HPLC檢測(cè)食品中的四種磺胺類獸藥

1、高效液相色譜法檢測(cè)四種磺胺類高效液相色譜法檢測(cè)四種磺胺類獸藥殘留獸藥殘留磺胺類藥物磺胺類藥物 主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺瞇、菌得清、新諾明等。近年來，磺胺類啶、磺胺瞇、菌得清、新諾明等。近年來，磺胺類藥物在動(dòng)物性食品中的殘留超標(biāo)現(xiàn)象，在所有獸藥藥物在動(dòng)物性食品中的殘留超標(biāo)現(xiàn)象，在所有獸藥當(dāng)中是最嚴(yán)重的。長(zhǎng)期攝入含磺胺類藥物殘留的動(dòng)當(dāng)中是最嚴(yán)重的。長(zhǎng)期攝入含磺胺類藥物殘留的動(dòng)物性食品后，藥物可不斷在體內(nèi)蓄積物性食品后，藥物可不斷在體內(nèi)蓄積?；前奉愃幬锏亩拘宰饔没前奉愃幬锏亩拘宰饔胮損害泌尿系統(tǒng)損害泌尿系統(tǒng) 磺胺類藥主要經(jīng)腎臟排出，在尿

2、中濃度較高，其溶解度又較低，尤其當(dāng)磺胺類藥主要經(jīng)腎臟排出，在尿中濃度較高，其溶解度又較低，尤其當(dāng)尿液偏酸性時(shí)，可在腎盂、輸尿管或膀胱內(nèi)析出結(jié)晶，產(chǎn)生刺激和阻塞，尿液偏酸性時(shí)，可在腎盂、輸尿管或膀胱內(nèi)析出結(jié)晶，產(chǎn)生刺激和阻塞，造成泌尿系統(tǒng)損傷，引起結(jié)晶尿、血尿、管型尿。造成泌尿系統(tǒng)損傷，引起結(jié)晶尿、血尿、管型尿。 p引起過敏反應(yīng)引起過敏反應(yīng) p抑制造血系統(tǒng)抑制造血系統(tǒng) p導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性磺胺類藥物結(jié)構(gòu)磺胺類藥物結(jié)構(gòu) 磺胺類藥物的基本結(jié)構(gòu)為對(duì)氨苯磺酰胺，簡(jiǎn)稱磺胺的衍生物，磺胺類藥物的基本結(jié)構(gòu)為對(duì)氨苯磺酰胺，簡(jiǎn)稱磺胺的衍生物， 具有芳具有芳氨基和磺酰胺基，多為兩性化合物氨基和磺酰

3、胺基，多為兩性化合物 。 常用的磺胺類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式：常用的磺胺類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式： H2NSOONHRsulfonamide backboneRRR14Hsulfanilamide (SAN)NSsulfathiazole (STZ)NOsulfisozole (SIZ)NOH3CCH3sulfisoxazole(SIX)sulfamethoxazole (SMX)NOCH3NOCH3CH3Sulfatroxazole (STX)NNsulfadiazine (SDZ)NNsulfamerazine (SMR)CH3NNCH3CH3sulfamethazine (SMZ)or sulfad

4、imidine (SDD)NNOCH3sulfamethoxypyridazine (SPMX)NNOCH3sulfameter (SME)NNOCH3sulfamonomethoxine (SMMX)NNH3COOCH3sulfadoxine (SD)Nsulfapyridine (SP)NNOCH3OCH3sulfadimethoxine (SDMX)NNOCH3OCH3sulfadimethoxine (SDMX)磺胺類藥物的分子結(jié)構(gòu)磺胺類藥物的分子結(jié)構(gòu) p磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用 磺胺藥對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌都有抑制作用，在食源性動(dòng)物磺胺藥對(duì)大多數(shù)

5、革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌都有抑制作用，在食源性動(dòng)物的飼養(yǎng)中，磺胺類藥物不僅作為獸藥被廣泛用于獸醫(yī)臨床對(duì)細(xì)菌感染的飼養(yǎng)中，磺胺類藥物不僅作為獸藥被廣泛用于獸醫(yī)臨床對(duì)細(xì)菌感染性疾病的防治，有時(shí)也被用作飼料添加劑。性疾病的防治，有時(shí)也被用作飼料添加劑。p磺胺藥的藥代動(dòng)力學(xué)磺胺藥的藥代動(dòng)力學(xué) 磺胺藥主要在肝臟中代謝，常見的方式是在對(duì)位氨基處發(fā)生乙?；?，磺胺藥主要在肝臟中代謝，常見的方式是在對(duì)位氨基處發(fā)生乙酰化，其次是羥基化作用。有的磺胺藥其乙酰代謝物的水溶性低，易在腎小其次是羥基化作用。有的磺胺藥其乙酰代謝物的水溶性低，易在腎小管內(nèi)析出結(jié)晶，而有些代謝物雖水溶性較高，但在酸性尿中也容易結(jié)管內(nèi)析出結(jié)晶，而有

6、些代謝物雖水溶性較高，但在酸性尿中也容易結(jié)晶析出，容易引起結(jié)晶尿和腎并發(fā)癥。晶析出，容易引起結(jié)晶尿和腎并發(fā)癥?；前奉愃幬飳?duì)食品的污染磺胺類藥物對(duì)食品的污染p使用過磺胺類藥物的動(dòng)物，如果不遵守適當(dāng)?shù)男菟幤?，其肌肉組織、蛋使用過磺胺類藥物的動(dòng)物，如果不遵守適當(dāng)?shù)男菟幤?，其肌肉組織、蛋和奶中就會(huì)被殘留的磺胺類藥物污染；短期大劑量或長(zhǎng)期小劑量給藥，和奶中就會(huì)被殘留的磺胺類藥物污染；短期大劑量或長(zhǎng)期小劑量給藥，很容易造成磺胺類藥物在動(dòng)物各組織中蓄積；很容易造成磺胺類藥物在動(dòng)物各組織中蓄積；p當(dāng)飼料或飲水被磺胺類藥物污染后，也可導(dǎo)致動(dòng)物性食品中磺胺類藥物當(dāng)飼料或飲水被磺胺類藥物污染后，也可導(dǎo)致動(dòng)物性食品中

7、磺胺類藥物殘留量嚴(yán)重超標(biāo)；殘留量嚴(yán)重超標(biāo)；p很多研究表明豬肉及其制品中磺胺藥物超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，特別是致癌很多研究表明豬肉及其制品中磺胺藥物超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，特別是致癌性的磺胺二甲基嘧啶殘留給人類的健康帶來了威脅。性的磺胺二甲基嘧啶殘留給人類的健康帶來了威脅。食品中磺胺類藥物的最高殘留限量食品中磺胺類藥物的最高殘留限量p英、美等國(guó)家對(duì)磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為英、美等國(guó)家對(duì)磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為100 gkg-1；p歐盟第歐盟第675/92675/92號(hào)令中規(guī)定了，在肉類及牛奶中磺胺的最大殘留總量不得號(hào)令中規(guī)定了，在肉類及牛奶中磺胺的最大殘留總量不得超過超過

8、100 gkg-1；p日本要求的最高殘留限量更嚴(yán)格，單個(gè)磺胺殘留限量為日本要求的最高殘留限量更嚴(yán)格，單個(gè)磺胺殘留限量為20 g20 gkgkg-1 -1 ，最大殘留總量不得超過最大殘留總量不得超過100 gkg-1；p我國(guó)對(duì)磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為我國(guó)對(duì)磺胺類藥物在肉類及乳品中的允許殘留量限制為100 gkg-1。提取和凈化方法提取和凈化方法 p磺胺類藥物不易溶于非極性溶劑，而在極性較大的溶磺胺類藥物不易溶于非極性溶劑，而在極性較大的溶劑中溶解性較好，一般常用乙睛、氯仿、二氯甲烷、劑中溶解性較好，一般常用乙睛、氯仿、二氯甲烷、丙酮、或乙酸乙酯提取。丙酮、或乙酸乙酯提取。p凈化

9、方法主要有柱色譜，凈化方法主要有柱色譜，TLCTLC，液液萃取（，液液萃?。↙LELLE），固），固相萃取（相萃?。⊿PESPE）和基質(zhì)固相分散萃取（）和基質(zhì)固相分散萃?。∕SPDMSPD）等。）等。 磺胺類藥物的磺胺類藥物的HPLC法色譜條件法色譜條件p常采用反相硅膠柱對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分離，主要有常采用反相硅膠柱對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分離，主要有C18C18，C8C8或者或者C4C4柱，柱，有時(shí)也采用離子對(duì)色譜柱。有時(shí)也采用離子對(duì)色譜柱。p流動(dòng)相主要由乙睛流動(dòng)相主要由乙睛- -水，甲醇水，甲醇- -水或者乙睛水或者乙睛- -甲醇甲醇- -水按不同比例組水按不同比例組成，也有文獻(xiàn)報(bào)道采用乙醇成，也有文獻(xiàn)報(bào)道

10、采用乙醇- -水系統(tǒng)。在以上流動(dòng)相系統(tǒng)中加入適水系統(tǒng)。在以上流動(dòng)相系統(tǒng)中加入適量乙酸或者十二烷基磺酸鈉（量乙酸或者十二烷基磺酸鈉（SDSSDS）常用于提高分離效率。）常用于提高分離效率。目前常用磺胺類獸藥的檢測(cè)方法目前常用磺胺類獸藥的檢測(cè)方法1.分光光度法2.氣相色譜法3.高效液相色譜法4.酶聯(lián)免疫吸附分析法 5.高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈾z測(cè)磺胺類獸藥殘留的方法，掌握高效液相了解檢測(cè)磺胺類獸藥殘留的方法，掌握高效液相色譜法檢測(cè)磺胺類獸藥殘留的方法；色譜法檢測(cè)磺胺類獸藥殘留的方法；了解高效液相色譜法測(cè)定獸藥多殘留的方法；了解高效液相色譜法測(cè)定獸藥多殘留的方法；了解建立高效

11、液相色譜法測(cè)定獸藥多殘留的方法了解建立高效液相色譜法測(cè)定獸藥多殘留的方法步驟及需要測(cè)定的參數(shù)。步驟及需要測(cè)定的參數(shù)。p磺胺類藥物在紫外區(qū)（波長(zhǎng)一般在250-280 nm）有吸收，可以選擇高效液相色譜（配紫外檢測(cè)器）對(duì)上述化合物進(jìn)行分離，定性定量測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理p 儀器：儀器：n島津高效液相色譜分析儀島津高效液相色譜分析儀 配有配有UV100UV100紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器n隔膜真空抽濾器（津騰）隔膜真空抽濾器（津騰） n超聲波清洗器超聲波清洗器 n電子天平電子天平 nSHB- SHB- 循環(huán)水式多用真空泵循環(huán)水式多用真空泵 nGDYQ-701S GDYQ-701S 樣品提取儀樣品提取儀

12、n101-3101-3型型 電熱鼓風(fēng)干燥箱電熱鼓風(fēng)干燥箱 nPHS-25 PHPHS-25 PH計(jì)計(jì) 儀器與試劑儀器與試劑磺胺噻唑 純度99.9磺胺嘧啶 純度99.9磺胺甲基嘧啶 純度99.9磺胺二甲嘧啶 純度99.9色譜純甲醇儀器與試劑儀器與試劑溶液配制溶液配制 p標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液配制n準(zhǔn)確稱取四種SAs藥物標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配置成1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。p 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液n準(zhǔn)確稱取四種SAs的標(biāo)準(zhǔn)品10mg，共同置于25 ml容量瓶中，用甲醇定容，配置成400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。 p色譜柱色譜柱 ：Symmetry Cl8反相色譜柱(46250

13、mm i.d)p檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；p流動(dòng)相流動(dòng)相：甲醇：甲醇：1%（）乙酸 = 25：75p進(jìn)樣量：進(jìn)樣量：20 ulp流動(dòng)相流速流動(dòng)相流速: : 1 ml/min色譜條件色譜條件標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 p由四種樣品混合標(biāo)準(zhǔn)液400 ppm,進(jìn)行等度稀釋成質(zhì)量濃度為8 ppm、6 ppm、4 ppm、2 ppm、1 ppm、0.4 ppm的標(biāo)準(zhǔn)系列，各取20 ul由高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，據(jù)峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。定性實(shí)驗(yàn)定性實(shí)驗(yàn) p將標(biāo)準(zhǔn)樣品的四種單品及混合樣品溶液分別進(jìn)行稀釋至8 ppm，并經(jīng)HPLC進(jìn)樣分析，根據(jù)四種單品各自出峰時(shí)間及混合樣品中四種單樣的出峰

14、時(shí)間比較進(jìn)行定性 Minutes6810121416182022242628303234Volts-0.050-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.2000.225Volts-0.050-0.0250.0000.0250.0500.0750.1000.1250.1500.1750.2000.225(SDZ)(STZ) SMR SMO SMTSDMD SMP SCP SDXSIA 水樣經(jīng)過水樣經(jīng)過0.45um 膜過濾后直接進(jìn)樣膜過濾后直接進(jìn)樣濃度計(jì)算濃度計(jì)算樣品的測(cè)定樣品的測(cè)定mABYC其中：C樣品中磺胺類獸藥的含量，mg L-1； A

15、標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率Y 測(cè)定樣品的峰面積；B標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；m 稱取樣品的量，L。液相色譜柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 樣品的前處理樣品的前處理最好使用流動(dòng)相溶解樣品。使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。使用0.45m的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)，閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩。柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)從有機(jī)溶劑直接改變?yōu)樗粗嗳灰话阏f來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖

16、時(shí)，才可以反沖除去柱頭的雜質(zhì)，否則反沖會(huì)迅速降低柱效 柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞有時(shí)可以連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠飽和，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱保護(hù)柱一般是填有固定相的短柱保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)，在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，常規(guī)分析需要50-75L。柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)p正相硅膠柱以正已烷（或庚烷），二氯甲烷（或氯仿）和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。p反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順