輸液，不能從輸液管中抽血做血培養(yǎng)！而是盡可能從遠離輸血部位處抽血。l 將血液用注射針刺入培養(yǎng)瓶前，必須先將培養(yǎng)瓶外蓋取下后用消毒劑消毒瓶蓋！注入后立即混勻！l 如果一次抽血要做多項檢查，必須先抽血培養(yǎng)的血（可直接注入血培養(yǎng)瓶）。 總原則：盡可能避免培養(yǎng)前標(biāo)本污染！總原則：盡可能避免培養(yǎng)前標(biāo)本污染！o腦脊液標(biāo)本 -采集：由內(nèi)科醫(yī)生進行腰穿或腦室穿刺。 -采集量：成人2-5ml；兒童2-5ml；嬰幼兒或新生兒1-2ml。 注意事項：l標(biāo)本必須置于無菌試管中l(wèi)標(biāo)本需立即保溫送檢或床邊接

9、種o尿液標(biāo)本 -無菌操作（需用帶蓋的無菌容器?。?-培養(yǎng)用尿液需留中段尿 -采集前清洗外陰（尤其是女性和兒童?。?方法：先清潔手后用無菌紗布和溫肥皂水從前到后清洗外陰。注意：不要用消毒劑！ -女性需避開月經(jīng)期 -對于厭氧菌培養(yǎng)，采用膀胱穿刺法收集、無菌厭氧小瓶運送。 -盡快送檢，最多不迢過1小時！o上呼吸道標(biāo)本 -理論上，標(biāo)本采集應(yīng)由專業(yè)醫(yī)師或受過專門訓(xùn)練的人完成。 -方法：病人面對光源，用壓舌板將舌下壓，用無菌棉拭子用力擦拭兩側(cè)扁桃體、咽后壁和其他發(fā)炎的區(qū)域。 注意事項：l不能拭及舌和頰粘膜l最好用兩個拭子擦拭同一區(qū)域，一個用于涂片檢查，另一個用于微生物培養(yǎng)。o下呼吸道標(biāo)本 -方法：采集前清

10、潔口腔，再用力咳嗽、收集深部痰；也可由醫(yī)生采集支氣管灌洗液或支氣管刷片送檢。 注意事項：l標(biāo)本需收集在無菌、帶蓋的容器（有商品化產(chǎn)品）l不要混入唾液！l采樣前清潔口腔l采集高質(zhì)量的痰液標(biāo)本，是一種技術(shù)！不容忽視！ o泌尿生殖道標(biāo)本 -尿道標(biāo)本：將細徑的棉拭子或無菌接種環(huán)伸入尿道3-4cm，輕輕旋轉(zhuǎn)后取出，膿性分泌物可直接收集在棉拭子或接種環(huán)上。 -肛門直腸標(biāo)本：需將拭子伸入到肛門內(nèi)4-5cm采集。 -前列腺液標(biāo)本：按摩后取 -女性生殖道標(biāo)本：都應(yīng)在用窺器行盆腔檢查時采集。按不同檢查項目要求取相應(yīng)標(biāo)本（由專業(yè)醫(yī)生取樣）o糞便標(biāo)本 -采集時間：最好在腹瀉早期、病原體量大時、應(yīng)用抗菌藥物前采集。 注

11、意事項：l應(yīng)采集早晨的標(biāo)本，以中午之前送至實驗室（送檢時間不迢過2h,否則用專用運送培養(yǎng)基送檢）。l成形便為不合格標(biāo)本l霍亂或其他弧菌檢查用堿性蛋白胨水培養(yǎng)基送檢l最好采集新鮮糞便為標(biāo)本 l標(biāo)本最少5g，最好采集帶血、粘液或膿液的部分，避免混有尿液。l選擇帶防漏蓋的適當(dāng)容器l當(dāng)沒有糞便排出但又必須檢查或運送所需時間較長時可采用直腸拭子標(biāo)本o膿性滲出物、創(chuàng)傷和膿腫標(biāo)本 -膿腫：用注射器和穿刺針盡可能多地抽吸膿液，無菌操作將膿液轉(zhuǎn)入無菌容器中。如果沒有無菌容器，可暫時保存在注射器中，蓋上針帽送到實驗室。（特殊部位，如眼部，可用棉拭子采集） -撕裂傷、貫通傷、術(shù)后創(chuàng)面、燒傷和褥瘡潰瘍的感染：目前尚無采集這些創(chuàng)面標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)程序，但應(yīng)當(dāng)遵循一些基本原則(選擇膿腔表面、已失活組織