聯(lián)合測(cè)定方法

1、SOD的測(cè)定酶液提取:稱(chēng)取鮮葉樣品。0.5g于預(yù)冷的研缽中，加lml0.05mol/1 pH7.0磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5ml。將提取液于10000轉(zhuǎn)/分冷凍離心20分鐘，上清液用于測(cè)定SOD, POD, CAT活力測(cè)定及丙二醛含量測(cè)定。SOD：測(cè)定SOD活性的試劑配制及用量:磷酸緩沖液(PH7.8) 0.05moI/L 3.1m1，空白為3.2m1;EDTA-Na2 1mg/m1 0.2mL; L一甲硫氨酸20mg/mL 0.2m1;核黃素0.1 mg/ml，吸取上清液0.2m1;NBT lmg/ml 0.2m1;提取酶液0.1ml，空白不加酶液。反應(yīng)總體積為4m1,

2、 第1組、4000Lx光照30min，遮黑布終止反應(yīng)。第2組、黑暗處理30 min。置560nm處測(cè)定光密度。SOD活性單位以抑制NBT光化還原50%作為一個(gè)酶活性單位(u)，按以下公式計(jì)算SOD活性: 式中，Ack為照光管的吸光度值;AE為遮光管的吸光度值:V為樣品液總體積(ml);Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量(ml); W為樣品鮮重。 MDA 取上清液1.5m1，加入2.5m10.5%的硫代巴比妥酸(TBA)(用10%三氯乙酸配制)。混合物于100沸水浴中加熱20min，迅速冷卻，于10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，分別測(cè)定上清液在450, 532nm及600nm處的吸光度值。按以下公式計(jì)MDA濃度C

3、( u mol/1)和含量(nmollgFW):C(u mol/1)=6.45 X (A532-A600)-0.56 X A450Sod的測(cè)定方法1、 目的學(xué)習(xí)和掌握氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）光化還原法測(cè)定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。二、原理SOD是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類(lèi)型的SOD：MnSOD和Cu.ZnSOD，它們都催化下列反應(yīng)：由于超氧自由基（O2.）為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測(cè)定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應(yīng)來(lái)測(cè)定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負(fù)離子O2.，當(dāng)加入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應(yīng)生成單甲月替 （ 黃色

4、），繼而還原生成二甲月替 ，它是一種藍(lán)色物質(zhì)，在560nm波長(zhǎng)下有最大吸收。當(dāng)加入SOD時(shí)，可以使超氧自由基與H+結(jié)合生成H2O2和O2，從而抑制了NBT光還原的進(jìn)行，使藍(lán)色二甲月替生成速度減慢。通過(guò)在反應(yīng)液中加入不同量的SOD酶液，光照一定時(shí)間后測(cè)定560nm波長(zhǎng)下各液光密度值，抑制NBT光還原相對(duì)百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正比，以酶液加入量為橫坐標(biāo)，以抑制NBT光還原相對(duì)百分率為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出二者相關(guān)曲線，根據(jù)SOD抑制NBT光還原相對(duì)百分率計(jì)算酶活性。找出SOD抑制NBT光還原相對(duì)百分率為50時(shí)的酶量作為一個(gè)酶活力單位（U）。三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑1實(shí)驗(yàn)材料小麥、玉米、

5、水稻(Rice)(Rice)(Rice)(Rice)、棉花等新鮮葉片2主要儀器（1）分光光度計(jì)（2）分析天平（3）高速冷凍離心機(jī)（4）冰箱（5）光照箱：4 500Lux（6）帶蓋瓷盤(pán)1個(gè)/處理（7）移液管架（8）研缽（9）離心管5mL數(shù)個(gè)（10）微燒杯1015mL8個(gè)/處理（11）移液管或加樣器（12）微量進(jìn)樣器 （13）燒杯 （14）量筒 （15） 容量瓶（16）細(xì)口瓶3.溶液的配制（1）0.1 mol/L pH7.8磷酸鈉（Na2HPO4-NaH2PO4）緩沖液A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：準(zhǔn)確稱(chēng)取Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g

6、于100mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4冰箱中保存?zhèn)溆谩液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：準(zhǔn)確稱(chēng)取NaH2PO4· 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4冰箱中保存?zhèn)溆?。取上述A液183mL與B液17mL充分混勻后即為0.1 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液。4冰箱中保存?zhèn)溆?。?）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸鈉緩沖液準(zhǔn)確稱(chēng)取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100

7、mL小燒杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液定容至刻度，充分混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。4冰箱中保存可用12d。（3）7.5 × 104 mol/L NBT溶液準(zhǔn)確稱(chēng)取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。4冰箱中保存可用23d。（4）含1.0mol/L EDTA的2 × 105 mol/L核黃素溶液A液：準(zhǔn)確稱(chēng)取EDTA（MW=292）0.00292

8、g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。B液：準(zhǔn)確稱(chēng)取核黃素（MW=376.36）0.0753g于50mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，此溶液為含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黃素溶液。4冰箱中保存可用810d。該溶液應(yīng)避光保存，即用黑紙將裝有該液的棕色瓶包好，置于4冰箱中保存。當(dāng)測(cè)定SOD酶活時(shí)，將C液稀釋100倍，即為含1.0mol/L EDTA的2 × 105 mol/L 核黃素溶液。（5）0.05 mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液取0.1 mol/L pH7.8的磷酸鈉緩沖液50mL，移入10

9、0mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4冰箱中保存?zhèn)溆?。?）石英砂。四、操作方法和步驟1酶液的制備按每克鮮葉加入3mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液，加入少量石英砂，于冰浴中的研缽內(nèi)研磨成勻漿，定容到5mL刻度離心管中，于8 500 r/min（10 000g）冷凍離心30min，上清液即為SOD酶粗提液。2酶活力的測(cè)定每個(gè)處理取8個(gè)洗凈干燥好的微燒杯編號(hào)，按表1加入各試劑及酶液，反應(yīng)系統(tǒng)總體積為3mL。其中48號(hào)杯中磷酸鈉緩沖液量和酶液量可根據(jù)試驗(yàn)材料中酶液濃度及酶活力進(jìn)行調(diào)整（如酶液濃度大、活性強(qiáng)時(shí)，酶用量適當(dāng)減少）。各試劑全部加入后，充分混勻，取1號(hào)微燒杯置于暗處

10、，作為空白對(duì)照，比色時(shí)調(diào)零用。其余7個(gè)微燒杯均放在溫度為25，光強(qiáng)為4 500Lux的光照箱內(nèi)（安裝有3根20W的日光燈管）照光15min，然后立即遮光終止反應(yīng)。在560nm波長(zhǎng)下以1號(hào)杯液調(diào)零，測(cè)定各杯液光密度并記錄結(jié)果。以2、3號(hào)杯液光密度的平均值作為抑制NBT光還原率100，根據(jù)其他各杯液的光密度分別計(jì)算出不同酶液量的各反應(yīng)系統(tǒng)中抑制NBT光還原的相對(duì)百分率。以酶液用量為橫坐標(biāo)，以抑制NBT光還原相對(duì)百分率為縱坐標(biāo)，作出二者相關(guān)曲線。找出50抑制率的酶液量（L）作為一個(gè)酶活力單位（U）。表1反應(yīng)系統(tǒng)中各試劑及酶液的加入量（mL）試 劑試劑（5） 試劑（2） 試劑（3）酶液試劑（4）杯 號(hào)

11、1 0.9 1.5 0.3 0 0.3 2 0.9 1.5 0.3 0 0.33 0.9 1.5 0.3 0 0.34 0.85 1.5 0.3 0.05 0.35 0.80 1.5 0.3 0.10 0.36 0.75 1.5 0.3 0.15 0.37 0.70 1.5 0.3 0.20 0.38 0.65 1.5 0.3 0.25 0.3五、結(jié)果計(jì)算1560nm波長(zhǎng)下各杯液的光密度（表2）表2 測(cè)定數(shù)據(jù)列表杯 號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 2、3號(hào)平均值 酶液量（mL）0 0 0 0.05 0.10 0.150.200.25 光密度（OD560nm）0 抑制率（） 100 100

12、100以酶液加入量為橫坐標(biāo)，以抑制NBT光還原相對(duì)百分率為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制出二者相關(guān)曲線。找出50抑制率的酶液量（L）作為一個(gè)酶活力單位（U）。2SOD酶活力按下式計(jì)算A（ V × 1000 × 60）/（B × W × T）式中各因子代表內(nèi)容如下：A：為酶活力（酶活力單位：U/g（FW）·h）；V：為酶提取液總體積（mL）；B：為一個(gè)酶活力單位的酶液量（L）；W：為樣品鮮重（g）；T：為反應(yīng)時(shí)間（min）；1 000：為1mL = 1 000L；60：為1h = 60min。3抑制率按下式計(jì)算抑制率=（ （D1D2）/ D1）×

13、;100 式中各因子代表內(nèi)容如下：D1：為2、3號(hào)杯液的光密度平均值；D2：為加入不同酶液量的各杯液的光密度值。注：有時(shí)因測(cè)定樣品的數(shù)量多，每個(gè)樣品均按此法測(cè)定酶活力工作量將會(huì)很大，也可每個(gè)樣品只測(cè)定1個(gè)或2個(gè)酶液用量的光密度值，按下式計(jì)算酶活力。A（ (D1D2) × V × 1000 × 60）/（D1 × B × W × T × 50）式中各因子代表如下：D1：為2、3號(hào)杯液的光密度平均值；D2：為測(cè)定樣品酶液的光密度；50：為抑制率50；其它各因子代表的內(nèi)容與上述SOD酶活力計(jì)算公式的各因子代表的內(nèi)容相同。六、注意事

14、項(xiàng)1富含酚類(lèi)物質(zhì)的植物（如茶葉）在勻漿時(shí)產(chǎn)生大量的多酚類(lèi)物質(zhì)，會(huì)引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此類(lèi)植物SOD酶時(shí)，必須添加多酚類(lèi)物質(zhì)的吸附劑，將多酚類(lèi)物質(zhì)除去，避免酶蛋白變性失活，一般在提取液中加14的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。2測(cè)定時(shí)的溫度和光化反應(yīng)時(shí)間必須嚴(yán)格控制一致。為保證各微燒杯所受光強(qiáng)一致，所有微燒杯應(yīng)排列在與日光燈管平行的直線上。植物組織中過(guò)氧化氫含量測(cè)定 植物在逆境下或衰老時(shí)，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積。H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體。過(guò)氧化氫酶可以清除H2O2，是

15、植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。因此，植物組織中H2O2含量和過(guò)氧化氫酶活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫含量，利用高錳酸鉀滴定法和紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶活性。  【原理】 H2O2與硫酸鈦（或氯化鈦）生成過(guò)氧化物鈦復(fù)合物黃色沉淀，可被HSO4溶解后，在415nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與H2O2濃度呈線性關(guān)系。 【儀器和用具】 研缽；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7個(gè)，離心管5ml×8支；離心機(jī)；分光光度計(jì)。【試劑】 100mo

16、l/L H2O2丙酮試劑：取30%分析純H2O2 57l，溶于100ml，再稀釋100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸鈦；丙酮；濃氨水。     待沉淀完全溶解后，將其小心轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，并用蒸餾水少量多次沖洗離心管，將洗滌液合并后定容至10ml刻度，415nm波長(zhǎng)下比色。     2.樣品提取和測(cè)定：(1)稱(chēng)取新鮮植物組織2g，按材料與提取劑11的比例加入4下預(yù)冷的丙酮和少許石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入離心管3000 r/min下離心10min，棄去殘?jiān)?/p>

17、，上清液即為樣品提取液。(2)用移液管吸取樣品提取液1ml，按表1加入5%硫酸鈦和濃氨水，待沉淀形成后5000rpm/min離心10min，棄去上清液。沉淀用丙酮反復(fù)洗滌35次，直到去除植物色素。(3)向洗滌后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法定容并比色。    3.結(jié)果計(jì)算：植物組織中H2O2含量(mol/g Fw)= C.Vt/FW.V1式中C標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中H2O2濃度（mol）；        Vt樣品提取液總體積（ml）；            V1測(cè)定時(shí)用樣品提取液體積（ml）；