DNA提取原理和方法

1、DNA提取原理和方法提取原理和方法 DNA提取方法簡介提取方法簡介q 基因組基因組DNADNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它q 非基因組非基因組DNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的提取的提取 堿裂解法堿裂解法 煮沸法煮沸法線粒體、葉綠體線粒體、葉綠體DNA的提取的提取 差速離心結(jié)合差速離心結(jié)合SDS裂解法裂解法qCTAB法原理法原理（植物（植物DNA提取經(jīng)典方法）提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞

2、膜，并與核酸形成復(fù)合物。物。具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里該復(fù)合物在高鹽溶液中（該復(fù)合物在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。出來。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的 植物材料之

3、前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15。qCTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0） NaCl CTAB-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入使用前加入Tris-HCl （pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使提供一個高鹽環(huán)境，使DNP（脫氧核糖核蛋白（脫氧核糖

4、核蛋白 ）。）。CTAB溶解細(xì)胞膜，溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除qCTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方提取緩沖液的改進(jìn)配方 組份組份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巰基乙醇巰基乙醇 終濃度終濃度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入vPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物

5、，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。和多糖結(jié)合，有效去除多糖。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）（聚乙烯吡咯烷酮）lPVP 按其平均分子量大小分為四級，習(xí)慣上常以按其平均分子量大小分為四級，習(xí)慣上常以K值表示，不同的值表示，不同的K值分別代表相應(yīng)的值分別代表相應(yīng)的PVP平均分平均分子量范圍。子量范圍。K值實際上是與值實際上是與PVP水溶液的相對粘度水溶液的相對粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的物理量，因此可以用物理量，因此可以

6、用K值來表征值來表征PVP的平均分子量。的平均分子量。通常通常K值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。l l在研磨過程中加入在研磨過程中加入PVP，其中的，其中的CO-N=基有很強(qiáng)的基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類被氧化的機(jī)結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類被氧化的機(jī)會。會。l同時向抽提液中加入還原劑同時向抽提液中加入還原劑-巰基乙醇，后者能打巰基乙醇，后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而去除。后經(jīng)抽提而去除。 qCTAB法流程圖法流程圖植物材料植物材料裂解液裂解液上層溶液上層溶液液氮研

7、磨液氮研磨抽提抽提細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q SDS法原理法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能裂解細(xì)）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽提高鹽(KAc或或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖濃度并降低溫度（冰?。沟鞍踪|(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份組份Tris

8、-HCl （pH8.0）EDTA （pH 8.0 ）NaCl SDS終濃度終濃度 10 mM 20 mM 0.4M 2%q SDS法法DNA提取緩沖液提取緩沖液2.65 水浴 60min, 其間緩慢搖動幾次。3.加入150ul 的5mol/ LKac, 混勻, 冰浴15min 左右q SDS SDS法流程圖法流程圖 （以動物組織為例）（以動物組織為例） 動物組織動物組織細(xì)胞裂解細(xì)胞裂解上層溶液上層溶液組織勻漿組織勻漿抽提抽提干燥溶解干燥溶解離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液物理方式：玻璃珠法、物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式化學(xué)方式：異硫

9、氰酸胍法、堿裂解法：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法q根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：吸附材料結(jié)合法：吸附材料結(jié)合法：q根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂磁珠磁珠高鹽低高鹽低pHpH值結(jié)合核酸，低鹽高值結(jié)合核酸，低鹽高pHpH值洗脫。值洗脫?？旖莞咝?。快捷高效。低鹽高低鹽高pHpH值結(jié)合核酸，高鹽低值結(jié)合核酸，高鹽低pHpH值洗脫。值洗脫。適用于純度要求高的實驗。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。物，從而

10、達(dá)到分離目的。濃鹽法：濃鹽法：有機(jī)溶劑抽提法：有機(jī)溶劑抽提法：密度梯度離心法：密度梯度離心法：利用利用RNP和和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物q堿裂解法原理堿裂解法原理 染色體染色體DNADNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNADNA分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體DNADNA為為線狀分線狀分子，而質(zhì)粒子，而質(zhì)粒DNADNA為共價閉合環(huán)狀分子；為共價閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)用堿處理當(dāng)用堿處理

11、DNADNA溶液時，線狀染色體溶液時，線狀染色體DNADNA容易發(fā)生變性，共容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒價閉環(huán)的質(zhì)粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；時即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNADNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNADNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。中，從而可通過離心將兩者分開。q堿裂解法流程圖堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體對數(shù)期菌體溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重懸充分重懸溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提

12、抽提離心洗滌離心洗滌酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶液SDS堿裂解法提取質(zhì)粒堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液中溶液1的成分的成分及作用及作用 l溶液溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去 l溶液溶液 0.2M NaOH / 1% SDS 破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。 l溶液溶液III 3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸 l這一步的K置換

13、了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時基因組DNA也被PDS共沉淀 q煮沸法原理煮沸法原理 染色體染色體DNADNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNADNA分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體DNADNA為為線狀分線狀分子，而質(zhì)粒子，而質(zhì)粒DNADNA為共價閉合環(huán)狀分子；為共價閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)加熱處理當(dāng)加熱處理DNADNA溶液時，線狀染色體溶液時，線狀染色體DNADNA容易發(fā)生變性，共容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒價閉環(huán)的質(zhì)粒DNADNA在冷卻時即恢復(fù)其

14、天然構(gòu)象；在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNADNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNADNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。中，從而可通過離心將兩者分開。q差速離心法原理差速離心法原理 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉

15、降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來。種組分分級分離出來。I.I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除

16、雜質(zhì)V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中最好使用新鮮材料，低溫保最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組提取血液基因組DNA時，要時，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成否則會造成DNA降解降解含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量較含量較少，提取前先富集少，提取前先富集基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取使用處于對數(shù)期的新鮮菌體使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)

17、時應(yīng)加入篩選壓力，否則培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）嚴(yán)謹(jǐn)性質(zhì)粒和松弛性質(zhì)粒l按照復(fù)制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：l一類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，質(zhì)粒也復(fù)制一次，每個細(xì)胞內(nèi)只有12個質(zhì)粒；l另一類是松弛型質(zhì)粒，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個細(xì)胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在

18、大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。 材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致導(dǎo)致DNA量少，純度低量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧厌槍Σ煌牧希x擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：解預(yù)處理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶K細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩高溫溫浴時，定時輕柔振蕩基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取菌體量適當(dāng)菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充

19、分懸浮體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（變性的時間不要過長（5分鐘），分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時間也不宜過長，否則會復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組有基因組DNA的污染的污染G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁用酶法或機(jī)械法處理，以破壁采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間（獼離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間（獼猴桃大提

20、，猴桃大提，10000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)20min）針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法去雜質(zhì)的方法基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取q 蛋白質(zhì)的去除：蛋白質(zhì)的去除： 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用變性劑變性（使用變性劑變性（SDSSDS、異硫氰酸胍等）、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌高鹽洗滌 蛋白酶處理蛋白酶處理q 多糖的去除：多糖的去除： 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/21/2體體積的積的5M NaCl5M NaCl，高鹽可溶解多糖。，高鹽可溶解多糖。 用多糖水

21、解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2(1/2體積體積) )，氯苯可，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。q 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰

22、基乙醇、巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合q 鹽離子的去除：鹽離子的去除： 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分淀會更充分沉淀時加入沉淀時加入1/10體積的體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于），有利于充分沉淀充分沉淀沉淀后應(yīng)用沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗

23、滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解緩沖液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+離子，抑制離子，抑制DNasepH值為值為8.0，可防止，可防止DNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解基因組基因組DNADNA的提取的提取質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)糖、多酚類雜質(zhì)DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)后續(xù)酶解反應(yīng)DNADNA中殘留有金屬離中殘留有金屬離子子重新

24、純化重新純化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等雜白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓酒精，讓酒精充分揮發(fā)充分揮發(fā)增加增加7070乙醇洗滌的乙醇洗滌的次數(shù)（次數(shù)（2-32-3次）次）q問題一：問題一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應(yīng)。反應(yīng)。原原因因?qū)Σ卟卟牧喜恍迈r或反復(fù)凍材料不新鮮或反復(fù)凍融融未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性酶的活性提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈，烈，DNADNA被機(jī)械打斷被機(jī)械打斷外源核酸酶污染外源核酸酶污染反復(fù)凍融反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍液氮研磨