DNA重組技術(shù)與基因操作 (2)

1、DNADNA重組技術(shù)要有四重組技術(shù)要有四個(gè)必要條件：個(gè)必要條件：工具酶、工具酶、基因、基因、載體、載體、受體細(xì)胞受體細(xì)胞 限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶，可以限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶，可以識(shí)別識(shí)別并切開(kāi)并切開(kāi)核酸序列特定位點(diǎn)核酸序列特定位點(diǎn)分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀 ArberArber、SmithSmith和和NathansNathans因?yàn)樵诎l(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面因?yàn)樵诎l(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面開(kāi)創(chuàng)性工作而共同獲得了開(kāi)創(chuàng)性工作而共同獲得了19781978年的諾貝爾年的諾貝爾獎(jiǎng)。獎(jiǎng)。核酸內(nèi)切限制酶的類型及其主要特性核酸內(nèi)切限制酶的類型及其主要特性 被限制酶切開(kāi)的被限制酶切開(kāi)的

2、DNA兩條單鏈的切口，兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫做叫做 粘性末端。粘性末端。EcoEcoRIRI特異識(shí)別特異識(shí)別GAATTCGAATTC及其互補(bǔ)堿及其互補(bǔ)堿基組成的雙鏈片段基組成的雙鏈片段SmaSma特異識(shí)別特異識(shí)別CCCGGG,CCCGGG,形成平形成平末端末端5CCC GGG3 GGG CCC5CCC GGGGGG3CCCstar activity：指當(dāng)酶的反應(yīng)條件改變時(shí)，其在識(shí)別：指當(dāng)酶的反應(yīng)條件改變時(shí)，其在識(shí)別序列中的酶切位點(diǎn)發(fā)生改變。序列中的酶切位點(diǎn)發(fā)生改變。產(chǎn)生的原因：反應(yīng)體系中甘油

3、的濃度產(chǎn)生的原因：反應(yīng)體系中甘油的濃度12；酶：；酶：DNA比率比率25u/g ；缺少；缺少Nacl和存在和存在Mn2。連接的部位連接的部位：磷酸二酯鍵（梯子的扶手），磷酸二酯鍵（梯子的扶手），不是氫鍵（梯子的踏板）。不是氫鍵（梯子的踏板）。5 HOOH 3HOOH355突出末端突出末端5隱蔽末端隱蔽末端532 POH 3HO32P3532P ATP5 POH 3HOP355突出末端突出末端5隱蔽末端隱蔽末端OHHO5HOOH 335AOCSCL穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒:人工人工構(gòu)建的具有兩種構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，可在選擇記號(hào)，可在兩種不同的寄主兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和

4、復(fù)細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體制的質(zhì)粒載體。 噬菌體也可以進(jìn)入溶源循噬菌體也可以進(jìn)入溶源循環(huán)，即注入的環(huán)，即注入的DNADNA整合到大整合到大腸桿菌的染色體中，以前噬腸桿菌的染色體中，以前噬菌體的形式潛伏起來(lái)，永久菌體的形式潛伏起來(lái)，永久保留。保留。整合切割區(qū)域整合切割區(qū)域尾部尾部基因基因頭部頭部基因基因粘性粘性末端末端粘性粘性末端末端負(fù)責(zé)負(fù)責(zé)DNA復(fù)復(fù)制的基因制的基因細(xì)胞裂細(xì)胞裂解基因解基因噬菌體的噬菌體的DNA示意圖示意圖左臂左臂右臂右臂噬菌體噬菌體DNA分子示意圖分子示意圖應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體進(jìn)行基因克隆的一般程序應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體進(jìn)行基因克隆的一般程序利用柯斯質(zhì)?？寺〈笃卫每滤官|(zhì)?？寺〈笃?/p>

5、段DNApYAC4結(jié)構(gòu)圖結(jié)構(gòu)圖1、 細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離l 細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離程序l 紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液的純度和濃度。2 2、基因重組的方法、基因重組的方法：1 1）根據(jù)外源）根據(jù)外源DNADNA片段末片段末端的性質(zhì)同載體上適當(dāng)端的性質(zhì)同載體上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)相連實(shí)現(xiàn)基的酶切位點(diǎn)相連實(shí)現(xiàn)基因的體外重組因的體外重組。5TCGAAGCT5xho I5GATCCTAG5Sau3A I5TCGAAGCT5CTTC5GATCCTAG5AGGCdCTP、dTTP、dATP、dGTPKlenown酶酶Pst1質(zhì)粒質(zhì)粒pGCTGCAACGTCGpCTGCAGGGGGGpGGpGGGGGGAC

6、GTCAAAAAAAmRNAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAACCCCCCTTTTTTTCCCCCC用末端轉(zhuǎn)移酶加（用末端轉(zhuǎn)移酶加（dG）殘基）殘基用末端轉(zhuǎn)移酶加（用末端轉(zhuǎn)移酶加（dC）殘基）殘基以以oligo(dT)作引物作引物合成合成cDNA第一鏈第一鏈合成合成cDNA第二鏈第二鏈退火退火CTGCAGGGGGAAAAAAACCCCCC G G CCCCCCTTTTTTTGGGGGGACGTC轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌菌株選轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌菌株選擇抗生素抗性擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，轉(zhuǎn)化過(guò)程中，DNA上的缺口為宿上的缺口為宿主酶所修復(fù)，從而在主酶所修復(fù)，從而在cD

7、NA兩端恢兩端恢復(fù)復(fù)Pst1位點(diǎn)位點(diǎn)Pst1Pst1cDNA3 3、重組、重組DNADNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞1)1)轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化：由于外源由于外源DNADNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界接受外界DNADNA，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNADNA接觸，接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率就能提高轉(zhuǎn)化效率4、 一般克隆基因的檢查和鑒定方法 瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷酶解片段向陽(yáng)極移動(dòng)電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)力和凝膠阻力 不同遷移率分

8、子量標(biāo)準(zhǔn)參照物l 酶切和電泳方法宿主生長(zhǎng)宿主生長(zhǎng) 依賴依賴Leu重組體重組體 + 目的基因目的基因 能夠合成能夠合成Leu 在沒(méi)有在沒(méi)有Leu存在時(shí)存在時(shí) 能生長(zhǎng)（已轉(zhuǎn)化）能生長(zhǎng)（已轉(zhuǎn)化） 重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中 在沒(méi)有在沒(méi)有Leu存在時(shí)存在時(shí) 不生長(zhǎng)（沒(méi)有轉(zhuǎn)化）不生長(zhǎng)（沒(méi)有轉(zhuǎn)化）原位雜交原位雜交點(diǎn)雜交和點(diǎn)雜交和southernsouthern雜交雜交（1 1）提取總提取總DNADNA（2 2）酶解酶解（3 3）電泳）電泳（4 4）轉(zhuǎn)移到濾膜）轉(zhuǎn)移到濾膜（5 5）變性解鏈）變性解鏈（6 6）DNADNA探針及雜交探針及雜交（7 7）洗脫）洗脫（8 8）放射自顯影）放射自顯影（9

9、9）比較分析）比較分析SouthernSouthern雜交雜交 A. DNAA. DNA體外重組實(shí)驗(yàn)體外重組實(shí)驗(yàn) B. B. 抗生素篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)抗生素篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)胞胞 C. C. 培養(yǎng)突變株細(xì)胞培養(yǎng)突變株細(xì)胞 D. SouthernD. Southern雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外源目的基因已果顯示，外源目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入突變株細(xì)胞中經(jīng)轉(zhuǎn)入突變株細(xì)胞中SouthernSouthern雜交分析示例雜交分析示例LacZ+EcoRIEcoRIEcoRILacZ感染感染在培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落在培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜菌落的蛋白質(zhì)裸露出來(lái)菌落的蛋白質(zhì)裸露出來(lái)一抗與裸露的蛋白質(zhì)結(jié)合一抗與裸露的蛋白質(zhì)結(jié)合二抗與

10、一抗結(jié)合二抗與一抗結(jié)合顯色顯色找出陽(yáng)性克隆找出陽(yáng)性克隆裂解裂解加一抗加一抗洗去游離的一抗，加二抗洗去游離的一抗，加二抗洗去游離的二抗，加顯色劑洗去游離的二抗，加顯色劑克隆克隆PCR產(chǎn)物；產(chǎn)物；通用引物：通用引物：pUC/M13 primer8)、DNA的序列分析：的序列分析： 這是最后確定分離的基因是否具有與天然基因相這是最后確定分離的基因是否具有與天然基因相同序列的唯一方法，也是最確定的方法同序列的唯一方法，也是最確定的方法 鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥(niǎo)槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組組DNADNA片段，然后通過(guò)快速有片段，然后通過(guò)快速有效的篩選

11、程序從眾多克隆中效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有分離出含有目的基因的目的目的基因的目的重組子重組子，進(jìn)而獲得目的基因，進(jìn)而獲得目的基因。鳥(niǎo)槍法適用于原核細(xì)菌目。鳥(niǎo)槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離的基因的克隆分離 . .2 2、在連接前將、在連接前將DNA片段進(jìn)行分片段進(jìn)行分級(jí)分離級(jí)分離 例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 kb的的SalI片段中，將染色體片段中，將染色體DNA用用SalI切開(kāi)，瓊脂糖凝膠電泳分離，切開(kāi)，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于用刀片切下相當(dāng)于1.6 - 2.0 kb大大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收回收DN

12、A片段，然后與載體進(jìn)行拼片段，然后與載體進(jìn)行拼接接2.0 kb1.6 kb1.8 kb隨機(jī)隨機(jī)引物引物自身引導(dǎo)法自身引導(dǎo)法反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶RNaseH（部分降解）（部分降解）DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA連接酶連接酶RNA55cDNA第一鏈第一鏈33RNA55555555cDNA第一鏈第一鏈3cDNA第二鏈第二鏈置置換換合合成成法法組組織織或或細(xì)細(xì)胞胞染染色色體體D DN NA A限制性內(nèi)切酶基因片段克隆載體重重組組D DN NA A分分子子受體菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA復(fù)制雙雙鏈鏈c cD DN NA A載體重重組組D DN NA A分分子子受體菌含重組分子的轉(zhuǎn)

13、化菌基因的化學(xué)合成及克隆圖解基因的化學(xué)合成及克隆圖解535353退火退火DNA連接酶連接酶退火退火DNA連接酶連接酶退火退火DNA連接酶連接酶退火退火T4DNA連接酶連接酶EcoRBamH合成的合成的DNA全基因全基因AmpTetEcoRBamH合成的基因合成的基因轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化EcoRBamHAmpr TettAmpEcoRBamHAmpr Tett合成的合成的基因基因基因的化學(xué)酶促合成圖解基因的化學(xué)酶促合成圖解磷酸化磷酸化退火退火DNA多聚酶多聚酶Iklenow片段片段dNTP限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶分子克隆分子克隆55551、PCR技術(shù)的發(fā)明 PCRPCR的的發(fā)明是發(fā)明是DNADNA操作技術(shù)的

14、革命操作技術(shù)的革命 美國(guó)美國(guó)MullisMullis教授教授 開(kāi)汽車(chē)時(shí)的聯(lián)想開(kāi)汽車(chē)時(shí)的聯(lián)想 逶迤崎嶇的山路逶迤崎嶇的山路DNADNA雙螺旋雙螺旋 行駛的汽車(chē)行駛的汽車(chē)一小段一小段DNADNA引物引物 19881988年發(fā)明了年發(fā)明了PCRPCR技術(shù)技術(shù) 19931993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)年獲得諾貝爾獎(jiǎng)四、利用四、利用PCRPCR或或RT-PCRRT-PCR分離基因分離基因Mullis開(kāi)車(chē)的時(shí)候開(kāi)車(chē)的時(shí)候, 瞬間感覺(jué)兩排路燈就是瞬間感覺(jué)兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車(chē)和對(duì)面的兩條鏈，自己的車(chē)和對(duì)面開(kāi)來(lái)的車(chē)象是開(kāi)來(lái)的車(chē)象是DNA聚合酶，面對(duì)面地合成著聚合酶，面對(duì)面地合成著DNA， PCR 動(dòng)畫(huà)動(dòng)畫(huà)

15、過(guò)過(guò) 程程帽子帽子AAAAA mRNA35TTTTT以其為模板進(jìn)行以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄合成合成cDNA互補(bǔ)鏈并退火互補(bǔ)鏈并退火寡聚寡聚dT引物引物53DNA序列序列GGGGG 353GGGGG5GGGGG 353GGGGG5錨定引物錨定引物CCCCC（多聚（多聚dC引物）引物）進(jìn)行進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增5GGGGG 3CCCCC加多聚加多聚dG尾巴尾巴加入引物加入引物已知序列已知序列擴(kuò)出的未知序列擴(kuò)出的未知序列53LR酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)LR已知序列已知序列限制性內(nèi)切酶酶解限制性內(nèi)切酶酶解環(huán)化環(huán)化REabadcdc直接測(cè)序或克直接測(cè)序或克隆后再測(cè)序隆后再測(cè)序AG用同聚物加尾法再生用同聚物加尾法再生Hind識(shí)別位識(shí)別位點(diǎn)點(diǎn)AAGCTTTTCGAA載體分子載體分子35加加Hin