菌種的復蘇傳代及保存標準程序

1、菌種的復蘇傳代及保存標準程序目的：建立菌種的復蘇、傳代及保存標準程序。范圍：適用于檢定用菌種的復蘇、傳代及保存的操作。職責：質(zhì)管部生物測定人員對本規(guī)程的實施負責。內(nèi)容：菌種的復蘇與傳代操作均應在生物檢定室陽性對照間或?qū)Ｓ贸瑑艄ぷ髋_內(nèi)進行。操作中使用過的滴管、吸管及菌種管等均需放入消毒液中浸泡，試驗結(jié)束后經(jīng)12130分鐘高溫滅菌處理。1.菌種的復蘇1.1凍干菌種的復蘇檢定用標準菌種，由中國藥品生物制品檢定所提供，為冷凍干燥菌種(0代)。使用前需將其復蘇。1.1.1準備：用具：滅菌1ml滴管、滅菌雙碟、滅菌鑷子、砂輪、酒精燈、接種環(huán)。培養(yǎng)基：根據(jù)菌種的性質(zhì)選擇合適的液體培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或改良

2、馬丁培養(yǎng)基）、營養(yǎng)瓊脂（或改良馬丁瓊脂）斜面數(shù)支。消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新潔爾滅或84消毒液等。操作：.1將準備妥的冷凍菌種管、滅菌滴管、滅菌雙碟及鑷子、培養(yǎng)基移入工作臺。.2用砂輪將凍干菌種管頸部挫出刻痕，再75%酒精棉擦凈菌種管外壁，放在滅菌雙碟內(nèi)待干。.3點燃酒精燈，將菌種安瓿的封口一端在火焰上灼燒紅熱，用滅菌滴管吸取液體培養(yǎng)基少許，滴在灼熱的菌種安瓿封口一端，使其驟冷而炸裂。.4取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開后，把菌種安瓿放入滅菌雙碟內(nèi)。.5另取一支滅菌滴管，在火焰旁吸取適用液體培養(yǎng)基少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)。

3、用接種環(huán)取菌液劃線接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基上。.6將已接種的液體培養(yǎng)基及瓊脂斜面培養(yǎng)基置規(guī)定溫度下（一般細菌在3035，真菌在2328）培養(yǎng)24h。.7 取出培養(yǎng)物（第1代），仔細觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌，必要時涂片、革蘭氏染色鏡檢，若呈典型菌落即可應用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進行平板分離單菌落。 1.2 為保證工作用菌株的傳代次數(shù)不超過5代，并減少購買凍干菌種的次數(shù)，可在對凍干菌種復蘇的同時制備部分菌懸液（第1代）冷凍保存，并將此凍存菌液復蘇后的第2代培養(yǎng)物凍存保藏。準備 ：凍存保護液（40%無菌甘油）及滅菌凍存管。細菌凍存液：由液體培養(yǎng)基與凍存保護液按1：1比例混勻制成。按1.1.2.11.1.2

4、.4操作，將凍干菌復溶后，吸取菌懸液加入到細菌凍存液中，混勻。按1ml/管的量分裝至滅菌凍存管中，密閉。標明菌名、編號及凍存日期等。置-20或-80條件下冷凍保存。制備第2代凍存菌懸液時，可用接種環(huán)直接刮取第1代凍存菌懸液復蘇后轉(zhuǎn)種至瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基上生長的純菌落，再接種至細菌凍存液中，混勻后按1.2.3凍存。1.3凍存菌懸液的復蘇：準備：用具：滅菌1ml滴管、酒精燈、接種環(huán)。培養(yǎng)基：根據(jù)菌種的特性選擇適宜的液體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基10ml、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基12ml或改良馬丁培養(yǎng)基10ml等）、瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基。消毒液：75%酒精、0.1%新潔爾滅或84消毒液等。操作：.1從低

5、溫冰柜中取出菌種凍存管，室溫下放置使其自然解凍。.2將解凍后菌種管及滅菌滴管、液體培養(yǎng)基等移入工作臺。.3用75%酒精棉球擦拭菌種凍存管外壁，稍干。.4點燃酒精燈，在火焰旁打開菌種凍存管蓋，用一支滅菌滴管吸取解凍的菌懸液，接種至10ml液體培養(yǎng)基中（生孢梭菌需接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中）?；蛴媒臃N環(huán)取菌懸液劃線接種于瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基上。.5將用過的滴管和菌種管投入消毒液內(nèi)浸泡，接種環(huán)在火焰上灼燒。.6將上述接種后的培養(yǎng)基在規(guī)定溫度下培養(yǎng)（細菌在3035恒溫培養(yǎng)18-24小時，真菌在2328恒溫培養(yǎng)24-48小時，黑曲霉*培養(yǎng)57天）。.7仔細觀察培養(yǎng)物：如呈典型菌落即可作為日常工

6、作中使用的菌種，注明菌名、編號、代次和接種日期后，置28冰箱內(nèi)保存；如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型，可進行平板分離單菌落。.8注意：已解凍的凍存管不可再凍存。2.菌種的接種、傳代2.1.準備用具：接種環(huán)、酒精燈。培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂或改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基或適宜的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基應新鮮制備，如斜面已干縮，無冷凝水，則不宜再使用。消毒液：75%酒精、0.1%新潔爾滅或84消毒液。菌種：根據(jù)2010年版中國藥典的要求，傳代次數(shù)（n）應不超過4代。2.2將冰箱中取出的菌種斜面，在室溫放置30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室內(nèi)或超凈工作臺。2.3點燃酒精燈，將菌種管與接種管持在左手拇指、食指與中指之間，試管口斜向上

7、，兩試管口平齊靠近火焰旁。2.4用右手在火焰旁轉(zhuǎn)動兩管的棉塞，以便接種時易拔取，再以右手持接種環(huán)在火焰上燒紅30秒鐘，隨后將全部鉑金絲及金屬棒部分在火焰上灼燒，往返通過3次。2.5右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔出棉塞，夾在無名指、小指及掌部，并勿使其與任何物品接觸。2.6將灼燒過的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上，待冷后，從斜面上挑取菌苔少許，取出時，接種環(huán)不能通過火焰，應在火焰旁迅速插入至接種管內(nèi)液體培養(yǎng)基中，或在瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜面的表面上，注意只劃動一次，勿重復移動，且勿使菌苔沾

8、在管壁口。2.7取出接種環(huán)，立即將管口通過火焰滅菌，右手到火焰旁將試管棉塞塞上，然后將接種過細菌的接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌。2.8已接種畢的各管貼好標簽，注明菌名、編號、代次（n+1）和接種日期，細菌管置3035培養(yǎng)1824小時；真菌管一般置2328培養(yǎng)2448小時（黑曲霉需培養(yǎng)57天）。2.9培養(yǎng)到期后取出培養(yǎng)物，仔細觀察菌苔形態(tài)，是否正常，并與上代菌種比較，有無雜菌。必要時涂片，革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落即可作為日常工作中使用的菌種。如發(fā)現(xiàn)菌苔形狀不典型，可繼續(xù)進行平板劃線培養(yǎng)，分離單菌落，挑選典型菌苔接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，代替原有的工作用菌種。2.10檢查合格的工作用菌種，放入冰箱內(nèi)28保

9、存，一般1個月轉(zhuǎn)種一次。2.11菌種（第n代）接種至適宜培養(yǎng)基中，在規(guī)定的溫度條件下的培養(yǎng)物，即為第n+1代。注意：黑曲霉*致病性很強，操作時應特別注意：黑曲霉孢子相當穩(wěn)定，其在0.9%氯化鈉溶液中，4左右的條件下可以保存較長的時間，故可將此孢子懸液作為儲備液在12月內(nèi)使用，以減少反復操作的風險性。為防止黑曲霉孢子的傳播，接種傳代時應關閉風機，近酒精燈操作。若傳代的母代菌種為菌懸液，則用無菌吸管吹吸管內(nèi)液體，取12滴滴在改良馬丁瓊脂斜面，用吸管涂布均勻，置2328 培養(yǎng)57日。接種傳代時，改良馬丁斜面必須是干燥的，否則影響其孢子的形成。接種傳代后，使用過的器具均需在121，30分鐘高壓滅菌后再

10、作處理。3.菌種的保存：3.1菌懸液凍存法：凍干菌種（0代）復蘇后，可按上述方法制備第1代菌懸液、第2代菌懸液進行凍存。3.2瓊脂斜面低溫保存法：日常使用的工作用菌種可用此法在短期內(nèi)保存。將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙包好，為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時間，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4左右的冰箱中保藏。每隔 1個月移種一次，繼續(xù)進行保藏。適用范圍：細菌、酵母菌、真菌保藏。各類菌種保藏條件及時間：菌種培養(yǎng)基保存溫度傳種時間細菌一般多用營養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基46芽孢桿菌

11、36個月其它細菌每個月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂46一般46個月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等。46每4個月移植一次（每2個月移植一次）注意事項：保藏的菌種應是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應是第三代的培養(yǎng)物。 保藏時，破傷風桿菌可用庖肉培養(yǎng)基；生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應及時處理。每次移植后，應與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，應在室溫下保存。 3.3液體石蠟保存法：利用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種

12、的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長菌種的保藏期。方法：.1將菌種接種于斜面或穿刺于0.3 0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。.2取化學純的液體石蠟裝在試管中，每管1015ml，加棉塞，瓶口包上紙，121高壓滅菌30min，取出置37溫箱或110170烤箱中 1 2 h 或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。.3將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi)，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端 1 為宜，將試管直立，放入4冰箱中保藏。適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保藏效果較差。 注意事項：保藏時，用新鮮培養(yǎng)物接種，應檢查純度和特征后，方可進行保藏。保藏過程中，需經(jīng)常觀察斜面

13、是否干燥，如干燥，需重新移種。使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染。液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1 為宜。制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。4.菌種在傳代、保存或使用過程中發(fā)現(xiàn)污染、變異，應及時銷毀，不得用于常規(guī)檢驗。5.菌種傳代、保存及使用

14、、銷毀均應填寫相應記錄：0代菌種保管使用記錄、凍存菌種保管使用記錄、菌種傳代記錄、菌種使用記錄及菌種銷毀記錄。6.菌種按“檢定菌管理制度”管理。7.附錄：7.1菌種編號：傳代復蘇的菌種應有統(tǒng)一編號,編號方法為:菌種代號-G或W-代次-管號。G表示用于凍存的菌種，W表示工作用菌種。-（）注： 菌種代號：常用菌種的代號見下表：菌種名稱代號菌種名稱代號菌種名稱代號金黃色葡萄球菌JP生孢梭菌SB大腸埃希菌DC銅綠假單孢桿菌TL白色念珠菌BN短小芽孢桿菌DX枯草芽孢桿菌KC黑曲霉HQ藤黃微球菌TH菌種購進的年、月：如0608表示2006年8月購進菌種代次，用1、2、3、4、5表示。母代凍存菌種的編號，用

15、、表示。菌種的序號，用1、2、3表示。7.2常用工作用菌種的生物學特征金黃色葡萄球菌形態(tài)與染色：圓球形排列成典型的葡萄狀，菌落直徑為0.81.5mm，革蘭氏染色陽性。培養(yǎng)特性：在肉湯瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯中，生長良好。在2838生長較好，pH為4.59.8，以pH7.4左右最好。營養(yǎng)瓊脂平板，培養(yǎng)2448小時，形成圓形凸出、邊緣整齊、表面光澤且金黃色的菌落，直徑12mm（應挑選光滑型菌落）。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，生長迅速，經(jīng)3724小時培養(yǎng)呈均勻混濁，管底稍有沉淀，微微振搖即可上升，消散均勻。但培養(yǎng)基含有可發(fā)酵糖類或菌型變?yōu)榇植谛驼?，可出現(xiàn)自然凝集現(xiàn)象，抵抗力：在干燥情況下，可生存數(shù)月，在無糖培養(yǎng)基內(nèi)

16、生存數(shù)年。對熱8030分鐘才被殺死。在1%石炭酸液中15分鐘被殺死，碘酒中須1分鐘，75%酒精中須數(shù)十分鐘才被殺死。藤黃微球菌形態(tài)與染色：個體略大于葡萄球菌，直徑0.53.5um，單個成雙或四聯(lián)狀排列，或呈不規(guī)則的團塊。革蘭氏染色呈陽性。培養(yǎng)特性：專性需氧菌，營養(yǎng)要求不高，最適溫度為2530。在瓊脂平板上培養(yǎng)可形成圓形凸起，光滑、不透明黃色菌落。在液體培養(yǎng)基中均為混濁生長。枯草桿菌形態(tài)與染色：菌體細短棒狀，0.70.8um寬，2.03.0um長，單個或呈鏈狀，兩端半圓形，染色均勻。芽孢0.60.9um寬，1.01.5um長，橢圓形或圓柱形，常產(chǎn)生于菌體中央或接近中央。革蘭氏染色呈陽性，能運動。

17、培養(yǎng)特性：營養(yǎng)瓊脂平板：菌落表面粗糙，圓形，凹凸不平，邊緣鋸齒狀，稍有蔓延，呈白色或微黃色，應挑選粗糙形菌落），本菌變異時可出現(xiàn)光滑型菌落。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中呈少量混濁并生沉淀，在液體表面形成皺狀厚膜，粘附于試管壁上。培養(yǎng)最適溫度3037，生長范圍1555，兼性厭氧或需氧。抵抗力：菌體濕熱55，1小時即被殺死，芽孢能耐高溫，1003小時才被殺死，12040分鐘才被殺死。短小芽孢桿菌形態(tài)與染色：本菌為桿狀，革蘭氏染色陽性，無莢膜，芽孢偏生，橢圓形，有動力。培養(yǎng)特性：本菌與枯草桿菌相似，培養(yǎng)最適溫度3037，生長范圍1550，兼性厭氧或需氧。此外，短小芽孢桿菌有兩點不同于枯草桿菌：在瓊脂培養(yǎng)基上，大

18、多數(shù)菌株的菌落為光滑型并變?yōu)槲ⅫS色，用于檢定的菌種，應挑光滑型菌落；有些菌株營養(yǎng)需要生物素（維生素H）及氨基酸。大腸埃希菌形態(tài)與染色：短桿菌0.40.7um寬，24um長，兩端鈍圓，大多數(shù)有58根鞭毛，運動活波，但亦有無鞭毛，不運動，不形成芽孢，革蘭氏染色陰性。培養(yǎng)特性：菌落扁平，光滑，圓潤，在EMB瓊脂平板上呈紫黑色，有金屬光澤。白色念珠菌形態(tài)與染色：本菌為革蘭氏陽性，但染色不均勻，卵圓形，壁薄生芽的酵母樣菌。大小為2.54um。培養(yǎng)特性：瓊脂平板培養(yǎng)，菌落表面濕潤粘稠，圓形，乳白色，微凸，邊緣整齊。生孢梭菌形態(tài)與染色：大多數(shù)菌株周身皆有鞭毛，能運動，并可形成桿狀或梭狀芽孢桿菌，菌體一般較粗大，長約38um，寬約0.41.2um。革蘭氏染色呈陽性，菌體老化后?？勺?yōu)殛幮?。培養(yǎng)特性：本菌嚴格厭氧，培養(yǎng)的最適溫度為37。在瓊脂平板上培養(yǎng)2448小時，生長緩慢，菌落直徑25mm，蔓延生長，邊緣不規(guī)則，有鋸齒狀突起；