硫酸軟骨素的提取和純化的研究進(jìn)展

1、硫酸軟骨素的提取和純化的研究進(jìn)展欒允光赤峰學(xué)院化學(xué)系，赤峰024000摘要介紹了硫酸軟骨素的來源、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其生理功能，對(duì)硫酸軟骨素的提取方法中性鹽法、 堿提取法、 酶提取法、 超聲波法乙酸抽提法和純化方法溶劑法、季銨鹽化合物沉淀法、超濾膜法、色譜法電泳法的具體工藝路線及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞：硫酸軟骨素；提?。患兓?硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate)是一種酸性粘多糖，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的軟骨、喉骨、鼻骨和氣管中。硫酸軟骨素是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替連結(jié)而成的雙糖聚合物，它通常與蛋白質(zhì)結(jié)合成糖蛋白的形式存在，當(dāng)其水解時(shí)發(fā)生消去反應(yīng)，連接硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)中絲氨酸羥基的

2、苷鍵斷裂，可以得到游離態(tài)的硫酸軟骨素。硫酸軟骨素為白色或微黃色粉末,具有吸濕性，易溶于水而成粘度較大的溶液，難溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有機(jī)溶劑，并且遇熱不穩(wěn)定，乙酰基易發(fā)生水解脫落,在酸性條件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。硫酸軟骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎癥及抗腫瘤等生理活性，臨床上可用于預(yù)防動(dòng)脈粥狀硬化、提高機(jī)體免疫力、治療風(fēng)濕病和腎炎及由鏈霉素引起的聽覺障礙。硫酸軟骨素與銅等金屬離子結(jié)合可用于治療皮膚病，與硝酸鉍或氫氧化鋁反應(yīng)得到的絡(luò)合物可用于治療消化性潰瘍，與苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉劑。作為食品添加劑，硫酸軟骨素可用于食品的乳化、保濕和祛

3、除異味。在化妝品中添加硫酸軟骨素，可調(diào)節(jié)皮膚的細(xì)胞代謝，促進(jìn)營養(yǎng)的吸收，保持皮膚的水分和改善發(fā)質(zhì)。1,2,31 硫酸軟骨素的提取1.1 中性鹽法先用10%氯化鈣提取，氯仿-戊醇（1：4）除去蛋白質(zhì)，2倍量乙醇沉淀，最后以Lloyd 試劑精制。而以透析法除雜質(zhì)、氯化六氨合鈷純化，或一磷鎢酸純化，均可使工藝簡化。以30%氯化鉀或30%氯化鉀加1%碳酸鉀提取，高嶺土吸附除去雜蛋白，可提高產(chǎn)品收率。該方法提取的產(chǎn)品較白，各項(xiàng)指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)，也不會(huì)造成環(huán)境污染，但是產(chǎn)率較低，造成原材料的大量浪費(fèi)，對(duì)經(jīng)濟(jì)效益有一定的影響。1.2 堿提取法（1）濃堿提取工藝 將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質(zhì)量1.5倍的

4、15%氫氧化鈉溶液，室溫下進(jìn)行浸提1216h（分兩次進(jìn)行），然后用鹽酸調(diào)pH到2.83.2，雙層紗布過濾30min，留下濾液。 將濾液調(diào)節(jié)pH 到8.59.0，按骨質(zhì)量的4%加入胰蛋白酶，于5054水解6h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 到6.5，升高溫度到8090，加入活性炭進(jìn)行脫色反應(yīng)，然后過濾，在濾液中加入1.5 倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀分層4h，所得沉淀即為硫酸軟骨素，在60下干燥即得最終產(chǎn)品，其產(chǎn)率較高。（2）稀堿提取工藝將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質(zhì)量6倍的2%氫氧化鈉溶液，60下進(jìn)行浸提24 h（分兩次進(jìn)行），然后用鹽酸調(diào)pH 到2.53.0，雙層紗布過濾，留下濾液。將濾液調(diào)節(jié)pH 到8.

5、59.0，按骨質(zhì)量的4 %加入胰蛋白酶，于5054水解7 h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 到57，升高溫度到8090，加入0.5 %活性炭進(jìn)行脫色反應(yīng)，然后過濾，在濾液中加入1.5倍體積的無水乙醇和1.5%的氯化鈉溶液進(jìn)行沉淀分層6h 。所得沉淀再次加入1.5%的氯化鈉溶液和3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，所得即為硫酸軟骨素，然后在6065下干燥即得最終產(chǎn)品，其產(chǎn)率較高。（3）稀堿稀鹽提取工藝將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入均為骨質(zhì)量6倍的0.5%氫氧化鈉和2%的NaCl 混合溶液，室溫下進(jìn)行浸提30h（分兩次進(jìn)行），然后用鹽酸調(diào)pH 到8.59.0，加入骨質(zhì)量4%的胰蛋白酶進(jìn)行水解。 水解后升溫到8090，加

6、入骨質(zhì)量1.5%的滑石粉，過濾；加入1.7倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，過濾后再加入1.5%的氯化鈉溶液進(jìn)行沉淀過濾；加入1.7 倍體積的無水乙醇再次進(jìn)行沉淀過濾，所得沉淀物于60 下干燥即得最終產(chǎn)品，其產(chǎn)率相對(duì)較高。（4）稀堿濃鹽提取工藝將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質(zhì)量5倍的0.4%氫氧化鈉和20%的氯化鈉混合溶液（pH為13），室溫下進(jìn)行浸提30h（分兩次進(jìn)行），用鹽酸調(diào)pH到7.8，升溫到8090，加入骨質(zhì)量4%的滑石粉，將鹽解液調(diào)節(jié)pH到23，過濾1h，將濾液加入1.5倍體積的水進(jìn)行稀釋，同時(shí)調(diào)節(jié)pH到6.5，加入1.7倍體積的無水乙醇沉淀12h，將沉淀物加入1.5%的氯化鈉溶液進(jìn)行沉

7、淀過濾，加入1.7倍體積的無水乙醇再次沉淀8h，所得沉淀物于60下干燥即得最終產(chǎn)品，其生產(chǎn)周期長但產(chǎn)率較高。以上4種工藝路線制得的硫酸軟骨素含量和氨含量都符合原料藥的要求。但是，這4種路線都存在有缺陷：采用稀堿溫和條件下制備的樣品溶液混濁，且時(shí)間長，污染嚴(yán)重，其原因在于該條件下軟骨中的膠原蛋白、黏蛋白等不能完全水解，且它在中性鹽和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去。最主要的是這些工藝的生產(chǎn)周期都太長，極大地限制了工廠的生產(chǎn)效益和經(jīng)濟(jì)效益。1.3 酶提取法（1）稀堿-酶解提取法鄒開朗等4提出稀堿與酶解相結(jié)合法生產(chǎn)硫酸軟骨素。先將軟骨在80水中煮46h，然后按原料（干質(zhì)量）與2%氫氧化鈉的比例

8、為16.25的量加入氫氧化鈉溶液，室溫提取1.5h，然后用鹽酸調(diào)pH到66.5，雙層紗布過濾；留下濾液，濾渣再以10.12 的質(zhì)量比加入2%的氫氧化鈉溶液，于40下提取lh，再用雙層濾布過濾；棄濾渣，取濾液。合并2次濾液，并測量體積待用。濾液調(diào)節(jié)pH到8.09.0，按濾液與胰酶10000.5的比例加入胰酶，于4050水解lh 后，再按10000.5的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，4050水解1.5 h，過濾后加入高嶺土和活性炭吸附。用氯仿反萃取法萃取濾液，留水層。 調(diào)水層pH至6.87.2，再加入2.5倍體積的95%以上乙醇沉淀，即得硫酸軟骨索。該工藝用氯仿反萃取的方法純化硫酸軟骨素，與其他提取方法相比

9、較，縮短了一半工藝流程，同時(shí)提高了純度和提取率，又減輕了堿法提取所帶來的環(huán)境污染。Lignot B 等在干軟骨與水的料液比為9100的體系中加入2.0g酶制劑（Lypaine 酶），酶解條件為pH3.5，溫度65，酶解3h，可得到純度為31%的硫酸軟骨素。馬淑濤等5將冷凍的新鮮豬喉骨用稀堿溶液提取后，使用原料量的0.15%的胰酶，在pH為8.59.0、溫度為50的條件下進(jìn)行酶解，得到含氮量僅為3.16 %的提取物。奚俊等6采用稀堿法提取家畜的鼻骨和氣管中的硫酸軟骨素，按原料量的0.05%加入胰酶和木瓜蛋白酶，當(dāng)酶解溫度為4050，pH分別為8.08.5和5.76.1時(shí)，可得到含氮量僅為3.5%

10、的提取物。（2）濃堿-復(fù)合酶酶解提取法該法的實(shí)驗(yàn)流程與稀堿酶解法基本一樣，只是在堿解這一步增大了堿的濃度。高華等7應(yīng)用該法生產(chǎn)了硫酸軟骨索，研究得出優(yōu)化的試驗(yàn)條件。 堿提取的最佳條件是按軟骨與1 mol/L氫氧化鈉溶液質(zhì)量比12混合，溫度控制在45，攪拌提取2h。復(fù)合酶酶解工藝的適宜條件為按復(fù)合蛋白酶與料液11000的質(zhì)量比加入蛋白酶，控溫4050，保持溶液pH 8.59.0，水解4h。在最佳試驗(yàn)條件下，得到硫酸軟骨素為白色粉末，產(chǎn)品純度達(dá)95.2 %，收率為32.6%。該工藝提高了產(chǎn)品純度和收率，降低了生產(chǎn)成本。（3）復(fù)合酶酶解提取法王鳳琴等8用復(fù)合酶解法提取硫酸軟骨素。把豬肋、喉、氣管等軟

11、骨預(yù)處理后，以骨粉13的比例加入去離子水，加入原料量1%的復(fù)合酶，于55攪拌酶解1215 h。復(fù)合酶水解液用鹽酸調(diào)pH7.5，加入2%的醋酸鈉溶液，攪拌溶解后，升溫到85，保溫20min，過濾去殘?jiān)?。濾液加入胰酶酶解. 經(jīng)酶解后的酶解液在85下維持15min，過濾，乙醇沉淀，干燥磨粉后得成品。影響該工藝水解反應(yīng)的因素為酶解溫度、pH值與加酶量，利用正交試驗(yàn)得出優(yōu)化條件為溫度50、pH 8.68.9、加酶量039L，收率達(dá)17.84%。采用全新的雙酶酶解工藝和中空纖維超濾等現(xiàn)代技術(shù)生產(chǎn)硫酸軟骨素，由于酶作用專一性強(qiáng)的特點(diǎn)，質(zhì)量穩(wěn)定、收率高，產(chǎn)品顏色潔白，生產(chǎn)周期較短。（4）酶解-樹脂提取法9將鯨

12、魚軟骨絞碎，加1mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡，40保溫水解2 h或加pH為7.5的水浸泡，用蛋白酶55保溫水解20h，再加鹽酸中和至近中性，過濾，調(diào)整濾液中NaCl 濃度達(dá)到0.5mol/L后，將溶液通過離子交換樹脂柱吸附完畢，用0.5 mol/L的NaCl 液洗滌，再用1.8mol/L 的氯化鈉液洗脫，流速2L/h，洗脫液脫鹽，乙醇沉淀，離心分離，收集沉淀，真空干燥，即得成品。應(yīng)用此工藝制得的硫酸軟骨素樣品，經(jīng)紙電泳檢查為單一區(qū)帶，抗原物質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果為陰性，含硫量為7.2%。其優(yōu)點(diǎn)是酶水解或稀堿水解與樹脂交換技術(shù)相結(jié)合，保證了硫酸軟骨素分子不降解，解決了成品純度的問題。目前，國內(nèi)各生產(chǎn)廠家常選

13、用酶解法進(jìn)行硫酸軟骨素的制備。這種方法相對(duì)來說產(chǎn)率較高，純度也較高，生產(chǎn)周期較短，且對(duì)環(huán)境污染較小，是比較理想的制備方法。1.4 超聲波法蒲志軍等10利用超聲波法制備硫酸軟骨素，其原理是在堿性條件下蛋白質(zhì)易離解和超聲波的熱學(xué)機(jī)制促使蛋白質(zhì)快速解離而達(dá)到去雜蛋白的目的，升溫（8590）均能使解離的蛋白質(zhì)變性吸附到白陶土上，從而使硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)分離，提高產(chǎn)品質(zhì)量。以豬喉骨為原料，在對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理后，使用超聲波手段進(jìn)行稀堿抽提，浸出液再用超聲波二次處理使雜蛋白解離，經(jīng)白陶土和活性炭去雜脫色，酒精沉淀后，干燥即得合格的硫酸軟骨素。用該工藝方法提取、除雜時(shí)間約需3 h，大大縮短了生產(chǎn)周期，節(jié)約了生產(chǎn)

14、成本（不使用酶），而且提取和除雜過程無需加熱，操作起來比較簡便。但是該工藝在抽提過程中，超聲波處理時(shí)間不能太長，否則很多雜質(zhì)會(huì)跟著離解出來，從而增加去除雜質(zhì)的難度，并使產(chǎn)品的色澤和質(zhì)量達(dá)不到要求，且該工藝收率偏低，限制其在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用。1.5 乙酸抽提法利用乙酸水溶液提取硫酸軟骨素。先把鮮軟骨上的脂肪、肉及其他軟組織去掉，在-20冷凍，使用前在4解凍。把軟骨放在水中，用乙酸調(diào)節(jié)pH為4.5，在37下抽提7h。抽提液沸騰濃縮后，在90下干燥即得硫酸軟骨素粗品。影響硫酸軟骨素浸出率的主要影響因素是pH 值。該工藝流程簡單，成本較低，可以考慮商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。但是目前在國內(nèi)還沒有廠家用這種工藝生

15、產(chǎn)硫酸軟骨素。在上述提取方法中，中性鹽法的產(chǎn)品得率太低，經(jīng)濟(jì)效益不高。堿提取法制得的硫酸軟骨素含量和氨含量都符合原料藥的要求。但是，采用稀堿溫和條件下制備的樣品溶液混濁，且時(shí)間長，污染嚴(yán)重，其原因在于該條件下軟骨中的膠原蛋白、黏蛋白等不能完全水解，且它在中性鹽和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去。最主要的是這些工藝的生產(chǎn)周期都太長，極大地限制了工廠的生產(chǎn)效益和經(jīng)濟(jì)效益。酶解法相對(duì)來說產(chǎn)率較高，純度也較高，生產(chǎn)周期較短，且對(duì)環(huán)境污染較小，是比較理想的制備方法。但應(yīng)用酶解法制備出來的產(chǎn)品很多還不能滿足出口質(zhì)量要求，所以還需要對(duì)制備方法進(jìn)行改進(jìn)，以適應(yīng)國外的需求。2 硫酸軟骨素的純化2.1 溶劑

16、法溶劑法是利用軟骨中不同化學(xué)成分的溶解性差異，而將硫酸軟骨素與其他雜質(zhì)相互分離的純化方法。馬淑濤等調(diào)節(jié)硫酸軟骨素溶液pH為5.06.0后加入氯化鈉至其濃度為1.5 %(m/v)，再加入乙醇至其濃度為6070%，可得到純度為7078%的硫酸軟骨素。Nicola V 將硫酸軟骨素溶于濃度為2%(m/v)的氯化鈉溶液中，加入少量乙醇，于低溫下靜置后離心，將其上清液中再加入少量乙醇，重復(fù)以上步驟，可依次得到較高純度的硫酸軟骨素。采用甲醇或丙醇時(shí)，也可得到同樣的效果。2.2 季銨鹽化合物沉淀法硫酸軟骨素在溶液中以聚陰離子形式存在，與季銨鹽化合物(如溴化十六烷基三甲銨或氯化十六烷基吡啶等)可形成水溶性很小

17、的季銨鹽絡(luò)合物。這些絡(luò)合物在低離子強(qiáng)度的水溶液中不溶解，但當(dāng)其增大到臨界離子強(qiáng)度時(shí)，可發(fā)生解離并溶解，利用該性質(zhì)可使硫酸軟骨素得到純化。該純化法一般需要控制硫酸軟骨素的濃度為0.11.0%(m/v)，濃度過高，會(huì)使季銨鹽化合物與其中的雜質(zhì)發(fā)生沉淀反應(yīng)。Kazuaki K等采用濃度為5mg/mL 的氯化十六烷基吡啶純化10g/mL500g/mL的硫酸軟骨素，當(dāng)溶液中硫酸鈉的濃度增加到0.1mol/ L時(shí)，硫酸軟骨素的沉淀量達(dá)到最大。該法最低可沉淀濃度為5g/ mL 的硫酸軟骨素，一般用來定量檢測血清和尿液中的硫酸軟骨素。2.3 超濾膜法超濾膜法是利用濾膜孔徑的不同使硫酸軟骨素與其它非多糖類雜質(zhì)分

18、開，而得到分子量分布范圍較窄且純度較高的硫酸軟骨素的方法。LignotB等采用管形的三氧化二鋁膜純化硫酸軟骨素，其濾膜的孔徑分別為100 nm、50 nm、20 nm ，溶液的透過速度分別為90L/h·m²、60 L/ h·m²、43 L/ h·m² ，其硫酸軟骨素的截流率均為100%，雜質(zhì)透過率分別為50%、65%、70% 。電場強(qiáng)化超濾是利用硫酸軟骨素在電場作用下發(fā)生電泳而離開膜表面，從而有利于雜質(zhì)透過膜被除去。聲場強(qiáng)化超濾是利用其具有的攪拌作用和產(chǎn)生的空化效應(yīng)，使膜表面沉積的硫酸軟骨素濃度降低，從而提高雜質(zhì)的透過率。陳健等11采

19、用聲場和電場強(qiáng)化超濾對(duì)硫酸軟骨素的純化研究表明，單獨(dú)使用聲場強(qiáng)化超濾，硫酸軟骨素的平均截流率為77.156% ，較之未加聲場超濾提高1.41%，單獨(dú)使用電場強(qiáng)化超濾，硫酸軟骨素的平均截流率為88.108%，較之未加電場超濾提高了15.17%；同時(shí)使用聲場和電場強(qiáng)化超濾，硫酸軟骨素的平均截流率可達(dá)93.16%，較之單純超濾提高了21.81%。2.4 色譜法離子交換色譜法是依靠庫侖力的作用將物質(zhì)吸附在交換劑上，然后選用合適的洗脫劑進(jìn)行洗脫，達(dá)到其純化的目的。常用于硫酸軟骨素純化的陰離子交換劑有樹脂、纖維素和葡聚糖凝膠等。Ranhakrishnamurthy B等采用強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂，洗脫體系為

20、硼酸和02.0mol/L的氯化鈉溶液,流速2.0mL/min，柱溫55,壓力1.53.4kg/cm²，當(dāng)氯化鈉濃度為1.5mol/L 時(shí)，可得到純度較高的硫酸軟骨素，回收率為85% 。Nicola V采用弱堿型纖維素柱(10mm×80mm)，先用0.5mol/L的氯化鈉溶液平衡柱子，上樣后依次用12mL 0.5mol/L 和10mL 3mol/L的氯化鈉溶液進(jìn)行分級(jí)洗脫，可得到純度較高的硫酸軟骨素。Hidemit su U 等采用中強(qiáng)堿型交聯(lián)葡聚糖凝膠(A250)柱純化硫酸軟骨素，其洗脫體系為0.51.0mol/L的氯化鈉溶液，可得到硫酸軟骨素的純化物。Bohn R等采用1

21、%氯化十六烷基吡啶平衡纖維素柱后，用0.5mol/L的氯化鎂洗脫，可得到回收率為78%的硫酸軟骨素純品。Roger CM等采用高效液相色譜法( Bondapak cyano柱,3.9mm×300mm) 純化硫酸軟骨素，其流動(dòng)相為甲醇/四甲基氫氧化銨(0.02mol/L，pH 3.0)(32，v/v)，流速為210mL/min，上樣量為30250g，可得到純度為98%的硫酸軟骨素，其回收率高達(dá)97%以上，F(xiàn)alshaw R 等將2g磺化的硫酸軟骨素試樣于強(qiáng)酸型陰離子交換樹脂柱中，用水洗脫，收集液用1.0mol/L的氫氧化鈉溶液中和，可得到1.5g的硫酸軟骨素鈉鹽。2.5 電泳法Hann

22、a W 等采用雙向電泳法純化硫酸軟骨素，第一相電泳條件為pH 6.0的吡啶/醋酸/ 水(10189，v/v)緩沖液，電場強(qiáng)度7.5V/cm²，電泳60min；第二相電泳條件為pH7.7 的醋酸鋇緩沖液，電場強(qiáng)度為7.5 V/cm²，電泳130 min，得到純度為82%的硫酸軟骨素。Nicola V采用瓊脂糖凝膠電泳(50mm×70mm ，45mm厚)，電泳條件為0.05mol/L 的1，22二氨基丙烷緩沖液(醋酸調(diào)pH 至9.0)，電流為50mA，電泳80min，可得到純度為90%的硫酸軟骨素，但其回收率僅為45%。Nicola V 采用硝化纖維素膜電泳(60mm

23、×100mm ，孔徑0.45m)，加樣量為1.010.0g，電泳條件為0.1mol/L的醋酸鋇緩沖液，泳動(dòng)度為5.75×1023cm/ A·min ，電泳40min ，可得到純度為100%的硫酸軟骨素，其回收率也為100%。3 問題與展望隨著硫酸軟骨素生物活性的不斷被揭示和其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展，對(duì)其需求量越來越大，精細(xì)化程度的要求也越來越高。目前，國內(nèi)有關(guān)硫酸軟骨素的提取主要采用酶解法，其產(chǎn)率較高，純度也較高，生產(chǎn)周期較短，且對(duì)環(huán)境污染較小。對(duì)于純化按照不同的標(biāo)準(zhǔn)采用不同的方法，可得到不同純度的硫酸軟骨素。現(xiàn)今，硫酸軟骨素的提取和純化雖然已取得了一定的研究成果，但

24、應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)還有許多需要改進(jìn)和完善之處。致謝：感謝高玲老師長期以來的細(xì)心指導(dǎo)，同時(shí)也感謝在座老師在百忙中參加我的論文答辯。參考文獻(xiàn)：1金春雪，上官進(jìn)。銀杏葉中黃酮甙類化合物的提取與初步分離。信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1998，(2)：186-1872陳沖，羅思齊。銀杏葉提取物的生產(chǎn)工藝研究。中草藥，1997，28 (7)：4023歐陽平，張高勇，康保安。類黃酮提取的基本原理、 影響因素和傳統(tǒng)方法。中國食品添加劑，2003，5：54-574鄒開朗，鄒國林。 硫酸軟骨素快速提取法研究J。氨基酸和生物資源，2000，22（3）：225馬淑濤，張?zhí)烀瘢钅系?。不同工藝硫酸軟骨素的理化性質(zhì)和生物活性。中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24 (6)：348-3496奚俊，張有森。對(duì)硫酸軟骨素傳統(tǒng)提取方法的改進(jìn)J。生物學(xué)雜志，2000，17（6）：33- 357高華，劉坤，于茲東，等。硫酸軟骨素生產(chǎn)新工藝研究J。青島大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，l8（4）：558王鳳琴。