實(shí)驗(yàn)三、細(xì)菌的生化鑒定

1、常用細(xì)菌鑒定技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握細(xì)菌的基本鑒定技術(shù)細(xì)菌的基本鑒定技術(shù) 生化反應(yīng)鑒定：通過(guò)觀察細(xì)菌利用酶和降解糖類、醇類、脂類、蛋白質(zhì)和氨基酸的能力可以了解其生化活性，從而識(shí)別和鑒定細(xì)菌。 免疫學(xué)鑒定（血清學(xué)鑒定） 編碼鑒定實(shí)驗(yàn)內(nèi)容生化反應(yīng)鑒定（每2人一組）： 1、糖（苷、醇）利用試驗(yàn)：乳糖分解利用試驗(yàn) 2、氧化酶試驗(yàn) 3、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 4、克氏雙糖鐵（KIA） 5、半固體（M）（這個(gè)實(shí)驗(yàn)已做過(guò)，本次不做） 6、吲哚試驗(yàn)（I） 7、尿酶試驗(yàn)（U）一、糖（苷、醇）利用試驗(yàn)：乳糖分解利用試驗(yàn) 【原理】 不同的細(xì)菌對(duì)不同的糖（苷、醇）的分解能力不同，有的分解，有的不能分解，有的分解后能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的分

2、解后僅能產(chǎn)酸，因此可以用來(lái)鑒別細(xì)菌。 以乳糖分解利用為例，乳糖發(fā)酵管中含溴甲酚紫指示劑，當(dāng)細(xì)菌分解乳糖產(chǎn)酸，培養(yǎng)基pH下降，指示劑變黃色，不分解乳糖的指示劑不變色。乳糖分解利用試驗(yàn) 菌種：大腸桿菌、變形桿菌 培養(yǎng)基：乳糖發(fā)酵管 方法： 1、取2支乳糖發(fā)酵管，用記號(hào)筆分別標(biāo)記大腸桿菌和變形桿菌。 2、按細(xì)菌的液體接種法，將大腸桿菌和變形桿菌分別接種到乳糖發(fā)酵管中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824h。乳糖分解利用試驗(yàn) 結(jié)果觀察 乳糖發(fā)酵管中含溴甲酚紫指示劑，當(dāng) pH值6.8時(shí)呈紫色，pH值5.2時(shí)呈黃色，當(dāng)細(xì)菌分解利用乳糖，產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基的pH值變小，呈黃色。如細(xì)菌不能分解乳糖，則乳糖發(fā)酵管仍為紫色。 接

3、種大腸桿菌的乳糖發(fā)酵管變?yōu)辄S色，接種變形桿菌的乳糖發(fā)酵管仍是紫色。說(shuō)明大腸桿菌能夠分解乳糖，變形桿菌不能分解乳糖。 乳糖發(fā)酵管中如果有小導(dǎo)管，還可以觀察產(chǎn)氣情況。大腸桿菌能夠分解利用乳糖，產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，小導(dǎo)管中有氣泡產(chǎn)生。氧化酶試驗(yàn) 【原理】 氧化酶又稱細(xì)胞色素氧化酶，能將還原型細(xì)胞色素C氧化形成水和氧化型細(xì)胞色素C，氧化型細(xì)胞色素C再使四甲基對(duì)苯二胺氧化，形成顯色反應(yīng)。氧化酶試驗(yàn) 【試劑與器材】 1菌種 大腸埃希菌、銅綠假單胞菌 2試劑 氧化酶試劑（1%四甲基對(duì)苯二胺） 3器材 2cm2cm濾紙片、污物缸氧化酶試驗(yàn) 【操作步驟】 1將濾紙片疊成四方塊狀。 2用濾紙片的中心尖角小心刮取大腸埃希菌

4、菌落，注意不可碰到培養(yǎng)基。 3輕輕展開濾紙片，刮取的菌落正好在濾紙片中心，滴加一滴1%四甲基對(duì)苯二胺。 4立刻觀察菌落顏色的變化。 5同法做銅綠假單胞菌的氧化酶試驗(yàn)。氧化酶試驗(yàn) 【結(jié)果】 滴加氧化酶試劑后銅綠假單胞菌立刻變?yōu)樽仙?，為氧化酶?yáng)性。大腸埃希菌不變色，為氧化酶陰性。 氧化酶試驗(yàn)（左側(cè)為銅綠假單胞菌、右側(cè)為大腸埃希菌）氧化酶試驗(yàn) 【注意事項(xiàng)】 1實(shí)驗(yàn)中的菌種要求新培養(yǎng)的，不宜用陳舊的培養(yǎng)物。 2刮取細(xì)菌時(shí)不可碰到培養(yǎng)基，不可用接種環(huán)等金屬物品取菌。 3氧化酶試劑要新鮮配制，一般裝在棕色瓶中，放在冰箱中可保存一周，時(shí)間長(zhǎng)了易被空氣氧化變色。 4結(jié)果要立刻觀察，1min內(nèi)變色者為陽(yáng)性，超過(guò)

5、1min變色的為陰性。 5在濾紙片上滴加試劑時(shí)不要過(guò)多，以剛潤(rùn)濕紙片為宜，如濾紙片過(guò)濕，可能妨礙空氣與細(xì)菌接觸，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，造成假陰性。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 【原理】 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)又稱觸酶試驗(yàn)。部分細(xì)菌含有黃素蛋白，在代謝過(guò)程中與空氣中的氧發(fā)生反應(yīng)，形成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)菌有毒害作用，會(huì)破壞細(xì)胞組分，因此，細(xì)菌為保護(hù)自己，通常具有過(guò)氧化氫酶，可以催化裂解過(guò)氧化氫，形成水和氧氣。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 【試劑與器材】 1、菌種 金黃色葡萄球菌 2、試劑 3%過(guò)氧化氫 3、器材 載玻片、無(wú)菌移液器吸頭、酒精燈、火柴、超凈工作臺(tái)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 【操作步驟】 1、在載玻片中央滴加一滴3%過(guò)氧化氫。 2、用無(wú)

6、菌移液器吸頭蘸取少量細(xì)菌，在3%過(guò)氧化氫中混勻。 【結(jié)果】 觀察氣泡的產(chǎn)生情況。可以看見在吸頭上金黃色葡萄球菌菌苔周圍，產(chǎn)生大量氣泡，為過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。如果菌苔周圍無(wú)氣泡產(chǎn)生，為過(guò)氧化氫酶陰性。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 【注意事項(xiàng)】 1、普通金屬接種環(huán)可能與過(guò)氧化氫反應(yīng)，形成氣泡，造成假陽(yáng)性，因此必須使用鉑絲接種環(huán)或塑料、玻璃材質(zhì)的工具。 2、從血液瓊脂平板上挑取菌落時(shí)千萬(wàn)小心，不要碰到培養(yǎng)基，因紅細(xì)胞中有過(guò)氧化氫酶，即使一點(diǎn)點(diǎn)也會(huì)造成假陽(yáng)性。 3、過(guò)氧化氫試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。克氏雙糖鐵（KIA） 原理：克氏雙糖鐵（KIA)主要用于革蘭陰性桿菌的鑒別，分解乳糖的細(xì)菌斜面為黃色，分解葡萄糖的細(xì)菌底層為黃色，產(chǎn)生

7、硫化氫的細(xì)菌培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色。此外還可以觀察細(xì)菌分解葡萄糖是否產(chǎn)氣?？耸想p糖鐵（KIA） 【試劑與器材】 1、菌種 大腸埃希菌、變形桿菌 2、器材 克氏雙糖鐵（KIA）、接種針、酒精燈、火柴、記號(hào)筆、試管架、37恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)。 【操作步驟】 1取2支克氏雙糖鐵（KIA），用記號(hào)筆分別標(biāo)記大腸埃希菌、變形桿菌。 2按細(xì)菌的斜面接種法，將大腸埃希菌、變形桿菌分別接種到相應(yīng)的管中。 3放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1824h?？耸想p糖鐵（KIA） 結(jié)果觀察：觀察上部和下部的顏色變化，變黃為產(chǎn)酸，變紅為產(chǎn)堿，有氣泡為產(chǎn)氣，有黑色為產(chǎn)硫化氫。 大腸桿菌結(jié)果：A/A,產(chǎn)氣 變形桿菌結(jié)果：K/A,產(chǎn)大量硫化氫。

8、吲哚試驗(yàn)【原理】 吲哚試驗(yàn)又稱靛基質(zhì)試驗(yàn)。某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚、丙酮酸、氨。加入吲哚試劑對(duì)二甲基氨基苯甲醛，與吲哚結(jié)合，形成玫瑰色的吲哚化合物。吲哚試驗(yàn) 【試劑與器材】 1菌種 大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌 2試劑 吲哚試劑（對(duì)二甲基氨基苯甲醛1g，95%乙醇95ml，濃鹽酸20ml配制） 3器材 蛋白胨水培養(yǎng)基、接種針或接種環(huán)、酒精燈、火柴、記號(hào)筆、試管架、37恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)。吲哚試驗(yàn) 【操作步驟】 1取2支蛋白胨水培養(yǎng)基，用記號(hào)筆分別標(biāo)記大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。 2按液體接種法，將2菌分別接種于蛋白胨水中。 3置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h，取出

9、，分別滴加23滴吲哚試劑，輕搖試管，試劑浮于液面，觀察顏色變化。吲哚試驗(yàn) 【結(jié)果】 接種大腸埃希菌的試驗(yàn)管中，吲哚試劑變成玫瑰紅色，為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性。接種產(chǎn)氣腸桿菌的試驗(yàn)管中，吲哚試劑不變色，為吲哚試驗(yàn)陰性。尿酶試驗(yàn)（U） 【原理】 某些細(xì)菌可以產(chǎn)生尿酶來(lái)水解尿素，可以利用含有尿素的培養(yǎng)基和pH指示劑（如酚紅）來(lái)檢測(cè)。尿素被尿酶水解，產(chǎn)生氨、二氧化碳、水，使培養(yǎng)基變堿，酚紅變?yōu)樯罘奂t色。尿酶試驗(yàn)（U） 【試劑與器材】 1、菌種 大腸埃希菌、普通變形桿菌 2、器材 尿素培養(yǎng)基、接種針或接種環(huán)、酒精燈、火柴、記號(hào)筆、試管架、37恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)。尿酶試驗(yàn)（U） 【操作步驟】 1、取2支尿素培養(yǎng)基，用記號(hào)筆分別標(biāo)記大腸埃希菌和普通變形桿菌。 2、按液體接種法，將2菌分別接種于尿素培養(yǎng)基中。 3、置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h，取出，觀察顏色變化。尿酶試驗(yàn)（U） 【結(jié)果】 接種大腸埃希菌的試驗(yàn)管為黃色，說(shuō)明大腸埃希菌不產(chǎn)生尿酶，尿酶試驗(yàn)陰性。接種普通變形桿菌的試驗(yàn)管變?yōu)樯罘奂t色，說(shuō)明普通變形桿菌能產(chǎn)生尿酶，分解尿素，尿酶試驗(yàn)陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容生化反應(yīng)鑒定（每2人一組）： 1、糖（苷、醇）利