中藥指紋圖譜建立的原則和步驟參考模板

1、（一）建立指紋圖譜的一般原則中藥指紋圖譜的建立，應(yīng)以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究和藥理學(xué)研究為依托，體現(xiàn)系統(tǒng)性、特征性和穩(wěn)定性三個(gè)基本原則。唯此，才能保證指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、客觀化，從而便于推廣和應(yīng)用。1.系統(tǒng)性  是指指紋圖譜中反映的化學(xué)成分應(yīng)包括該中藥有效部位所含大部分成分，或指標(biāo)性成分的全部，如中藥兩頭尖中抗腫瘤的有效成分為皂苷類化合物，則其指紋圖譜應(yīng)盡可能地反映其中的皂苷類成分；銀杏葉的有效成分是黃酮類和銀杏內(nèi)酯類，則其指紋圖譜可采用兩種方法，針對這兩類成分分別分析，達(dá)到系統(tǒng)全面的目的。2.特征性  是指指紋圖譜中反映的化學(xué)信息（如保留時(shí)間）應(yīng)具有較

2、強(qiáng)的選擇性，這些信息的綜合結(jié)果，將能特征性地區(qū)分中藥的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，成為中藥自身的“化學(xué)條碼”。如北五味子的HPLC指紋圖譜和TLC指紋圖譜，不僅包括多種的五味子木脂素類成分，而且具有許多未知類成分，這些成分的峰位順序、比值在一定范圍內(nèi)是固定的，并且隨藥材品種不同而產(chǎn)生差異，依此可以很好地區(qū)別其來源、產(chǎn)地，判別藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣。3.穩(wěn)定性  是指所建立的指紋圖譜在規(guī)定的方法、條件下的耐用程度，即不同操作者、不同實(shí)驗(yàn)室所重復(fù)做出的指紋圖譜應(yīng)在所允許的誤差范圍內(nèi)，以體現(xiàn)其通用性和實(shí)用性。因而要求包括樣品制備、分析方法、實(shí)驗(yàn)過程、數(shù)據(jù)采集、處理、分析等全過程都要規(guī)范化操作，同時(shí)，還應(yīng)

3、建立相應(yīng)的評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)，對其進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。（二）建立指紋圖譜的一般步驟1.方案設(shè)計(jì)與思路（1）研究對象的確定    在調(diào)研有關(guān)文獻(xiàn)、新藥申報(bào)資料(質(zhì)量部分和工藝部分)及其它研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，盡可能的詳盡地了解藥材、中間體及成品中所含成分的種類及其理化性質(zhì)，綜合分析后找出成品中的藥效成分或有效成分，作為成品和中間體指紋圖譜的研究對象，即分析檢測目標(biāo)。例如，黃芪含黃酮、皂苷及多糖三類有效組分，黃芪多糖注射液及其中間體的指紋圖譜則以多糖為研究對象，黃芪原藥材的指紋圖譜應(yīng)把黃酮、皂苷及多糖作為研究對象。 復(fù)方注射劑應(yīng)根據(jù)君臣佐使的原則，以君藥、臣藥中的有效成分作為指紋圖譜的研

4、究對象，佐使藥中的成分可采用其它指紋圖譜方法進(jìn)行輔助、補(bǔ)充研究。（2）研究方法的選擇    研究方法應(yīng)根據(jù)研究對象的物理化學(xué)性質(zhì)來選擇。大多數(shù)化合物可采用HPLC。例如黃芪中黃酮、皂苷、多糖等。揮發(fā)性成分應(yīng)采用GC。例如魚腥草中的魚腥草素、土木香中的土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯和二氫土木香內(nèi)酯等。某些有機(jī)酸經(jīng)甲酯化后亦可用GC分析。采用上述方法難以分離檢測的成分，可考慮使用TLC和CE。    一個(gè)中藥制劑的指紋圖譜可以同時(shí)采用多種方法進(jìn)行研究。選擇方法時(shí)，還需考慮藥品檢驗(yàn)系統(tǒng)復(fù)核時(shí)的設(shè)備、技術(shù)等因素。（3）研究內(nèi)容根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局中藥注射劑指紋圖

5、譜研究的技術(shù)要求(暫行)的規(guī)定，主要研究內(nèi)容有原藥材、中間體、注射劑的指紋圖譜，涉及樣品名稱、來源、制備、測定方法、指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)等。2.樣品的收集    這是最初也是最關(guān)鍵的步驟。至少要收集10個(gè)批次樣品。注意樣品的代表性。    (1)切不可將同一批次樣品分散成數(shù)個(gè)批次，充當(dāng)樣品。(2)原藥材盡可能固定產(chǎn)地(GAP基地藥材，地道藥材)、采收期和炮制方法。對光線穩(wěn)定，療效穩(wěn)定，無臨床不良反應(yīng)的藥材批次應(yīng)重點(diǎn)選擇。   (3)中間體、注射劑樣品的收集應(yīng)重點(diǎn)選擇工藝穩(wěn)定、療效穩(wěn)定、無不良反應(yīng)的批次。    (4)

6、留樣應(yīng)不少于實(shí)驗(yàn)用量的3倍。3.供試品溶液的制備(樣品的預(yù)處理)（1）藥材供試液的制備    根據(jù)所含成分的理化性質(zhì)，通過溶劑提取、液液萃取、沉淀、吸附等方法，分離富集樣品。例如，黃芪中黃酮類成分通過堿的萃取、皂苷類通過大孔吸附樹脂吸附；苦參中總生物堿通過陽離子交換樹脂分離；揮發(fā)性樣品常用水蒸氣蒸餾法制備。    樣品富集后，還需通過氧化鋁預(yù)柱、C18預(yù)柱、硅膠預(yù)柱、聚酰胺預(yù)柱等，除去色素等雜質(zhì)，最后通過微孔濾膜，供HPLC測試。（2）中間體供試液制備可針對有效成分處理，并參照原藥材的制備方法。 （3）注射劑供試液制備液體注射劑一般無需特殊處理

7、，可直接分析檢測。4.參照物的選擇一般選取樣品中容易獲得且含量較高的一個(gè)主要活性成分或指標(biāo)成分作為參照物（S）。參照物主要用于指紋圖譜技術(shù)參數(shù)的確定，如特征峰(共有峰)的相對保留時(shí)間，峰面積比值等。并有助于圖譜的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性的考查。例如三七藥材的指紋圖譜中以三七皂苷R1為參照物。由于指紋圖譜比較復(fù)雜，內(nèi)標(biāo)物不易選擇、插入，故一般不以內(nèi)標(biāo)物做為參照物。5.實(shí)驗(yàn)方法和條件的選擇其目的是通過比較實(shí)驗(yàn)，從中選取相對簡便易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征的指紋圖譜，以滿足指紋圖譜的專屬性、重現(xiàn)性和普遍適用性的要求。方法和條件須經(jīng)過嚴(yán)格的方法學(xué)考察。例如穩(wěn)定性試驗(yàn)，精密度試驗(yàn)，重現(xiàn)性試驗(yàn)等。

8、0;  注意事項(xiàng)：供試液的制備和色譜分析時(shí)均須定量操作，以保證圖譜在整體特征上進(jìn)行半定量(差異程度或相似程度)的比較。指紋圖譜分析不同于含量測定，提高其分離度應(yīng)以不犧牲色譜的整體特征為前提，故不應(yīng)孤立地苛求分離度達(dá)到含量測定的要求。采用HPLC和GC制定指紋圖譜，記錄時(shí)間一般為1小時(shí)。(實(shí)測2小時(shí))6.對照指紋圖譜及其技術(shù)參數(shù)的建立(1)測得的大量色譜數(shù)據(jù)需經(jīng)分析和數(shù)據(jù)處理，才能獲得對照指紋圖譜(擬合指紋圖譜)及其技術(shù)參數(shù)，以此作為藥品指紋圖譜檢驗(yàn)的依據(jù)。(2)技術(shù)參數(shù)主要包括總峰面積、共有峰序號(hào)、參照峰(S)、共有峰相對保留時(shí)間(RRT)，共有峰峰面積比(RA)，非共峰面積等。RR

9、T=RTi/RTs     RA=Ai/As共有峰亦稱特征峰（包括參照峰），系指所有被檢批次中均含有的相同色譜峰，主要來源于樣品中主要有效成分或指標(biāo)成分。共有峰的化學(xué)歸屬，可采用對照品加入法或HPLC/DAD/MS/MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行鑒別，后者可在無對照品的情況下使用。       例復(fù)方丹參注射液指紋圖譜應(yīng)有9個(gè)特征峰    相對保留時(shí)間分鐘(峰序號(hào))：0145(1)  0186(2)  0298(3)  0378(4)

10、60; 0425(5)  0499(6)  0594(7)  1000(s原兒茶醛)  1145(8)      峰面積比值：0059(1)  0064(2)  0036(3)  0.112±30(4) 0054(5)  0297±25(6)  0055(7)  1000(s原兒茶醛)  0040(8)7.藥材、中間體和注射劑指紋圖譜的相關(guān)性注射劑中各特征峰均可在藥材及中間體指紋圖譜中得到追蹤，中間體與注射劑的指紋圖譜應(yīng)非常接近，藥材圖譜中的色譜峰應(yīng)比注射劑多。必要時(shí)可采用加入某一藥材、有效部位或中間體的供試品，或制備某一藥材、有效部位或中間體陰性供試品的方法，標(biāo)定各指紋圖譜之間的相關(guān)性。提供相關(guān)性研究的指紋圖譜。8.指紋圖譜的評(píng)價(jià)中藥指紋圖譜的評(píng)價(jià)系指將樣品指紋圖譜與建立起來的對照指紋圖譜進(jìn)行相似性比較，從而對藥品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)和控制。    中藥指紋圖譜的評(píng)價(jià)不同于含量測定，它強(qiáng)調(diào)的是相似