臨床病原學(xué)檢查

1、2臨床病原體檢查目的臨床病原體檢查目的臨床病原體檢查目的臨床病原體檢查目的: :是確定感染的發(fā)生和性質(zhì)，在疾病早期提供是確定感染的發(fā)生和性質(zhì)，在疾病早期提供恰當(dāng)?shù)闹委煼桨?，并采取有效的預(yù)防措施，恰當(dāng)?shù)闹委煼桨福⒉扇∮行У念A(yù)防措施，防止感染傳播造成的危害。防止感染傳播造成的危害。各種不同病原體的實驗診斷方法遵各種不同病原體的實驗診斷方法遵循以下基本原則循以下基本原則1.正確、規(guī)范采集和運送標本。2.直接顯微鏡查見病原體或檢出病原體抗原，借助分子生物學(xué)的方法檢測病原體核酸，結(jié)合病人的病史、癥狀或體征，快速作出初步診斷。3.初步診斷同時，對病原體進行分離與鑒定。4.檢測機體對病原體的免疫產(chǎn)物。5.

2、參與臨床選擇抗菌藥物，指導(dǎo)和監(jiān)控微生物的治療方案，避免 耐藥菌株的產(chǎn)生。5病原學(xué)診斷細菌學(xué)診斷病毒學(xué)診斷真菌學(xué)診斷 直接涂片直接涂片染色鏡檢染色鏡檢分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)形態(tài)特征形態(tài)特征生化試驗生化試驗血清學(xué)試驗血清學(xué)試驗動物實驗動物實驗明明確確診診斷斷初步診斷初步診斷血清學(xué)診斷血清學(xué)診斷細菌的快速鑒定細菌的快速鑒定形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查（常規(guī)培養(yǎng)或特殊培養(yǎng)）（凝集試驗、（凝集試驗、 沉淀反應(yīng)、免疫標記技術(shù)等）沉淀反應(yīng)、免疫標記技術(shù)等）(微生物數(shù)字編碼分類鑒定法、血培養(yǎng)自動化檢測系統(tǒng)、核微生物數(shù)字編碼分類鑒定法、血培養(yǎng)自動化檢測系統(tǒng)、核酸雜交技術(shù)、酸雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、技術(shù)、DNA芯片技術(shù)等）芯片技

3、術(shù)等）藥藥物物敏敏感感試試驗驗7細菌感染檢查檢驗特點通過對標本直接顯微鏡檢，病原菌的分離培養(yǎng)鑒定，病原菌的抗原檢測，核酸檢測和細菌感染后機體免疫應(yīng)答產(chǎn)物的測定及藥物的測定及藥物敏感性試驗，對細菌感染性疾病可作出及時、準確的病原學(xué)診斷。Diagnosis Strategy for Bacterial Infection9 革蘭陽性菌革蘭陽性菌(Gram positive bacteria)(Gram positive bacteria) 革蘭陰性菌革蘭陰性菌(Gram negative bacteria)(Gram negative bacteria)涂片涂片結(jié)晶紫結(jié)晶紫 染色染色碘液碘液媒染媒

4、染酒精酒精脫色脫色復(fù)紅復(fù)紅復(fù)染復(fù)染革蘭染色法（革蘭染色法（Gram Stain）由丹麥醫(yī)生由丹麥醫(yī)生Hans Christian GramHans Christian Gram于于18841884年年創(chuàng)立。創(chuàng)立。1.1.步驟步驟直接涂片染色鏡檢適用于具有特征性形態(tài)和染色性的病原菌,如葡萄球菌、腦膜炎奈瑟菌、抗酸染色陽性的結(jié)核分枝桿菌等。大多數(shù)細菌的形態(tài)與染色并無顯著特異性，因此需要分離培養(yǎng)。如腸道桿菌均為G-桿菌，菌落形態(tài)亦相同。培養(yǎng)特征：化膿性鏈球菌-小而透明、溶血環(huán)。分離培養(yǎng) 生化試驗：如腸道桿菌進行乳糖發(fā)酵試驗。 血清學(xué)試驗：已知抗體測抗原或已知抗原測病人血清中相應(yīng)的抗體。如玻片凝集，鑒

5、定菌種和型。 動物試驗：測定細菌的毒力、病原菌的分離和鑒定。分離培養(yǎng)血清學(xué)診斷血清學(xué)診斷原理：已知抗體測未知抗原進行病原菌的鑒定或用已知抗原檢測患者體液中有無相應(yīng)特異性抗體和其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。標本：雙份血清標本，恢復(fù)期血清抗體效價比急性期升高4倍者方有意義。單份血清效價超過一定標準才有診斷意義。種類：凝集試驗、沉淀試驗、中和試驗、補體結(jié)合試驗。常用的血清學(xué)診斷方法 玻片凝集試驗玻片凝集試驗試管凝集試驗試管凝集試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗細菌的快速鑒定API細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)PCR技術(shù)19姬姆薩染色衣原體包涵體HSV病毒被支原體感染的精子梅毒螺旋

6、體20病毒感染的微生物學(xué)檢查法Diagnosis Strategy for Viral Infection 23病毒感染的微生物學(xué)檢查法ELISA for HIV antibodyMicroplate ELISA for HIV antibody: coloured wells indicate reactivity病毒的數(shù)量與感染性測定蝕斑測定：準確滴定病毒感染性的方法蝕斑（Plaque）每個蝕斑是由一個有感染性病毒顆粒形成，稱為蝕斑形成單位（Plaque forming unit，PFU）。病毒的感染量用PFU/ml表示50%感染量（ID50）或50%組織細胞感染量（TCID50）不能準確

7、地測定感染性病毒顆粒的數(shù)量乙型肝炎的病原學(xué)乙型肝炎的病原學(xué)診診斷斷 病毒性肝炎病毒性肝炎Hepatitis Virus腸道傳播腸道傳播腸道外傳播腸道外傳播F, TTVF, TTV? ? 其他其他病毒性肝炎病毒性肝炎- 背景背景 傳染源糞便血液/血源性物質(zhì)/體液血液/血源性物質(zhì)/體液血液/血源性物質(zhì)/體液糞便傳播途徑糞-口經(jīng)皮膚/經(jīng)粘膜經(jīng)皮膚/經(jīng)粘膜經(jīng)皮膚/經(jīng)粘膜糞-口慢性感染否是是是否病毒性肝炎類型病毒性肝炎類型ABCDE基因組類型 ssRNA dsDNA ssRNA ssRNA ssRNAHepatitis B Virus 乙型肝炎的病原體乙型肝炎的病原體 在全世界廣泛流行，估計全球半數(shù)以上

8、人在全世界廣泛流行，估計全球半數(shù)以上人口已被口已被HBVHBV感染過，感染過，5%5%的人口為的人口為HBVHBV慢性感慢性感染染 中國：乙肝高發(fā)區(qū)，人群中國：乙肝高發(fā)區(qū)，人群HBsAgHBsAg的檢出率達的檢出率達9.8%9.8%HBV virionThe infectious virion is called the DANE particle.HBV Viral Genome OrganizationHBsAgHBcAgHBeAg3200 Base Pair GenomeHepatocyte receptor bindng siteHBV DNA PolymeraseProtein th

9、at transactivates transcriptional promotorsBoth comprised of HBsAgHBV nomenclature HBV: hepatitis B virus HBsAg: hepatitis B virus surface antigen HBsAb: hepatitis B virus surface antibody HBcAg: hepatitis B virus core antigen HBcAb: hepatitis B virus core antibody HBeAg: hepatitis B virus e antigen

10、 HBeAb: hepatitis B virus e antibody抗原抗原組組成成-HBsAg 位于病毒表面，是一種糖蛋白位于病毒表面，是一種糖蛋白 4種亞型種亞型(adr,adw,ayr,ayw) 歐美國家歐美國家: adw 我國漢族我國漢族: adr 我國少數(shù)民族我國少數(shù)民族: ayw 判斷判斷HBV感染的指標之一感染的指標之一 刺激機體產(chǎn)生保護性抗體即抗刺激機體產(chǎn)生保護性抗體即抗-HBs抗原抗原組組成成- - HBcAg 位于位于Dane顆粒核心部分和肝細胞核內(nèi)，在顆粒核心部分和肝細胞核內(nèi)，在血清中不易檢出游離的血清中不易檢出游離的HBcAg 主要成分是蛋白質(zhì)主要成分是蛋白質(zhì) 刺激

11、機體產(chǎn)生抗刺激機體產(chǎn)生抗-HBc(非保護性抗體非保護性抗體) 在乙肝急性期、恢復(fù)期和在乙肝急性期、恢復(fù)期和HBsAg攜帶者中攜帶者中常可檢出抗?？蓹z出抗-HBc 抗抗-HBc IgM常提示病毒處于復(fù)制狀態(tài)常提示病毒處于復(fù)制狀態(tài)抗原抗原組組成成- - HBeAg 位于位于HBVHBV的核心的核心, ,是一種可溶性蛋白抗原是一種可溶性蛋白抗原 HBeAgHBeAg和和DaneDane顆粒出現(xiàn)相平行，且與顆粒出現(xiàn)相平行，且與DNADNA多聚酶在血中的消多聚酶在血中的消長動態(tài)相符合長動態(tài)相符合 血中血中HBeAgHBeAg的出現(xiàn)可作為的出現(xiàn)可作為HBVHBV復(fù)制及血清有感染性的指標復(fù)制及血清有感染性的

12、指標 刺激機體產(chǎn)生抗刺激機體產(chǎn)生抗- -HBeHBe 抗抗- -HBeHBe能與受染肝細胞表面的能與受染肝細胞表面的e e抗原結(jié)合抗原結(jié)合, ,通過補體介導(dǎo)破通過補體介導(dǎo)破壞受染的肝細胞壞受染的肝細胞, ,抗抗- -HBeHBe的出現(xiàn)是預(yù)后良好的征象的出現(xiàn)是預(yù)后良好的征象抗原抗原組組成成- Pre-S- Pre-S抗原抗原 位于位于HBV的外衣殼上，有兩種的外衣殼上，有兩種 刺激機體產(chǎn)生抗刺激機體產(chǎn)生抗Pre-S1和抗和抗Pre-S2，能阻斷能阻斷HBV與與肝細胞受體結(jié)合，從而起到抵抗病毒的作用肝細胞受體結(jié)合，從而起到抵抗病毒的作用 抗抗Pre-S1和抗和抗Pre-S2的出現(xiàn)，表示病情好轉(zhuǎn)，趨

13、向的出現(xiàn)，表示病情好轉(zhuǎn)，趨向痊愈痊愈傳傳染源染源 患者患者 潛伏期潛伏期 急性期急性期 慢性期慢性期 無癥狀無癥狀HBsAg攜攜帶帶者者 各種體液中各種體液中HBV的的濃濃度度 血源性傳播 輸血、注射、外科和牙科手術(shù)、針刺等 剃刀、牙刷和蚊蟲叮咬等 母嬰垂直傳播 宮內(nèi)傳播 分娩時微小皮損處傳播 產(chǎn)后母嬰密切接觸 性傳播HBV 傳傳播途徑播途徑 高高 (8%): (8%): 占占45%45% 一生感染的危險一生感染的危險 60% 60% 嬰幼兒感染常見嬰幼兒感染常見 中等中等 (2% (2%7%): 7%): 占占43% 43% 一生感染的危險是一生感染的危險是 20% 20%60%60% 感染

14、存在于所有年齡組感染存在于所有年齡組 低低 (2%): (2%): 占占12%12% 一生感染的危險一生感染的危險 20% 20% 許多感染發(fā)生在成人危險組許多感染發(fā)生在成人危險組Global Patterns of Chronic HBV Infection病原學(xué)診斷病原學(xué)診斷- -抗原抗體檢測抗原抗體檢測l 項目：項目：HBsAg、抗抗-HBs、HBeAg、抗抗-HBe、抗抗-HBc以及以及抗抗-HBc IgMl 方法方法ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性最常用，定性)發(fā)光免疫分析發(fā)光免疫分析(定量定量)反相間接血凝試驗反相間接血凝

15、試驗(少用少用)ELISA的基本原理的基本原理 利用抗原和抗體特異性結(jié)合利用抗原和抗體特異性結(jié)合 主要的試劑主要的試劑 固相抗原或抗體固相抗原或抗體 酶標記的抗原或抗體酶標記的抗原或抗體 酶的底物酶的底物ELISA的主要方法的主要方法 間接法間接法: 測定抗測定抗-HBs 夾心法：測定夾心法：測定HBsAg和和HBeAg 競爭法：測定抗競爭法：測定抗-HBc 中和法：測定抗中和法：測定抗-HBe 捕捉法：測定抗捕捉法：測定抗-HBc IgM病原學(xué)診斷病原學(xué)診斷( (二二) )-核酸檢測核酸檢測 核酸雜交核酸雜交 探針探針 PCRPCR 引物引物 HBsAg 感染的標志感染的標志 Anti-HB

16、s 既往感染既往感染/接種疫苗接種疫苗 Anti-HBc IgM 急性感染標志急性感染標志 Anti-HBc IgG 既往或慢性感染既往或慢性感染 HBeAg 急性病毒復(fù)制，有傳染性急性病毒復(fù)制，有傳染性 Anti-HBe 病毒不再復(fù)制病毒不再復(fù)制 HBV-DNA 急性病毒復(fù)制，比急性病毒復(fù)制，比HBeAg更準確；更準確；主要用于監(jiān)測治療反應(yīng)主要用于監(jiān)測治療反應(yīng)血清學(xué)血清學(xué)檢測檢測的的臨臨床意床意義義HBsAg 抗抗-HBs HBeAg 抗抗-HBe 抗抗-HBc 臨臨床意床意義義急性或慢性感染急性或慢性感染(大三陽大三陽)+-+-+乙肝后期或慢性感染乙肝后期或慢性感染(小三陽小三陽)-+-潛

17、伏期或急性乙肝早期潛伏期或急性乙肝早期-+痊愈或恢復(fù)期痊愈或恢復(fù)期,有免疫力有免疫力-+-痊愈痊愈,有免疫力有免疫力疫苗接種或曾疫苗接種或曾經(jīng)經(jīng)感染感染過過,有免疫力有免疫力SymptomsHBeAganti-HBeTotal anti-HBcIgM anti-HBcanti-HBsHBsAg0481216202428323652100Acute HBV Infection with RecoveryTypical Serologic CourseWeeks after ExposureTitreIgM anti-HBcTotal anti-HBcHBsAgAcute(6 months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe048 12 16 20 24 28 32 3652YearsWe