免疫沉淀IP 免疫共沉淀coIP 染色體免疫沉淀ChIP

1、樓上說的準(zhǔn)確的叫Co-IP。IP就是免疫沉淀，沒有“共”，哈哈。 其實(shí)樓主的意思是既然有Pyk2 and p-Pyk2的抗體，直接檢測western,就可以了，為什么還要用IP以后的樣品來檢測，這是因?yàn)閜-Pyk2商業(yè)化的抗體特異性不好，可能對p-FAK或其他類似的磷酸化蛋白有交叉，所以我們一般為了準(zhǔn)確性，看其磷酸化的變化，就先單獨(dú)把這個(gè)蛋白免疫沉淀出來，在用4G10抗體來檢測。而且這個(gè)方法看的是Pyk2蛋白全部的磷酸化位點(diǎn)的情況，而p-Pyk2商業(yè)化抗體一般都是識別某一格Tyr磷酸化位點(diǎn)的，所以這兩種試驗(yàn)是有本質(zhì)區(qū)別的，這種方法還應(yīng)用于很多Tyrosine kinase receptor磷酸

2、化的檢測，因?yàn)檫@些蛋白磷酸化位點(diǎn)都特別多哈：)免疫沉淀是指用抗體把抗原（包括單體、復(fù)合物）沉淀下來 ，是一種抗原純化、濃集的方法；免疫共沉淀 指用抗體把抗原復(fù)合物沉淀下來，常用來研究蛋白質(zhì)的相互作用免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agaose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體

3、解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白?；緦?shí)驗(yàn)步驟（1）收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞IP裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上或者4裂解30min, 12,000g離心30 min后取上清；（2） 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液將1g相應(yīng)的抗體和10-50 l protein A/G-beads加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；（3）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 g速度離心5 min,將protein A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解緩沖液洗3-4次；最后加入

4、15l的2×SDS 加樣緩沖液，沸水煮10分鐘；（4）SDS-PAGE, Western blotting或進(jìn)行質(zhì)譜分析。一、 樣品處理：免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否，第一步處理樣品非常關(guān)鍵。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)本質(zhì)上是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng)，而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應(yīng)中的抗原的質(zhì)量，濃度以及抗原是否處于天然構(gòu)象狀態(tài)。所以制備高質(zhì)量的樣品以用于后續(xù)的抗體-agarose beads孵育對免疫沉淀實(shí)驗(yàn)是否成功非常關(guān)鍵。在這個(gè)環(huán)節(jié)中，除了要控制所有操作盡量在冰上或者4°完成外，最為關(guān)鍵的是裂解液的成份。用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的樣品一般是原代培養(yǎng)細(xì)胞裂解液或者細(xì)胞系裂解液。我們

5、以常用的RIPA裂解液為例（主要含有pH7.4左右的離子緩沖液，接近生理濃度下的NaCl,一定比例的去垢劑和甘油以及各類蛋白酶抑制劑等）來說明其各主要成份的用途，進(jìn)而幫助我們?nèi)绾吾槍Σ煌膶?shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒煌牡鞍踪|(zhì)特性來選擇最佳的裂解液。a. 緩沖液：離子緩沖液常采用pH7.4的Hepes或者Tris-Cl。b. NaCl濃度一般習(xí)慣用150 mM,這主要是因?yàn)?50 mM接近生理濃度，不會破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。然而細(xì)胞內(nèi)部的NaCl濃度并不是均一的，局部NaCl的濃度可以低到50 mM,150 mM的NaCl有可能會破壞這個(gè)區(qū)域的蛋白質(zhì)相互作用。因此裂解液配方最佳的NaCl濃度要視所分析的蛋

6、白的亞細(xì)胞定位而定。c. 甘油由于其粘性，可以對蛋白質(zhì)之間的相互作用起到一個(gè)很好的保護(hù)作用。一般添加10%的甘油有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)之間的相互作用。d. 裂解液中的去垢劑可以裂解細(xì)胞質(zhì)膜，也同時(shí)破壞了許多細(xì)胞器的膜，從而釋放了其中儲存的許多蛋白酶。而由于用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的去垢劑作用比較溫和，因此蛋白酶的活性大部分得以保存。還有一部分蛋白酶來自胞質(zhì)中，主要由于其抑制蛋白或者其活性抑制環(huán)境受到改變后從而恢復(fù)了蛋白酶活性。因此，添加蛋白酶抑制劑對于防止目的蛋白的降解從而完成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非常關(guān)鍵。一般主要通過添加EDTA抑制金屬蛋白酶，通過Protease Cocktail（多種蛋白酶抑制劑混合物）可以抑

7、制蛋白酶。e. 去垢劑對于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)尤其是免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。不同的去垢劑種類和不同的去垢劑濃度主要通過影響以下三個(gè)因素來影響免疫沉淀效果：- 細(xì)胞質(zhì)/器膜的通透性：因?yàn)樵S多目的蛋白都定位在細(xì)胞器中，所以必須先將這些蛋白釋放出來，抗體才能與之反應(yīng)。- 膜蛋白的釋放：許多膜蛋白的構(gòu)象對去垢劑種類和濃度非常敏感，因此針對這類蛋白的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，需要謹(jǐn)慎地嘗試多種去垢劑以及不同濃度。- 蛋白相互作用：不同去垢劑對不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)的相互作用影響程度不一樣，需要根據(jù)具體蛋白的特性進(jìn)行分析選擇去垢劑種類和濃度。而由于何種去垢劑適應(yīng)作用于何種蛋白質(zhì)現(xiàn)在很難精準(zhǔn)預(yù)測，所以一個(gè)更為切實(shí)可行的辦

8、法就是通過具體實(shí)驗(yàn)篩選合適的去垢劑種類和濃度。二、 抗體-agarose beads孵育裂解細(xì)胞，離心并去除不可溶的膜組份后，上清可以儲存在-80°保存3個(gè)月，但最好能夠使用新鮮制備的細(xì)胞裂解液上清去進(jìn)行抗體-agarose beads孵育實(shí)驗(yàn)。抗體可以先加入上清中與樣品孵育數(shù)小時(shí)后再加入Protein A或者G beads孵育過夜，也可以同時(shí)加入抗體和Protein A或者G beads孵育過夜。一般選擇1mg總蛋白（1mg/ml）對應(yīng)添加1 ug抗體，最高可以添加至5 ug抗體，過多的抗體會產(chǎn)生假陽性。這個(gè)步驟中關(guān)鍵因素在于選擇合適的陰性對照。一般選用加同樣量的IgG,但更為妥當(dāng)

9、的方法是選擇針對胞內(nèi)其它無關(guān)目的蛋白的一抗做對照。例如，做膜蛋白A的免疫沉淀，選擇膜蛋白B來做陰性對照，只要確認(rèn)二者之間沒有相互作用；而做胞質(zhì)可溶性蛋白C的免疫沉淀，則選擇另外一個(gè)可溶性蛋白D來做陰性對照。同時(shí)，為避免Protein A或者G beads有（非）特異性吸附從而造成免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性，一般在加入目的蛋白抗體之前，預(yù)先將Protein A或者G beads與細(xì)胞裂解液孵育數(shù)小時(shí)，然后取上清用于后續(xù)的抗體-agarose beads孵育。同時(shí)，Protein A或者G beads對不同類型的抗體親和力不同，結(jié)合一抗的種屬和Ig亞型，選擇合適的Protein A或者G beads

10、也是決定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)成功與否的一個(gè)重要因素。一般推薦使用Protein A和Protein G beads的混合物，這樣可以達(dá)到最佳實(shí)驗(yàn)效果，而且省去了許多選擇的煩惱。三、 抗體-agarose beads復(fù)合物洗滌：除了選擇特異性好的抗體以及選擇合適的陰性對照外，去除免疫沉淀實(shí)驗(yàn)非特異性的一個(gè)辦法是對抗體-agarose beads復(fù)合物進(jìn)行多次洗滌。一般洗滌緩沖液使用和裂解液一樣的配方，但去除甘油，以減少由于甘油的粘性帶來的非特異性吸附。針對不同的實(shí)驗(yàn)要求，還可以通過更改NaCl的濃度以及去垢劑的比例，種類來達(dá)到去除非特異性吸附的效果。例如，針對單純的免疫沉淀而非免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)或者雖然是進(jìn)

11、行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，但蛋白質(zhì)之間的結(jié)合比較牢靠，可以考慮使用低濃度（0.2-0.5%）的SDS洗滌抗體-agarose beads復(fù)合物，這樣可以去除絕大部分非特異性相互作用。四、 鑒定免疫沉淀實(shí)驗(yàn)用途非常廣泛（見IP: Q&A），而且基于最基本的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)衍生出了許多免疫沉淀相關(guān)實(shí)驗(yàn)手段（比如免疫共沉淀，染色質(zhì)免疫沉淀和RNA-蛋白免疫沉淀），因此，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的鑒定方法主要視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。我們在本手冊中主要簡單概述常見的免疫沉淀之后的WB檢測需要注意的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)。由于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)使用目的蛋白抗體加Protein A/G beads與樣品孵育，因此在最后離心獲得抗體-agarose b

12、eads復(fù)合物后，eppendorf管中主要含有抗體，目的蛋白，Protein A/G beads以及一些其它非特異性作用蛋白。其中，抗體和目的蛋白以及Protein A/G beads三者之間是以非共價(jià)健結(jié)合在一起，只有Protein A/G與agarose beads是共價(jià)結(jié)合在一起的。因此，最后經(jīng)過添加含巰基乙醇的加樣緩沖液以及煮沸變性并離心出去Protein A/G beads后，eppendorf管只有抗體和目的蛋白以及少量非特異性吸附蛋白。這樣SDS-PAGE中就含有目的蛋白和抗體二種蛋白，由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇從而導(dǎo)致抗體的重鏈與輕鏈之間的二硫鍵被破壞從而使得抗體分子變成重

13、鏈分子（55KD）和輕鏈分子（25KD）。因此，WB顯色反應(yīng)中除了能檢測到目的蛋白外，如果所使用的二抗與用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體分子屬于同一種屬的話，還能檢測到重鏈和輕鏈分子。通常用于免疫沉淀的抗體量非常大（1ug），所以當(dāng)目的蛋白的大小接近重鏈或者輕鏈分子時(shí)，重鏈或者輕鏈分子的WB信號常常由于信號過強(qiáng)而導(dǎo)致影響對目的蛋白的WB結(jié)果判斷。針對上述情況，通常有二種解決辦法：a. 選擇不同種屬的抗體分別進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和WB實(shí)驗(yàn)，這樣再選擇一個(gè)種屬交叉反應(yīng)比較弱或者無種屬交叉反應(yīng)的二抗進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)，就可以大大減弱重鏈和輕鏈分子的WB信號。b. 使用交聯(lián)劑將抗體和Protein A/G beads交聯(lián)

14、，然后通過添加不含巰基乙醇的加樣緩沖液處理目的蛋白-抗體-agarose beads復(fù)合物，最后離心去除抗體-agarose beads復(fù)合物，上清中只留下目的蛋白。免疫共沉淀（Co- Immunoprecipitation, Co-IP）是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌的Protein A或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。其基本原理是，在細(xì)胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于Agarose珠上的Protein A或G，若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復(fù)合物：“目的蛋白興趣蛋白抗興趣蛋白抗體Protein A或G

15、”，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復(fù)合物又被分開。然后經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜檢測目的蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的，符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的結(jié)果可信度高。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。免疫共沉淀優(yōu)點(diǎn)（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響； （3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物免疫共沉淀缺點(diǎn)（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用； （2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須

16、在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。一 原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上

17、的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。 其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。 二、準(zhǔn)備工作： 預(yù)冷PBS

18、，RIPA Buffer，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī) 1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS； 2. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1ml/107個(gè)細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶，0.5ml/5×106個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶) 3. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中，4，緩慢晃動15min（EP管插冰上，置水平搖床上） 4. 4，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中 5. 準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，

19、建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠 6. 每1ml總蛋白中加入100l Protein A瓊脂糖珠（50%），4搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景 7. 4，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除Protein A珠子 8. (Bradford 法)做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20保存一個(gè)月） 9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 g/l，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如

20、10 g/l） 10. 加入一定體積的兔抗到500l總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異 11. 4緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育 12. 加入100l Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 l"過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG） 13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍，800l/遍，RIPA buffer有時(shí)候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合

21、物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS 14. 用60l 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 l足夠上三道） 15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時(shí)凍-20，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min變性。 RIPA Buffer配制： 基礎(chǔ)成分： Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性） NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集） NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液） 去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液；避光保存） 注意：

22、準(zhǔn)備激酶（致活酶）實(shí)驗(yàn)時(shí)，不要加去氧膽酸鈉，因?yàn)殡x子型去污劑能夠使酶變性，導(dǎo)致活性喪失。 RIPA蛋白酶抑制劑 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲存液，室溫保存） EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲存液，PH 7.4） 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20保存） 胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20保存） RIPA磷酸（酯）酶抑制劑 激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的儲

23、存液，見Sodium Orthovanadate Activation Protoco） NaF（200mM的儲存液，室溫保存） 注意：在準(zhǔn)備做磷酸（酯）酶實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，不加磷酸酯酶抑制劑 工作液配制： 配制100ml的modified RIPA buffe： 1. 稱取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調(diào)節(jié)PH值到7.4 2. 加10 ml 10%的NP-40 3. 加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清 4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8保存 5. 理論上，蛋白

24、酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時(shí)加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑各100 l; PMSF, Na3VO4, NaF各500 l），但是PMSF在水溶液中很不穩(wěn)定，30分鐘就會降解一半，所以PMSF應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天。 各種成分在工作液中的終濃度： * Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 * NP-40: 1% * 去氧膽酸鈉：0.25% * NaCl: 150 mM * EDTA: 1 mM * PMSF: 1 mM * 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制劑: 各1 g/ml * Na3VO4: 1 mM * NaF: 1 mM 三

25、、實(shí)驗(yàn)流程為： （1）轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細(xì)胞裂解液于4°C， 最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1g相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜； （3）取10l protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離心3 min； （4）將預(yù)處理過的10l protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細(xì)胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；

26、（5）免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗34次；最后加入15l的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘； （6）SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析。通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白 1用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。 2將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4以最大速度離心15 min。 3收集上清（約30 ml）并加入30g的適當(dāng)抗體，4搖動免疫沉淀物1 h。 4加入

27、0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4搖動免疫沉淀物30 min。 5用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。最后，用NETN洗一次。 6吸出混合物的液體部分。加入800l的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min。 7將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過夜。 8通過考馬斯藍(lán)染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。 9從膠上切下目標(biāo)帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。 10 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。 11 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將

28、收集的肽在ABI 477A或494A機(jī)器上進(jìn)行自動Edman降解測序。 四、注意的問題： （1）細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2SDS)，細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的 cocktailer。 （2）使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用 （3）使用對照抗體： 單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗 兔多克隆抗體：正常兔IgG 在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中要保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： (1) 確保共沉淀的蛋白

29、是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生； (2) 要確保抗體的特異性，即在不表達(dá)抗原的細(xì)胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀； (3) 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原

30、理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且，CHIP與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見

31、，隨著CHIP的進(jìn)一步完善，它必將會在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。 染色體免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來的方法，也稱結(jié)合位點(diǎn)分析法，在過去十年已經(jīng)成為表觀遺傳信息研究的主要方法。這項(xiàng)技術(shù)幫助研究者判斷在細(xì)胞核中基因組的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。近年來，這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性，是深入分析癌癥、心血管疾病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的主要代謝

32、通路的一種非常有效的工具。染色質(zhì)免疫共沉淀原理它的原理是在保持組蛋白和DNA聯(lián)合的同時(shí)，通過運(yùn)用對應(yīng)于一個(gè)特定組蛋白標(biāo)記的生物抗體，染色質(zhì)被切成很小的片斷，并沉淀下來。IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“prorein A”特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的。實(shí)驗(yàn)最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說明書。特別是

33、多抗的特異性是問題。其次，要注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。再次，為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次實(shí)驗(yàn)之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過

34、多則抗原被稀釋。ChIP的一般流程ChIP的一般流程： 甲醛處理細(xì)胞-收集細(xì)胞，超聲破碎-加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合-加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀-對沉淀下來的復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合-洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物-解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷-PCR分析。 在PCR分析這一塊，比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實(shí)就是用ChIP的方法研究細(xì)胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合，具體方法和ChIP差不多，只是實(shí)驗(yàn)過

35、程中要注意防止RNase，最后分析的時(shí)候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實(shí)就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基礎(chǔ)上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據(jù)公司的要求來準(zhǔn)備樣品）。 具體操作流程： 第一天： （一）、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。 1、取出1平皿細(xì)胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養(yǎng)基共有9ml）。 2、37攝氏度孵育10min。 3、終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中?；靹蚝螅谑覝叵路胖?min即可。 4、吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS

36、清洗細(xì)胞2次。 5、細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預(yù)冷后2000rpm 5min收集細(xì)胞。 6、倒去上清。按照細(xì)胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2×106個(gè)細(xì)胞。這樣每100ul溶液含1×106個(gè)細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。假設(shè)MCF7長滿板為5×106個(gè)細(xì)胞。本次細(xì)胞長得約為80%。即為4×106個(gè)細(xì)胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800ul。 7、超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5S沖擊，9S間隙。共14次

37、。 （二）、除雜及抗體哺育。 8、超聲破碎結(jié)束后，10，000g 4oC離心10min。去除不溶物質(zhì)。 留取300ul做實(shí)驗(yàn)，其余保存于-80oC。 300ul中，100ul加抗體做為實(shí)驗(yàn)組；100ul不加抗體做為對照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M），65oC處理3h解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。 9、在100ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。 再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC顛轉(zhuǎn)混勻1h。 10、1h后，在4oC靜置10min沉淀

38、，700rpm離心1min。 11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul抗體，另一管中則不加抗體。4oC顛轉(zhuǎn)過夜。 （三）、檢驗(yàn)超聲破碎的效果。 取100ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4ul5MNaCl，65oC處理2h解交聯(lián)。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。 第二天： （一）、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗。 12、孵育過夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC顛轉(zhuǎn)2h。 13、4oC靜置10min后，700rpm離心1min。除去上清。 14、依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4oC顛轉(zhuǎn)10min，4oC靜置10min沉淀，700rpm離心1min，除去上清。 洗滌溶液：a.low salt wash buffer-one wash b.highsalt wash buffer-one wash c.LiCl wash buffer-one wash d.TE buffer-two wash 15、清