2020年中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識(shí)(全文版)

1、2020年中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識(shí)（全文版）背景病原學(xué)診斷始終是感染性疾病診斷中最重要的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷是臨床醫(yī)師根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)做出一系列鑒別診斷，然后針對(duì)這些進(jìn) 行檢測(cè)，通常一項(xiàng)檢測(cè)只能對(duì)應(yīng)一種病原體，而宏基因組學(xué)第二代測(cè)序 （metage no mics n ext gen eratio n seque ncing,以下簡(jiǎn)稱二代測(cè)序）技術(shù)檢測(cè)能覆蓋更廣范圍的病原體。本專家共識(shí)就二代測(cè)序的臨床應(yīng)用范圍、 樣本采集、分析解讀和診斷效能等方面進(jìn)行證據(jù)總結(jié)和意見(jiàn)推薦。一、證據(jù)強(qiáng)度和證據(jù)質(zhì)量的分級(jí)定義證據(jù)強(qiáng)度：A為強(qiáng)烈推薦；B為推薦，但其他替代方案也可接

2、受；C為推薦強(qiáng)度低，尋求替代方案；D為從不推薦。證據(jù)質(zhì)量：1為證據(jù)來(lái)自隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，U為證據(jù)來(lái)自非隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，川為證據(jù)僅來(lái)自專家意見(jiàn)。二、二代測(cè)序的臨床需求與應(yīng)用范圍（一）背景及概述推薦意見(jiàn)1:若懷疑細(xì)菌、真菌、DNA病毒、寄生蟲(chóng)、不典型病原體感染且需進(jìn) 行二代測(cè)序檢測(cè)時(shí)，建議采用 DNA檢測(cè)；若懷疑RNA病毒感染時(shí)，則 建議采用RNA檢測(cè)（A , n ）。推薦意見(jiàn)2 :對(duì)于臨床疑似感染的病重、病?；蛎庖咭种啤⒚庖呷毕莼颊?，建議在 完善傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室及分子生物學(xué)檢測(cè)的同時(shí)，采集疑似感染部位的標(biāo)本進(jìn)行 二代測(cè)序（B，n ） o二代測(cè)序檢測(cè)能覆蓋較大范圍的病原體，病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)都能被同時(shí)檢

3、測(cè)，不論臨床樣本培養(yǎng)成功與否， 只要含有可檢測(cè)到的 DNA 或RNA即可。從接收樣本至完成數(shù)據(jù)分析，二代測(cè)序的周轉(zhuǎn)時(shí)間根據(jù)測(cè) 序技術(shù)、方法和生物信息學(xué)分析方法的不同而不同，已有報(bào)道為6 h至7 d不等（平均48 h） o二代測(cè)序在感染性疾病診斷領(lǐng)域中的優(yōu)勢(shì)在于其能檢測(cè)到其他傳統(tǒng)手段無(wú)法檢測(cè)到的病原體。因此，二代測(cè)序可能在應(yīng)用于臨床疑難雜癥或 免疫抑制患者時(shí)有更大意義。 另外，二代測(cè)序也被報(bào)道可用于"排除"檢測(cè), 即檢測(cè)陰性有助于排除感染性疾病的診斷，但前提條件是測(cè)序覆蓋度足夠 高，能確保樣本中存在的病原微生物被檢測(cè)出來(lái)。二代測(cè)序的其他潛在應(yīng) 用還包括病原體的耐藥基因檢測(cè)、醫(yī)

4、院感染控制的監(jiān)測(cè)，以及社區(qū)傳染性 疾病暴發(fā)的監(jiān)測(cè)，但這些應(yīng)用通常需要極高的覆蓋深度。從傳統(tǒng)培養(yǎng)轉(zhuǎn)向分子生物學(xué)診斷需要臨床醫(yī)師及臨床微生物學(xué)家的 思維轉(zhuǎn)變。傳統(tǒng)的微生物學(xué)是建立在體外分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，而實(shí)際上許 多環(huán)境中或人體的致病微生物難以被培養(yǎng)，或許只能通過(guò)二代測(cè)序才能被 發(fā)現(xiàn)。所以臨床醫(yī)師及臨床微生物學(xué)家很有必要熟悉這個(gè)新工具，知曉其 優(yōu)勢(shì)和局限性。目前，尚鮮見(jiàn)針對(duì)二代測(cè)序結(jié)果解讀的規(guī)范，包括序列數(shù)閾值，以及 靈敏性、特異性評(píng)估的統(tǒng)一臨床標(biāo)準(zhǔn)等。就像所有其他新技術(shù)，在解釋數(shù) 據(jù)和報(bào)告數(shù)據(jù)方面仍有很大的困難與挑戰(zhàn)。如能進(jìn)一步規(guī)范二代測(cè)序在臨 床感染性疾病中的應(yīng)用，就可給予臨床實(shí)踐非常重要的線

5、索和信息，協(xié)助 臨床診斷。（二）二代測(cè)序的適用范圍1 .二代測(cè)序在臨床疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的適用范圍推薦意見(jiàn)3 :對(duì)于懷疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性感染的患者，如有條件，推薦在抽取腦脊 液時(shí)同步留取2 mL腦脊液標(biāo)本保存于1620 C冰箱。在完成常規(guī)生 物化學(xué)檢查和培養(yǎng)之后，若 3 d內(nèi)未獲得明確的病原學(xué)依據(jù)且經(jīng)驗(yàn)性抗感 染治療無(wú)效，推薦對(duì)留存的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)。若未留存標(biāo)本，可重新采集標(biāo)本（A，n）。推薦意見(jiàn)4:對(duì)于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的患者，如有條件，推薦在抽取腦脊 液時(shí)同步留取2 mL腦脊液標(biāo)本保存于1620 C冰箱。在傳統(tǒng)PCR分 子檢測(cè)（包括多重探針?lè)肿覲CR方法）后若未能獲得

6、明確的病原學(xué)依據(jù)，推薦對(duì)留存的腦脊液標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)。若未留存標(biāo)本，可重新采集標(biāo) 本（A，n）0推薦意見(jiàn)5 :對(duì)于慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及需要隨訪病原學(xué)證據(jù)的患者，可首選二代測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)（A，n）0中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查包括以下一種或多種：發(fā)熱（體溫38 C）、頭痛、腦膜刺激征、嘔吐、抽搐、局灶性神經(jīng)功能障礙、意識(shí)改變或嗜睡、腦脊液中白細(xì)胞數(shù)量增加、腦脊液中蛋白質(zhì)水平升高和（或）葡萄糖水平降低、腦成像顯示感染的改變。目前，在常見(jiàn)病原體之外，二代測(cè)序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中已成功檢 測(cè)到多種新發(fā)及少見(jiàn)病原體，如羊布魯菌、星狀病毒、熱帶假絲酵母、狒 狒巴拉姆希阿米巴等。對(duì)于慢性中樞神

7、經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，二代測(cè)序檢測(cè) 罕見(jiàn)、少見(jiàn)病原體的能力可顯著提高患者病原學(xué)確診的概率。在一項(xiàng)針對(duì) 結(jié)核性腦膜炎患者的隊(duì)列研究中，二代測(cè)序被證實(shí)可提高患者的病原體檢 出率。對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染進(jìn)展的臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，主要以臨床表現(xiàn)、腦脊 液常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和腦脊液培養(yǎng)為指導(dǎo)。在某些情況下的特異性免疫 試驗(yàn)如隱球菌乳膠凝集試驗(yàn)，可間接監(jiān)測(cè)病原體的載量情況。由于二代測(cè) 序可檢測(cè)病原體及其匹配的序列數(shù)，所以能直接并結(jié)合宿主內(nèi)標(biāo)背景值半 定量地顯示病原菌載量的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)于急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，在完成常規(guī)生物化學(xué)檢查和培養(yǎng) 之后，若仍未獲得明確的病原學(xué)依據(jù)，建議將二代測(cè)序作為二線首選檢測(cè) 手段。對(duì)于

8、疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的患者，在傳統(tǒng)PCR檢測(cè)后若未能 獲得明確的病原學(xué)依據(jù)，建議將二代測(cè)序作為二線首選檢測(cè)手段。對(duì)于慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及需要隨訪病原學(xué)證據(jù)的患者，可首選二代測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。2 .二代測(cè)序在臨床疑似血流感染中的適用范圍推薦意見(jiàn)6 :對(duì)于懷疑血流感染的患者，如有條件，推薦在抽取血培養(yǎng)標(biāo)本時(shí)同步留取2 mL血標(biāo)本，分離血漿后保存于1620 C冰箱，血培養(yǎng)3 d未報(bào)陽(yáng)且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無(wú)效時(shí)，推薦對(duì)留存血標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)。若未留存標(biāo)本，可重新采集標(biāo)本（A，n ） o推薦意見(jiàn)7 :對(duì)于懷疑繼發(fā)性血流感染的患者，在原發(fā)感染灶的病原學(xué)檢測(cè)為陰性或因各種因素?zé)o法送檢合適標(biāo)本的情況下，可

9、考慮將血標(biāo)本的二代測(cè)序檢測(cè)作為二線檢測(cè)方法（B，川）o血流感染包括各種病原微生物（包括細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)等）入侵血流所引起的感染。除單純性血流感染外，血流感染還包括感染性心內(nèi)膜炎、導(dǎo)管相關(guān)性血流感染等復(fù)雜性感染。血流感染可為原發(fā)性，亦可繼發(fā)于局灶性感染。應(yīng)注意的是，只要患者具有器官功能障礙且合并任何類 型的感染均可診斷為膿毒癥，因而膿毒癥患者并不一定存在血流感染。血流感染的典型癥狀主要為畏寒、寒戰(zhàn)、發(fā)熱和毒血癥的癥狀，此外 尚包括原發(fā)感染灶及遷徙性感染灶的臨床表現(xiàn)。部分血流感染患者還具有 某些危險(xiǎn)因素，包括近期的有創(chuàng)操作史、血管內(nèi)植入物和吸毒史等。血流 感染患者常有外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)

10、胞計(jì)數(shù)異常、CRP及ESR升高等實(shí)驗(yàn)室檢查異?，F(xiàn)象，但此類異常缺乏特異性。細(xì)菌性血流感染患者還常 有降鈣素原水平顯著升高的現(xiàn)象。血流感染的非選擇性二代測(cè)序檢測(cè)范圍涵蓋細(xì)菌、真菌、病毒（鼻病毒、腺病毒、CMV等）、不典型病原體（柯克斯體、巴爾通體等）。由于大 部分血流感染的病原體包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)（如瘧原蟲(chóng)）、部分病毒（如 皰疹病毒）均以DNA作為遺傳物質(zhì)，所以推薦將DNA二代測(cè)序作為血流 感染的首選檢測(cè)方法，僅在不能排除 RNA病毒感染（如腎綜合征出血熱、 登革熱、病毒性肺炎等）時(shí)推薦進(jìn)行RNA測(cè)序。目前，由于缺乏抗感染治療對(duì)二代測(cè)序診斷性能影響的高等級(jí)研究， 所以在血流感染中二代測(cè)序檢測(cè)

11、的最佳時(shí)間窗仍未確定。研究提示，二代 測(cè)序在患者起病后12周的時(shí)間內(nèi)仍可保持高于培養(yǎng)的陽(yáng)性率，但其仍 可隨時(shí)間推移下降。此外，血培養(yǎng)與血二代測(cè)序存在優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的情況。故目前推薦在患者起病后盡快進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)，如有條件，可在采取血培 養(yǎng)標(biāo)本的同時(shí)留取血液標(biāo)本保存于一 1620 C環(huán)境，以備后續(xù)的二代測(cè) 序檢測(cè)。在已經(jīng)接受治療的患者中進(jìn)行血二代測(cè)序作為補(bǔ)充檢測(cè)仍有較大 價(jià)值。3 .二代測(cè)序在臨床疑似局灶性感染中的適用范圍推薦意見(jiàn)8 :對(duì)于懷疑局灶性感染的患者，在對(duì)局灶部位完成常規(guī)的生物化學(xué)、培 養(yǎng)或PCR檢測(cè)后，若未能獲取病原學(xué)診斷結(jié)果， 推薦將二代測(cè)序作為二線 首選檢測(cè)手段（B，n ） o局灶性

12、感染是除血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、呼吸道感染外，以局 部組織出現(xiàn)感染性癥狀如紅、腫、熱、痛、捫及波動(dòng)感、有膿液滲出為表 現(xiàn)的一類疾病。部分局灶性感染可通過(guò)輔助檢查手段，如超聲檢查、影像 學(xué)檢查、侵襲性檢查（內(nèi)鏡、穿刺等），發(fā)現(xiàn)疑似感染性病灶（組織或積液）， 伴或不伴炎癥相關(guān)指標(biāo)升高等。局灶性感染的主要特點(diǎn)為臨床表現(xiàn)多樣，可伴有不典型的臨床癥狀如疲勞、體質(zhì)量減輕、胃腸道癥狀等。特定感染可有其特征性的臨床表現(xiàn)，如皮膚軟組織感染可表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛，嚴(yán)重者可見(jiàn)膿液滲出；關(guān)節(jié)腔感染可表現(xiàn)為局部疼痛、腫脹，關(guān)節(jié)腔內(nèi)積聚大量漿液性、纖維素性或 膿性滲出液，關(guān)節(jié)囊膨脹、按壓有波動(dòng)感、運(yùn)動(dòng)障礙等；尿路感染

13、可有較 為明顯的尿路刺激癥狀； 眼部感染可表現(xiàn)為不同程度的疼痛、畏光、流淚、視力下降、眼瞼痙攣，結(jié)膜水腫、充血，結(jié)膜囊的黃色分泌物增多、玻璃 體混濁等。嚴(yán)重者或伴全身毒血癥的癥狀，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)，甚至休克等。目前，已有多項(xiàng)研究報(bào)道二代測(cè)序可提高皮膚軟組織感染、骨關(guān)節(jié)感 染、眼內(nèi)感染、尿路感染、漿膜腔感染、其他組織感染中的病原學(xué)檢測(cè)能 力，二代測(cè)序在局灶性感染標(biāo)本中的較高靈敏性可能與局灶性感染標(biāo)本中 的致病病原體相對(duì)載量較高有關(guān)。在組織感染方面，對(duì)創(chuàng)傷弧菌、非結(jié)核 分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌等均有較強(qiáng)的診斷價(jià)值。在眼部感染中，除了對(duì) 常見(jiàn)的病毒、細(xì)菌、真菌性眼內(nèi)炎有診斷價(jià)值以外，還對(duì)不常見(jiàn)的病原體 如

14、弓形蟲(chóng)、棘阿米巴、風(fēng)疹病毒、隱球菌等感染有較強(qiáng)的提示作用。在尿 路感染中，研究顯示其可用于耐藥細(xì)菌的檢測(cè)。4 .二代測(cè)序在臨床疑似呼吸道感染中的適用范圍推薦意見(jiàn)9 :對(duì)于呼吸道感染患者，若3 d內(nèi)未通過(guò)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查獲得明確的病 原學(xué)依據(jù)且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無(wú)效，推薦留取呼吸道標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序檢 測(cè)（A，n ） 0推薦意見(jiàn)10 :對(duì)于高度懷疑病毒性肺炎且病情持續(xù)進(jìn)展的患者，可先完善呼吸道病毒多重PCR檢測(cè)，若為陰性，再行二代測(cè)序檢測(cè)，并應(yīng)同時(shí)進(jìn)行核酸 RNA 反轉(zhuǎn)錄（A，n ） o臨床上當(dāng)患者出現(xiàn)典型的呼吸道感染癥狀：上呼吸道癥狀，如鼻塞、 流淚、流涕等鼻咽部卡他癥狀，以及咽痛等；下呼吸道癥狀，

15、如咳嗽、發(fā) 熱、咳痰、氣急、哮鳴、胸部不適、胸痛、咯血等；全身癥狀，如畏寒、 發(fā)熱、寒戰(zhàn)等；體征上存在氧飽和度下降、呼吸急促、發(fā)紺、咽部黏膜紅 腫、口腔皰疹、潰瘍、扁桃體腫大、有肺實(shí)變體征或聽(tīng)診發(fā)現(xiàn)雙肺有干濕 啰音等；實(shí)驗(yàn)室檢查見(jiàn)血白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏咼、炎性因子偏咼；影像學(xué)檢查見(jiàn) 肺部炎癥表現(xiàn)。在排除其他疾病后，均需考慮呼吸道感染。當(dāng)免疫抑制人群或住院患 者出現(xiàn)相關(guān)癥狀時(shí)，更需考慮呼吸道感染，尤其是肺部感染的可能。當(dāng)有 肺部慢性疾病如慢性阻塞性肺疾病 （chro nic obstructive pulmo narydisease，COPD）、支氣管擴(kuò)張的患者出現(xiàn)病情急性加重時(shí)，也應(yīng)考慮是 否存在感染

16、誘發(fā)因素。根據(jù)二代測(cè)序原理，可對(duì)包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同 時(shí)進(jìn)行檢測(cè)?？稍?472 h內(nèi)鑒定標(biāo)本中可能存在的常規(guī)方法無(wú)法鑒定 的罕見(jiàn)病原體、病毒等。并可對(duì)多重感染進(jìn)行鑒定。目前，二代測(cè)序成本仍較高，商業(yè)化的二代測(cè)序檢測(cè)產(chǎn)品基于成本的 考慮，其相對(duì)固定的數(shù)據(jù)覆蓋度（如20 M特異性序列）對(duì)不同類型呼吸道 臨床樣本的靈敏度低于熒光 PCR等傳統(tǒng)分子檢測(cè)方法。因此，其不能替代 傳統(tǒng)檢測(cè)方法（除非加大測(cè)序覆蓋度使其靈敏度大于傳統(tǒng)分子檢測(cè)方法），而是應(yīng)作為傳統(tǒng)方法無(wú)法明確感染病原體時(shí)的補(bǔ)充。對(duì)于普通呼吸道感 染，先完善傳統(tǒng)方法的檢測(cè)；若無(wú)法明確且患者病情遷延不愈時(shí)，可將二 代測(cè)序作為首選檢

17、測(cè)手段。對(duì)于高度懷疑病毒性肺炎的患者，如在病毒高發(fā)季節(jié)急性起病、血白 細(xì)胞計(jì)數(shù)正常或偏低、病情進(jìn)展快，可先完善呼吸道病毒多重 PCR檢測(cè)以 及培養(yǎng)等；若為陰性，再行二代測(cè)序檢測(cè)，并應(yīng)同時(shí)進(jìn)行核酸RNA反轉(zhuǎn)錄。對(duì)于免疫抑制患者出現(xiàn)呼吸道感染或病情危重，在送檢傳統(tǒng)病原學(xué)檢 測(cè)方法的同時(shí)，應(yīng)盡快行呼吸道標(biāo)本 （盡量靠近病灶）二代測(cè)序檢測(cè)，以盡 早明確罕見(jiàn)病原體或混合感染。三、二代測(cè)序的流程與質(zhì)量控制推薦意見(jiàn)11 :采集樣本送檢二代測(cè)序必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則（A，n ） o推薦意見(jiàn)12 :樣本應(yīng)直接從患者感染部位的體液或組織中進(jìn)行采集（A，n ） o推薦意見(jiàn)13 :當(dāng)患者存在感染表現(xiàn)但病情危重或不能耐受

18、有創(chuàng)操作時(shí)，可考慮采集患者的血液標(biāo)本送檢（B，n ） o推薦意見(jiàn)14 :實(shí)驗(yàn)室在充分保障生物安全性的前提下， 應(yīng)建立完整的核酸檢測(cè)流程 （樣本采集，樣本前處理/核酸抽提及文庫(kù)建立，質(zhì)量控制及生物信息分析， 二代測(cè)序結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室判讀）（A，川）0推薦意見(jiàn)15 :每批次實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)包括內(nèi)參照、陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品。每批次實(shí) 驗(yàn)均需嚴(yán)格評(píng)估是否存在操作或環(huán)境帶來(lái)的污染。單個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量特 異性序列片段數(shù)建議不低于 2 X107條（即20 M特異性序列數(shù)），此外建議 測(cè)序序列讀長(zhǎng)不少于單端 50 bp（A，川）o推薦意見(jiàn)16 :對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，建議采用臨床應(yīng)用級(jí)別的數(shù)據(jù)庫(kù)，審慎使用公共 數(shù)據(jù)庫(kù)（A

19、，川）o推薦意見(jiàn)17 :建議二代測(cè)序檢測(cè)病原體的報(bào)告應(yīng)涵蓋該批次實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參照、陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品結(jié)果，并記錄相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如單個(gè)樣本數(shù)據(jù)量、 序列讀長(zhǎng)，以及相關(guān)的質(zhì)控參數(shù)（A，川）o（一）樣本采集針對(duì)患者感染部位的不同，采集的樣本類型主要包括靜脈血、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液、腹水、組織、咽拭子、局灶穿刺物等多種 類型。不同類型的樣本采集需遵循以下原則： 對(duì)于無(wú)菌體液，如靜脈血、腦脊液、胸腔積液、腹水等，需按照嚴(yán) 格的無(wú)菌操作采集樣本，采集前對(duì)局部或周圍皮膚進(jìn)行消毒處理，消毒液 需與皮膚作用一定時(shí)間，待皮膚干燥后再取樣，一般收集第2管標(biāo)本送檢' 采集的樣本須置于無(wú)菌容

20、器內(nèi)。 對(duì)于有菌部位的樣本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，應(yīng)標(biāo)明樣 本的采集部位，在樣本采集過(guò)程中應(yīng)盡量避免引入該部位的正常菌群，以 免干擾后續(xù)檢測(cè)結(jié)果。采集的樣本應(yīng)盡量選取感染部位的體液或組織，可提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。若感染部位的樣本采集難度較大，可選擇外周血液標(biāo)本，但有可能 會(huì)降低檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。所有采集的感染部位樣本均應(yīng)及時(shí)送檢。標(biāo)本遠(yuǎn)距離運(yùn)輸需采用冷鏈運(yùn)輸，并保證無(wú)菌原則。應(yīng)嚴(yán)格遵守相應(yīng)測(cè)序廠商的運(yùn)輸標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(standard operation procedure ，SOP)，盡可能避免凍融環(huán)節(jié)。對(duì)于不 能及時(shí)送檢的樣本，應(yīng)按照前述各個(gè)標(biāo)本的相應(yīng)要求進(jìn)行保存。(2) 樣本前處理

21、/核酸抽提及文庫(kù)建立不同樣本類型均來(lái)源于疑似感染部位，具有潛在的感染性，在樣本處 理前需進(jìn)行滅活處理。對(duì)于痰液樣本，由于本身黏性較高，為方便后續(xù)實(shí) 驗(yàn)操作，滅活后還需進(jìn)行液化處理；對(duì)于血液樣本，需根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需求 決定是否離心進(jìn)行血漿分離；對(duì)于組織樣本，為提高核酸提取效率，需預(yù) 先將其切碎后進(jìn)行操作。所有的檢測(cè)樣本均來(lái)自人體的不同部位，因此在樣本中本身就包含了大量人源細(xì)胞（或人源基因組/轉(zhuǎn)錄組成分），而且不同類型的樣本中人源細(xì) 胞（或人源基因組/轉(zhuǎn)錄組成分）含量也不一致，為提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏性， 在不影響樣本中病原體含量的前提下，可通過(guò)差異離心法或過(guò)濾等選擇性 地去除部分人源細(xì)胞（或人源基因組

22、/轉(zhuǎn)錄組成分）。不同部位的樣本經(jīng)過(guò)處理后都要進(jìn)行核酸提取，核酸的質(zhì)量是決定二代測(cè)序成功的關(guān)鍵，因此不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立完整的核酸檢測(cè)流程，通過(guò)測(cè) 定核酸的完整性或降解程度，制訂合格樣本的標(biāo)準(zhǔn)。此外，文庫(kù)制備流程 對(duì)核酸樣本有嚴(yán)格要求，需對(duì)每次提取的核酸樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，以確保 核酸量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。針對(duì)不同樣本類型對(duì)提取的核酸進(jìn)行文庫(kù)制 備，文庫(kù)制備流程一般包括核酸片段化、末端修復(fù)、標(biāo)簽接頭連接和PCR文庫(kù)等。提取試劑盒及全流程中各種試劑的選擇，都應(yīng)考慮生產(chǎn)過(guò)程中的工程 菌和環(huán)境污染微生物的核酸殘留信息，以及對(duì)檢測(cè)所造成的影響。在操作 過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格采取無(wú)菌流程，污染防控對(duì)標(biāo)本結(jié)果的質(zhì)量控制至關(guān)重

23、要。每批次實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)包括內(nèi)參照、陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，以評(píng)估每批次 樣本中是否存在操作或環(huán)境帶來(lái)的污染以及檢測(cè)流程是否存在異常。（三）質(zhì)量控制及生物信息分析質(zhì)量控制體系應(yīng)包含多個(gè)質(zhì)量控制點(diǎn)，依次為樣本運(yùn)輸溫控、提取濃度與純度、出庫(kù)濃度、文庫(kù)片段分布、下機(jī)總數(shù)據(jù)量、測(cè)序質(zhì)量（Q20、Q30比率）等，分別監(jiān)控運(yùn)輸溫度、核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、下機(jī)數(shù)據(jù)可靠 性等方面，任何不符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)都應(yīng)及時(shí)終止，重新檢測(cè)，或 在無(wú)法重新檢測(cè)的情況下可提供預(yù)警，以供臨床參考。全流程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包含但不限于如下幾項(xiàng)： 每批次實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)包括內(nèi)參照、陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品。 在缺乏有效的人源宿主去除步驟的情況

24、下，建議單個(gè)標(biāo)本測(cè)序數(shù)據(jù)量特異性序列片段數(shù)不低于 2 X107條（即20 M特異性序列數(shù)）。 為確保序列比對(duì)的準(zhǔn)確性，避免因同源錯(cuò)配導(dǎo)致的序列比對(duì)錯(cuò)誤， 建議測(cè)序序列單端讀長(zhǎng)不少于 50 bp o目前，國(guó)際上采用的二代測(cè)序儀也可進(jìn)行雙端測(cè)序，但雙端測(cè)序所花 費(fèi)的經(jīng)濟(jì)成本及時(shí)間均高于單端測(cè)序，所以不在臨床標(biāo)本感染病原體檢測(cè) 中作為首要推薦。推薦采用臨床應(yīng)用級(jí)別的數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)臨床病原體的不同 種、不同型別有滿足需求的區(qū)分度。生物信息分析流程應(yīng)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，以自動(dòng)化為主，以人工糾錯(cuò)為輔， 不應(yīng)帶有過(guò)多的人工判讀成分。建議二代測(cè)序檢測(cè)報(bào)告應(yīng)涵蓋該批次實(shí)驗(yàn) 中的內(nèi)參照、陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品結(jié)果，并記錄相關(guān)

25、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)， 如測(cè)序質(zhì)量、單個(gè)樣本數(shù)據(jù)量、序列讀長(zhǎng)、檢出病原微生物序列數(shù)、相對(duì) 豐度等。（四）二代測(cè)序結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室判讀推薦目前，不同的測(cè)序平臺(tái)其二代測(cè)序病原體檢測(cè)的判讀閾值可能不同， 但是應(yīng)建議將下列標(biāo)準(zhǔn)用于所有二代測(cè)序病原體檢測(cè)流程。滿足"（三）質(zhì)量控制及生物信息分析"中質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的下機(jī)數(shù)據(jù)，在進(jìn)入分析解讀流程后 應(yīng)遵循以下原則: 剔除試劑、環(huán)境、測(cè)序和生物信息分析流程中引入的假陽(yáng)性病原體 信息，將樣本中含有的病原體核酸信息真實(shí)地呈現(xiàn)給臨床。 原則上報(bào)告病原體信息應(yīng)準(zhǔn)確到種（檢出序列數(shù)極少或極高相似度 的病原體復(fù)合群除外），同時(shí)應(yīng)包含相應(yīng)的屬信息。 建議根據(jù)病原體出現(xiàn)

26、的頻度和臨床致病性等信息，將臨床高度關(guān)注、健康人樣本中極少出現(xiàn)的病原體核酸信息單獨(dú)呈現(xiàn)（即高度致病可能性），同時(shí)將某些部位（如呼吸道、皮膚、腸道等）的常見(jiàn)、低（或無(wú)）致病性 病原體（定植菌等）單獨(dú)呈現(xiàn)。 建議對(duì)報(bào)告中呈現(xiàn)的所有病原體引用權(quán)威文獻(xiàn)進(jìn)行關(guān)鍵信息的注 釋，以便臨床能快速做出判斷。報(bào)告中應(yīng)有適度的微生物相關(guān)信息及相關(guān) 文獻(xiàn)幫助臨床醫(yī)師理解報(bào)告結(jié)果。四、二代測(cè)序結(jié)果的臨床應(yīng)用建議及臨床判讀、驗(yàn)證已有的報(bào)道和研究均提示，二代測(cè)序?qū)Πㄖ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染、血流 感染和呼吸道感染在內(nèi)的各部位感染均有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。在某些臨 床場(chǎng)景中，二代測(cè)序不僅有助于進(jìn)行快速、精準(zhǔn)的診斷，而且也對(duì)制訂抗 感

27、染治療方案及后續(xù)療效評(píng)估具有指導(dǎo)作用。2016年，美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局 （Food and DrugAdministration，F(xiàn)DA）發(fā)布了二代測(cè)序體外診斷產(chǎn)品的指南草案；2018年，二代測(cè)序被寫入中國(guó)成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南（2018年版）；2019年，關(guān)于二代測(cè)序的宏基因組分析和 診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識(shí)發(fā)布。推薦意見(jiàn)18 :二代測(cè)序結(jié)果應(yīng)在與患者臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查密切結(jié)合的前提下進(jìn)行解讀和驗(yàn)證（B，川）o推薦意見(jiàn)19 :對(duì)于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根據(jù)推薦意見(jiàn)1至13采集合適的樣本進(jìn)行二代測(cè)序，根據(jù)送檢樣

28、本 類型結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)及其他結(jié)果輔助判斷或排除診斷，同時(shí)應(yīng)注意排 除檢出病原體定植的情況（B，n ）o2014年，有基于二代測(cè)序?qū)?例中樞神經(jīng)系統(tǒng)鉤端螺旋體感染病例 進(jìn)行臨床診斷的報(bào)道。隨后全球范圍內(nèi)陸續(xù)報(bào)道了通過(guò)對(duì)腦脊液及腦組織進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)而確診的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病例，其病原譜包括病毒、 細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)等。一項(xiàng)前瞻性研究納入10例中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥患者，對(duì)其腦組織 進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)，除了協(xié)助 3例明確病原學(xué)診斷外，還提示二代測(cè)序陰 性結(jié)果有助于排除感染性疾病的診斷。另一項(xiàng)系統(tǒng)綜述通過(guò)檢索25篇論文共對(duì)44例以二代測(cè)序?yàn)樵\斷方法的疑似腦炎患者進(jìn)行綜合分析，其中 16例同時(shí)可通過(guò)P

29、CR等方式確診，另外28例則為其他檢測(cè)方法難以明 確診斷的新發(fā)或少見(jiàn)/罕見(jiàn)病原菌感染病例，提示二代測(cè)序可協(xié)助臨床疑難 感染的診斷。還有一項(xiàng)研究以健康志愿者為陰性對(duì)照，對(duì)78例膿毒癥患者的血漿進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)，檢出病毒陽(yáng)性15例，細(xì)菌及真菌陽(yáng)性17例；提示二 代測(cè)序聯(lián)合血培養(yǎng)較單用血培養(yǎng)可顯著提高病原體的檢出率。而對(duì)于呼吸 道感染，相關(guān)研究主要集中在病毒所致感染。2015年，研究發(fā)現(xiàn)低覆蓋度（V 1 M特異性序列數(shù)）二代測(cè)序?qū)Ρ茄?拭子的病毒檢出率雖然低于反轉(zhuǎn)錄PCR，但其有助于確定病毒亞型和血清型，也說(shuō)明了測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋度的重要性。二代測(cè)序在縮短診斷周轉(zhuǎn)時(shí)間方 面也具有一定優(yōu)勢(shì)。我國(guó)一項(xiàng)對(duì)178

30、例重癥肺炎患者的回顧性研究結(jié)果提示，二代測(cè)序可幫助進(jìn)行早期病原學(xué)診斷，指導(dǎo)抗菌藥物的應(yīng)用，從而降 低患者的病死率。推薦意見(jiàn)20 :對(duì)于二代測(cè)序結(jié)果為陰性，但根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果（如培養(yǎng)結(jié)果）高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建議必要時(shí)再次取樣重復(fù)二代 測(cè)序檢測(cè)（B，n ）。若二代測(cè)序結(jié)果符合患者的臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢查，推薦根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果指導(dǎo)臨床決策。若患者二代測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性且符合臨床表現(xiàn)，但 缺乏除二代測(cè)序結(jié)果外的其他實(shí)驗(yàn)室支持證據(jù)，應(yīng)進(jìn)行PCR驗(yàn)證（在具有合適引物的條件下），并建議臨床進(jìn)一步完善可獲得的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查加以 驗(yàn)證。若患者二代測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性， 但臨床表現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室檢查結(jié)果不

31、支持該結(jié) 果，則不能僅根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行診斷，而應(yīng)以傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果為 首要臨床參考依據(jù)。對(duì)于二代測(cè)序結(jié)果為陰性，但根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果 （如培養(yǎng)結(jié)果）高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建議必要時(shí)再 次取樣重復(fù)二代測(cè)序檢測(cè)。五、二代測(cè)序在臨床感染性疾病中針對(duì)不同病原體類型的診斷效能推薦意見(jiàn)21 :在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中，目前證據(jù)提示二代測(cè)序檢測(cè)細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、 病毒的效果較好，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染仍需更大樣本量的臨床試驗(yàn)來(lái) 檢驗(yàn)其檢測(cè)效能(B，n ) o由于二代測(cè)序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的應(yīng)用仍以病例報(bào)道為主，所以可參考的大型研究較少。腦脊液通常含有較低的病原體量，故病原體檢測(cè) 更具挑戰(zhàn)

32、性。在5項(xiàng)關(guān)于腦脊液的二代測(cè)序研究中，診斷率分別為0(0/36)、1.6 % (2/125)、6 % (4/62)、19 % (3/16)和 30 % (3/10)，在無(wú)細(xì)胞的腦脊 液上清液中只能檢測(cè)到無(wú)細(xì)胞病毒或無(wú)細(xì)胞微生物核酸，會(huì)導(dǎo)致較低的檢 出率，提示臨床應(yīng)采用腦脊液而非上清液作為二代測(cè)序標(biāo)本。國(guó)外一項(xiàng)研究顯示，與傳統(tǒng)臨床實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較，二代測(cè)序的靈 敏度為73 %，特異度為99 %，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為81 %，陰性預(yù)測(cè)值為99 %。 另一項(xiàng)前瞻性研究對(duì)腦膜炎、腦炎和(或)脊髓炎患兒中收集到的20份腦脊 液陽(yáng)性樣本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)，與傳統(tǒng)的腦脊液微生物檢測(cè)相比，二代測(cè) 序檢測(cè)診斷致病病原體

33、的靈敏度為92 %，特異度為96 %o我國(guó)患兒的腦脊液測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，55.56 %的二代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果與臨 床傳統(tǒng)方法學(xué)一致，其中主要的病原體為細(xì)菌。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在疑似中 樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的初治患者中，與培養(yǎng)相比，二代測(cè)序具有90 %的靈敏度, 其檢出率較培養(yǎng)提咼了約 25 %。已有的研究結(jié)果提示二代測(cè)序檢測(cè)細(xì)菌、 寄生蟲(chóng)、病毒的效果較好，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染仍需更大樣本量的臨 床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其檢測(cè)效能。推薦意見(jiàn)22 :對(duì)于膿毒癥患者，推薦聯(lián)合采用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和二代測(cè)序來(lái)提高病 原學(xué)的檢出率(B，n ) 0血流感染的異質(zhì)性較大，目前尚缺乏針對(duì)血流感染者的大型二代測(cè)序 診斷效能研究。現(xiàn)有的研究結(jié)

34、果提示，血液樣本二代測(cè)序與血培養(yǎng)保持了 高度的一致性，是可靠的病原學(xué)檢測(cè)方法。一項(xiàng)中國(guó)的研究顯示，以培養(yǎng) 為金標(biāo)準(zhǔn)，二代測(cè)序的靈敏度和特異度分別為72.7 %和89.6 %;此外，二代測(cè)序還表現(xiàn)出了比血培養(yǎng)更高的額外檢測(cè)效能，成為血培養(yǎng)的有力補(bǔ) 充。若以培養(yǎng)聯(lián)合二代測(cè)序、桑格法測(cè)序驗(yàn)證作為金標(biāo)準(zhǔn)，則二代測(cè)序的陽(yáng)性 率較單用血培養(yǎng)有顯著提升(23.08 %比12.82 %) o另一項(xiàng)關(guān)于膿毒癥休克 的研究中，二代測(cè)序的陽(yáng)性率在起病前3周內(nèi)波動(dòng)于71 %左右，而血培養(yǎng)陽(yáng)性率僅在起病時(shí)達(dá) 33 %，此后波動(dòng)于10 %20 %o推薦意見(jiàn)23 :對(duì)于局灶膿腫或組織感染患者，二代測(cè)序的總體靈敏性和特異性均

35、較好，其中對(duì)細(xì)菌檢測(cè)的靈敏性優(yōu)于真菌 （A，n ）。在關(guān)于局灶性感染的病原體檢測(cè)報(bào)道中，個(gè)案報(bào)道較多。但已有研究 證實(shí)，二代測(cè)序在包括局灶膿液、感染部位組織、感染性的體液標(biāo)本中的 靈敏性均優(yōu)于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。在骨關(guān)節(jié)感染中，二代測(cè)序與臨床培養(yǎng)陽(yáng) 性標(biāo)本的一致率可達(dá)83 %94.8 %，在培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中可額外檢出 49.3 %93 %的病原體。肺組織二代測(cè)序?qū)?xì)菌感染的靈敏度可達(dá) 100 %，特異度為76.5 %;對(duì)真菌感染的靈敏度為57.1 %，特異度為61.5 %;對(duì)細(xì)菌和真菌的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為42.9 %和44.4 %，陰性預(yù)測(cè)值分別為100 %和72.7 %o推薦意見(jiàn)24 :對(duì)于呼吸道

36、感染，二代測(cè)序在病毒及少見(jiàn)病原體的檢測(cè)中體現(xiàn)出較好 的檢測(cè)效能；但在細(xì)菌、真菌等病原體的檢測(cè)中，二代測(cè)序尚不能準(zhǔn)確判 斷菌群定植或感染狀態(tài)，仍需依賴臨床醫(yī)師結(jié)合患者病情進(jìn)行進(jìn)一步分析 （A，n ）推薦意見(jiàn)25 :對(duì)于結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門菌、布魯菌等胞內(nèi)菌，以及具有細(xì)胞壁 的真菌，二代測(cè)序的檢測(cè)效能會(huì)相對(duì)降低，應(yīng)對(duì)上述菌群設(shè)置特定的序列 數(shù)閾值（A，川）o在二代測(cè)序檢測(cè)呼吸道病原體的研究中，一項(xiàng)研究對(duì) 67份兒科呼吸 道感染患者的鼻咽拭子標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行了多重 PCR和二代測(cè)序檢測(cè)，兩者的 一致率為93 %;二代測(cè)序漏診了其中 3例，但多重PCR同樣未檢測(cè)到其 中2例患者感染的病毒；同時(shí)，二代測(cè)序

37、檢測(cè)到了 PCR靶向范圍外的11 株病毒。在成人上呼吸道感染領(lǐng)域，一項(xiàng)研究探索了二代測(cè)序在89份成人急性上呼吸道感染鼻咽拭子標(biāo)本中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)二代測(cè)序的靈敏度為77.55 %，特異度為80.49 %100.00 %;在二代測(cè)序漏診的標(biāo)本中，相 應(yīng)病原體的實(shí)時(shí)PCR循環(huán)閾值顯著更高，提示病原體載量低，在低數(shù)據(jù)量 覆蓋度的情況下可能影響二代測(cè)序的檢出率。另一項(xiàng)研究評(píng)估了二代測(cè)序在 24份流行性感冒病毒陽(yáng)性的呼吸道標(biāo)本（包括肺泡灌洗液、痰液和咽拭子）中的檢測(cè)性能；24份標(biāo)本中，18份的二代測(cè)序結(jié)果與PCR完全一致，另外6份不一致的標(biāo)本中，病毒實(shí)時(shí)PCR循環(huán)閾值均高于35 o還有研究將二代測(cè)序應(yīng)用于 16例急性下呼吸道 感染患者的鼻咽抽吸物標(biāo)本，其中15份標(biāo)本中都檢出了病毒，結(jié)果與PCR 完全一致。在重癥肺炎患者中，培養(yǎng)和二代測(cè)序的一致性達(dá)55.5 %，且二代測(cè)序有更高的靈敏度。綜上所述，目前已發(fā)表的關(guān)于二代測(cè)序應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)效能研 究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣本中病原微生物含量較高時(shí)，二代測(cè)序的總體檢測(cè)效能與 PCR差距不大；但當(dāng)病毒載量較低時(shí)，當(dāng)前二代測(cè)