細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法干擾試驗課件

1、細(xì)菌(xjn)內(nèi)毒素檢查法干擾試驗講 解 董光宴 湛江博康海洋生物有限公司第一頁，共三十九頁。實驗實驗(shyn)基本流程基本流程圖圖供試品供試品限值確定限值確定(qudng)最大有效最大有效(yuxio)稀釋倍數(shù)確定稀釋倍數(shù)確定供試品干擾實驗供試品干擾實驗 正式實驗正式實驗結(jié)果判斷結(jié)果判斷第二頁，共三十九頁。 供試品 新化合物或新藥建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時，常常會遇到各種各樣的困難，尤其是尚處于(chy)新藥研發(fā)早期階段的藥物，由于藥物制劑、賦形劑等還不穩(wěn)定，經(jīng)常會發(fā)生變化，這樣就給方法的建立帶來不同程度的影響。第三頁，共三十九頁。 供試品 在建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法之前，應(yīng)盡可能多的收集有關(guān)該

2、藥品的基本信息(xnx)，例如： 有關(guān)樣品的溶解性信息，推薦的稀釋液，在水中的溶解度，以及最適溶劑； 樣品的pH范圍； 分子量大?。?產(chǎn)品規(guī)格、體積或重量； 擬用于臨床的用法和用量等等。第四頁，共三十九頁。限值的確定 1、依據(jù) 2010年版中國藥典附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水” 2010年版中國藥典二部附錄“化學(xué)藥品注射劑安全性檢查法應(yīng)用指導(dǎo)(zhdo)原則 ”第五頁，共三十九頁。干擾試驗 當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進(jìn)行干擾試驗。當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境(hunjng)中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進(jìn)行干擾試驗。

3、2010版藥典 第六頁，共三十九頁。干擾試驗 藥典中已有規(guī)定的品種或有其他內(nèi)毒素檢驗標(biāo)準(zhǔn)的品種，可直接進(jìn)行內(nèi)毒素檢查(jinch)，如在檢驗中出現(xiàn)干擾的情況需再進(jìn)行干擾實驗的驗證；其他未建立內(nèi)毒素檢查(jinch)的品種需先進(jìn)行干擾實驗，確定不干擾濃度后再進(jìn)行內(nèi)毒素檢查(jinch)。 2010版中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范第七頁，共三十九頁。干擾試驗 干擾實驗的目的是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。并且驗證當(dāng)供試品的配方和工藝有變化，鱟試劑來源改變或供試品陽性對照結(jié)果呈陰性時供試品是否存在干擾作用。 2010版中國(zh

4、n u)藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范 第八頁，共三十九頁。干擾試驗 由于干擾實驗檢驗的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關(guān)(wgun)，因此在干擾實驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。但建議使用較低靈敏度（如0.50或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾實驗造成的陽性影響。 2010版中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范 第九頁，共三十九頁。舉例(j l):1 試劑和樣品鱟試劑（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，靈敏度：0.25EU/ml）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中檢所提供）西咪替丁氯化鈉注射液 （【規(guī)格】50ml:西咪替丁0

5、.2g與氯化鈉0.45g P258）第十頁，共三十九頁。2 限值的確定 內(nèi)毒素限值L=0.50EU/ml（2010年版中國(zhn u)藥典二部正文258頁）。第十一頁，共三十九頁。3 干擾試驗濃度的計算 按照(nzho)中國藥典2005年版提供的公式計算最大有效稀釋倍數(shù)，計算方法如下：3.1 選用靈敏度為：0.25EU/ml時：MVD=CL/=10.5/0.25=2倍3.2 選用靈敏度為：0.125EU/ml時：MVD=CL/=10.5/0.125=4倍第十二頁，共三十九頁。4 預(yù)試驗4.1 目的 初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/U表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值

6、以EU/ml表示）,為正式干擾試驗提供(tgng)依據(jù)。 優(yōu)點：減少摸索過程、節(jié)省成本第十三頁，共三十九頁。4.2 操作方法 由于干擾試驗檢驗的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所用鱟試劑的靈敏度無關(guān)(wgun)，因此在干擾試驗的預(yù)試驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。但建議使用較低靈敏度（0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾試驗造成的陽性影響。第十四頁，共三十九頁。 將供試品溶液進(jìn)行一系列倍數(shù)(bish)的稀釋，但最大的稀釋倍數(shù)(bish)不得超過MVD=CL/0.03 使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗。 每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和

7、2支供試品陽性對照（即含2.0濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）。 另做2支陰性對照，和2支陽性對照。第十五頁，共三十九頁。4.3 結(jié)果判斷當(dāng)陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效。 當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認(rèn)為供試品在該濃度下可能無干擾，可選擇(xunz)該稀釋倍數(shù)進(jìn)行正式干擾實驗。第十六頁，共三十九頁。 樣品信息結(jié) 果2倍4倍8倍0.25EU/ml0.25EU/ml0.25EU/mlPPC+ + + +樣品管- - - -PC+ +NC- -4.4 結(jié)果(ji gu)記錄第十七頁，共三十九頁。 預(yù)試驗結(jié)果，樣品西咪替丁氯化鈉注射液 在2-

8、8倍稀釋范圍內(nèi)不存在明顯(mngxin)的增強和抑制作用，可選用其中任一濃度做該樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗。第十八頁，共三十九頁。5 5 干擾(gnro)試驗溶液的制備溶液名稱WSE/被加入內(nèi)毒素的溶液 稀釋用液 倍 數(shù) WSE 管數(shù) 供試品 無/供試品溶液 2Et 2/供試品溶液 供試品溶液 1248210.50.254444ES 2/ BET BET 1248210.50.254444NC 無/BET 2第十九頁，共三十九頁。5.1 供試品溶液樣品西咪替丁氯化鈉注射液 的稀釋： 用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將其稀釋到2倍和4倍稀釋液備用。操作過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，保證無外源物質(zhì)(wzh)的干

9、擾。 第二十頁，共三十九頁。西咪替丁氯化鈉注射液原液2倍稀釋液4倍稀釋液2.0ml2.0ml0.5ml0.5ml圖圖 示示第二十一頁，共三十九頁。5.2 鱟試劑(shj)靈敏度的對照系列 根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（），將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1ml溶解，在旋渦混合器上混合15分鐘，然后制備成1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、 0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml等6個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。 第二十二頁，共三十九頁。150EU/ml15EU/ml2EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.1

10、25EU/ml0.25EU/ml0.06EU/ml0.2ml0.3ml1.8ml1.95ml1.2ml1.2ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml圖圖 示示第二十三頁，共三十九頁。5.3 干擾(gnro)試驗系列的制備方法、鱟試劑為0.25EU/ml樣品濃度為2倍稀釋的干擾試驗系列溶液的制備： 取西咪替丁氯化鈉注射液 的原液0.6ml加入試管中，然后吸取相同體積的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1.0EU/ml）加入同一試管中，混合均勻即得到含內(nèi)毒素為0.50EU/ml并同時含樣品西咪替丁氯化鈉注射液 的2倍稀釋的混合液。第二十四頁，共三十九頁。然后用樣品西

11、咪替丁氯化鈉注射液 的2倍稀釋液稀釋該混合液，稀釋倍數(shù)依次為2、4和8倍，將這三支管混合均勻連同該混合液即可得到(d do)含內(nèi)毒素分別為0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml，含樣品西咪替丁氯化鈉注射液 濃度為2倍稀釋液的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素對照溶液（干擾試驗系列）。第二十五頁，共三十九頁。樣品(yngpn)原液內(nèi)毒素1.0EU/ml圖圖 示示0.6ml0.6ml0.6ml0.6ml0.3ml樣品(yngpn)2倍0.3ml0.6ml0.6ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.50EU/ml第二十六頁，共三十九頁。 、鱟試劑為0.125

12、EU/ml樣品濃度為4倍稀釋的干擾試驗系列溶液(rngy)的制備： 取西咪替丁氯化鈉注射液 的的2倍稀釋液 0.6ml加入試管中，然后吸取相同體積的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.5EU/ml）加入同一試管中，混合均勻即得到含內(nèi)毒素為0.25EU/ml并同時含樣品西咪替丁氯化鈉注射液 的4倍稀釋的混合液。第二十七頁，共三十九頁。然后用樣品西咪替丁氯化鈉注射液 的4倍稀釋(xsh)液稀釋(xsh)該混合液，稀釋(xsh)倍數(shù)依次為2、4和8倍，將這三支管混合均勻連同該混合液即可得到含內(nèi)毒素分別為0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml和0.03EU/ml，含樣品西咪替丁氯化鈉注射液

13、 濃度為4倍稀釋(xsh)液的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素對照溶液（干擾試驗系列）。第二十八頁，共三十九頁。樣品(yngpn)2倍內(nèi)毒素0.5EU/ml圖圖 示示0.6ml0.6ml0.6ml0.6ml0.3ml樣品(yngpn)4倍0.3ml0.6ml0.6ml0.125EU/ml0.06EU/ml0.03EU/ml0.25EU/ml第二十九頁，共三十九頁。6 干擾(gnro)試驗加樣 WSE對照名稱20.5 0.25NCESET第三十頁，共三十九頁。 7 干擾試驗判斷的標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)Es在0.52.0(包括(boku)0.5和2.0)時，且當(dāng)Et在0.5Es2.0Es (包括(boku)0.5Es和2.0Es)時

14、，則認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。第三十一頁，共三十九頁。7.1 如所用鱟試劑(shj)靈敏度為0.25EU/ml，供試品為XX注射液（稀釋4倍） WSE對照名稱0.50.250.1250.06NC結(jié)果ES+ + + + +- - - - - - -0.250.25ET+ + + + + + +- - - - 0.1250.125 Es在0.52.0，且Et在0.5Es2.0Es (包括(boku)0.5Es和2.0Es)，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。第三十二頁，共三十九頁。7.2 如所用鱟試劑(shj)靈敏度為0.25EU/ml，供試品為XX注射液（稀釋4倍） WSE對照名稱0.50.

15、250.1250.06NC結(jié)果ES+ + + + + + +- - - - 0.1250.125ET+ + + - - - - - - -0.420.42 雖然 Es在0.52.0范圍內(nèi)，Et不在0.5Es2.0Es 范圍內(nèi)，供試品在該濃度下有干擾(gnro)作用，需進(jìn)行適當(dāng)處理后重做試驗。 第三十三頁，共三十九頁。7.3 如所用(su yn)鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml，供試品為XX注射液（稀釋4倍） WSE對照名稱0.50.250.1250.06NC結(jié)果ES+ + + + + + + - - -0.100.10ET+ + + + +- - - - - -0.250.25 Es不在0.52.0范圍(fnwi)內(nèi)，試驗無效。第三十四頁，共三十九頁。7.4 結(jié) 論 依據(jù)中國藥典2010版附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，西咪替丁氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾(gnro)試驗2倍和4倍稀釋液符合試驗要求，對鱟試驗沒有干擾(gnro)。 第三十五頁，共三十九頁。7.5、檢測濃度(nngd)的選擇 如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗要求的第二個濃度作為日常檢查的濃度。第三十六頁，共三十九頁。8 8 總總 結(jié)結(jié) 導(dǎo)致(dozh)干擾的因素 pH值 抗凝因子 螯合劑 葡聚糖 . 排除干擾的方法 稀釋 中和 過濾(gul) 加熱 第三十七頁，共三十九頁。謝 謝!第三十八頁