膠體金試紙條的制備分析

1、免疫膠體金技術(shù)簡介Immune colloidal gold technique2015-1-27目錄1膠體金技術(shù)的種類2 膠體金的合成3膠體金的標(biāo)記與純化4 膠體金免疫層析法試劑的組成5膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用7膠體金技術(shù)的發(fā)展膠體金免疫層析試紙的檢測模式6l 膠體金免疫層析（Gold Immune Chromatographic Assay, GICA）技術(shù)是結(jié)合了膠體金技術(shù)和免疫層析技術(shù)發(fā)展而來的，其本質(zhì)為一種固相反應(yīng)的 ELISA,并用膠體金來代替底物顯色。l 免疫膠體金技術(shù) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。l 膠體金標(biāo)記 實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到

2、膠體金顆粒表面的包被過程。膠體金技術(shù)的發(fā)展 1939-雛形 Kausche等把煙草花葉病毒吸附到金顆粒上在電子顯微鏡下觀察金離子呈高電子密度。 1971-作為標(biāo)記物應(yīng)用于免疫組織化學(xué)研究 Faulk等首先將兔抗沙門菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測沙門菌的表面抗原。 1974-實現(xiàn)間接免疫金染色法 Romano將膠體金標(biāo)記到馬抗人的IgG上，實現(xiàn)了間接免疫金染色法膠體金技術(shù)的種類及優(yōu)點(diǎn)l 快速免疫金滲濾法快速免疫金滲濾法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫測定。 主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)

3、記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。 l 免疫層析法免疫層析法( immunochromatogra-phy，ICA) 是繼IGFA之后發(fā)展起來的另一種固相膜免疫測定，與IGFA利用微局限性膜的過濾性能不同，免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用(基于層析作用的橫流 （lateral flow） )向另一端移動。移動過程中被分析物與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結(jié)合而被固相化，無關(guān)物質(zhì)則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標(biāo)記物顯色來判定試驗結(jié)果，以膠體金為標(biāo)記物的實驗稱為膠體金免

4、疫層析試驗。免疫膠體金技術(shù)的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 檢測方法簡單而快速，數(shù)分鐘即可得出結(jié)果； 不需儀器設(shè)備，操作人員不需特殊訓(xùn)練； 試劑穩(wěn)定，適用于單份測定； 無污染； GICA的特點(diǎn)是單一試劑，一步操作。小型實驗室即有條件開發(fā)生產(chǎn)。 干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上。 最近由于原料的精選和制作工藝的改進(jìn)，已能制備出可用于定量測定的GICA試劑。Roche公司生產(chǎn)的用于急性心肌梗死診斷的肌鈣蛋白和肌紅蛋白的GICA試劑和匹配的簡便測讀器Cardiac Reader，其精密度和準(zhǔn)確性均符合定量測定要求。 不足： 金免疫測定中應(yīng)用的是單份試劑，難于進(jìn)行質(zhì)量控制。即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個試劑的同

5、一性。因此金免疫測定一般只能用于定性試驗。其定量檢測和靈敏度的提高還有賴于新原料和新材料的開發(fā)與應(yīng)用。膠體金的合成 白磷還原法(1905年)可合成3nm左右大小的金顆粒； 白磷還原法(1925年)經(jīng)改良后，可合成512nm大小的金顆粒； 抗壞血酸還原法(1958年)可合成613nm大小的金顆粒； 檸檬酸三鈉還原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金顆粒； 乙醇超聲波還原法(1980年)可合成610nm大小的金顆粒； 硼氫化鈉還原法(1982年)可合成317nm大小的金顆粒； 單寧酸檸檬酸三鈉還原法(1985年)可合成317nm大小的金顆粒。 膠體金合成 將100ml

6、的0.1H2AuCl4加入200ml的錐形瓶中，并將其置于攪拌電熱爐上，加入一個磁力條并將溶液加熱至沸騰。 向沸騰的溶液中加入1.5ml的0.1二合水檸檬酸三鈉，Na3C6H5O7.2H2O 當(dāng)獲得深紅顏色的溶液時停止加熱制備膠體金試紙條常用的一般是檸檬酸三鈉還原法膠體金膠體金粒徑粒徑（nm）1檸檬酸檸檬酸三鈉加入量三鈉加入量（ml）*呈色呈色max162.00橙色橙色518nm24.51.50橙紅橙紅522nm411.00紅色紅色525nm71.50.70紫色紫色535nm膠體金的合成l注意事項注意事項（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水

7、溶液時，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）是以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。 膠體金的質(zhì)量鑒定優(yōu)質(zhì)金顆粒和劣質(zhì)金顆粒 劣質(zhì)金外形不均一，且非球形，有凝集現(xiàn)象，顆粒間變異系數(shù)較大 。透射電鏡下觀察其顆粒大小及均勻度理想的金顆粒大小基本相等，均勻一致，無橢圓形及多角形的金顆粒存在。 雙電層結(jié)構(gòu)保證了膠體金的穩(wěn)定性，使金顆粒始終以懸浮狀態(tài)存在。膠體金溶液通常由呈單一分散狀態(tài)的金顆粒組成，金顆粒直徑在

8、 1-100nm 之間，而穩(wěn)定的金溶液則要求金顆粒維持在某一固定直徑不變。蛋白通常帶有多種電荷，當(dāng)?shù)鞍讕д姇r，能與膠體金所帶的負(fù)電荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通過疏水作用將蛋白結(jié)合至金顆粒表面；有些蛋白則可通過半胱氨酸的巰基與金顆粒共軛連接。膠體金的蛋白標(biāo)記金標(biāo)樣本程序l將膠體金調(diào)整至正確的pH值l確定最小蛋白含量l最終結(jié)合（標(biāo)記）l純化膠體金調(diào)整正確的pH值 膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。 需要提高膠體金的pH值時可用0.1molK2CO3

9、，需要降低膠體金的pH值時可用0.1N HCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可.常見蛋白標(biāo)記條件最小蛋白用量的確定l （1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520580nm之間測定，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。圖中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最適穩(wěn)定量為45g/ml。l （2）目測法：以目測法確定膠體金與待標(biāo)

10、記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級稀釋后（由5g45g另設(shè)對照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表順序進(jìn)行。發(fā)現(xiàn) 1、2 號管出現(xiàn)黑色沉淀且紅色全部褪去，3 號管雖然能保持紅色，但是管底也出現(xiàn)了一定量的黑色沉淀，而 4、5 號管顏色無變化與對照顏色一致，最低蛋白量即為4號管的蛋白量。最終結(jié)合（McAb） 取100ml金溶液，調(diào)整pH值至8.2 調(diào)整濾過和離心的抗體溶液（0.1g/l）至pH8.2 當(dāng)金溶液在快速攪拌時要逐滴加入定量的抗體（蛋白最小濃度量加10%即蛋白穩(wěn)定量），大約5分鐘加完 在金標(biāo)溶液中加入10

11、ml濾過的10BSA至終濃度為1%，并輕輕攪拌10分鐘。純化l 超速離心法、凝膠過濾法膠體金顆粒/nmpH標(biāo)記蛋白質(zhì)離心力/g時件/min59.0羊抗人IgG4500045108.2McAb4500030156.5鏈霉親和素12000045206.0SPA12000030109.0羊抗兔IgG12000060幾種免疫金探針離心純化條件膠體金免疫層析法試劑的組成u樣品墊(Sample pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。 樣品墊的作用： 減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結(jié)合墊上均勻分布； 去除樣品中雜質(zhì)顆粒； 調(diào)節(jié)樣品液pH值或粘度等。樣品墊可使用化學(xué)物

12、質(zhì)進(jìn)行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗的靈敏度。通常可以將洗滌劑、粘性增強(qiáng)劑、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，該工藝可避免使用復(fù)雜辨識劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測一步完成。u結(jié)合墊(Conjugate pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。結(jié)合墊的作用主要為： -吸附一定量的金標(biāo)結(jié)合物顆粒；-吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上；-保持金標(biāo)結(jié)合物顆粒的穩(wěn)定性；-保證金標(biāo)結(jié)合物顆粒定量完全釋放等。 玻璃纖維膜玻璃纖維膜/聚酯纖維膜聚酯纖維膜u硝酸纖維素膜( Nitrocellulose)： 一般使用Millipore，MDI，S&S，wha

13、tman 等國外公司的硝酸纖維素膜。 NC膜的作用： - 在檢測線和對照線條帶區(qū)域固定抗體；-樣品在NC膜上流動并與試劑混合發(fā)生免疫反應(yīng)；-反應(yīng)在NC膜上顯色，讀檢測結(jié)果 NC膜的重要參數(shù)： 孔徑、對稱性、層析速度、表面活性劑、蛋白結(jié)合力、強(qiáng)度、表面質(zhì)量、厚度、批間均一性等。硝酸纖維膜的選擇u膜的分類標(biāo)準(zhǔn)膜的分類標(biāo)準(zhǔn)(m和和s) m: 指的是膜孔徑 換算情況大致為：8m=135s；6m=180s u不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)的影響不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)的影響 通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應(yīng)時間越長

14、，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。 135s一般用在雙抗體夾心法，一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法一般用在競爭法. u片材： 不干膠塑料襯底，片材的質(zhì)量很大程度上影響了產(chǎn)品的貨架期。u吸收墊(Absorbent Pad)： 提供高吸收率、高容量以及相對穩(wěn)定吸收率的吸收紙； 吸收紙的作用： 主要表現(xiàn)在控制樣品的流速，促進(jìn)虹吸作用以及使試劑跨過膜而不僅僅移到膜上。膠體金免疫層析試紙模式 雙抗體夾心模式 疫病抗原檢測 競爭模式 小分子物質(zhì)檢測 SPA/蛋白G模式 疫病抗體檢測雙抗體夾心模式判定檢測線 質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色競爭模式

15、判定檢測線 質(zhì)控線陽性不顯色顯色陰性顯色顯色SPA/G蛋白模式判定檢測線 質(zhì)控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色膠體金免疫層析試紙質(zhì)量檢測膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用 在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用 Zhang等用克倫特羅制備的單克隆抗體標(biāo)記膠體金作為檢測探針，然后將偶聯(lián) BSA的克倫特羅作為 T 線，以競爭模式組裝成試紙，用于樣品的克倫特羅殘留檢測，為我國食品安全檢測提供了有效的工具。之后 Zhang 的團(tuán)隊采用同樣的模式制備并組裝成功兩類獸藥殘留檢測試紙，分別為磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星殘留檢測膠體金免疫層析試紙，為我國獸藥殘留快速檢測技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。 在獸醫(yī)疫病檢測中的應(yīng)用 Bhakar等應(yīng)用相應(yīng)的單抗標(biāo)金，建立了阿米巴蟲抗原檢測方法。Kameyama等以牛病腹瀉病毒的 NS3 蛋白制備單克隆抗體，并用膠體金標(biāo)記單抗制備膠體金試紙，用于牛病毒性腹瀉抗原的檢測。Kang等以同樣方式建立了豬輪狀病毒膠體金抗原檢測方法，并用于腹瀉仔豬輪狀病毒的鑒別診斷。Li等應(yīng)用實驗室制備的兩種 PRRSV 單抗，以雙單抗夾心的模式，組裝成 PRRSV 抗原檢測試紙，作為