分子生物學重點

1、 &遺傳物質的基本特點：必須穩(wěn)定地含有關于有機體細胞結構、功能、發(fā)育和繁殖的各種信息必須能精確的復制，使后代具有與親代細胞相同的信息必須能夠變異，為生物的進化提供基礎 &生物的遺傳物質是DNA：肺炎雙球菌轉化實驗 體外轉化實驗 噬菌體轉導實驗 &DNA雙螺旋模型：意義：對生命科學的發(fā)展作用可與達爾文學說媲美，與孟德爾定律齊名。從而使遺傳學的研究全面進入分子遺傳學階段 &確定了遺傳信息的傳遞方式：操縱子學說；三聯(lián)體密碼說”；中心法則這三大發(fā)現(xiàn)大大促進了生命科學的迅速發(fā)展，為基因工程的誕生奠定了重要的理論基礎右手螺旋：A-DNA、B-DNA、C-DNA、D-DNA左

2、手螺旋：Z-DNA螺旋盤繞的松散程度受DNA分子的內力影響，DNA雙螺旋結構永遠處于動態(tài)平衡中，條件變化，B-DNA構象變化，可以形成A-DNA或C-DNA等。&大溝和小溝是DNA行使功能時蛋白質的識別位點，構象發(fā)生變化，蛋白質對DNA分子的識別也發(fā)生相應變化 &核酸分子中的回文序列：回文序列中的單鏈可形成發(fā)卡結構；雙鏈回文序列可形成十字架結構&超螺旋的意義：緊密，體積更?。荒苡绊戨p螺旋的解鏈程序，因而影響DNA分子與其它分子之間的相互作用。包括正超螺旋和負超螺旋，在一定條件下，可互相轉變。雙螺旋DNA的松開導致負超螺旋，而擰緊則導致正超螺旋。 &超螺旋DNA的

3、性質：結構緊密，粘度較低，浮力密度大，沉降速度快。&核內不均一RNA（hnRNA）：真核細胞mRNA的原始轉錄物是分子量極大的前體，在核內加工過程中所形成的分子大小不一的中間產物。&開放閱讀框，ORF：mRNA分子上從起始密碼子開始到終止密碼子結束的一段連續(xù)的核苷酸序列，即mRNA分子上的編碼區(qū)。&真核生物mRNA的結構：3端具有polyA結構；5端具有帽子結構；只有一個開放閱讀框。&原核生物mRNA的結構：3端不具有polyA結構；具有一個或多個開放閱讀框。&tRNA的二級結構 ：aa接受臂（amino acid arm）二氫尿嘧啶環(huán) （DHU loo

4、p）反密碼環(huán)（anticodon loop）額外環(huán)（extra loop） TC環(huán)（TC loop）同功tRNA：識別同種氨基酸，但反密碼子不同的多個tRNA。多數(shù)tRNA和少數(shù)tRNA：反密碼子相同但結構不同的tRNA。副密碼子：tRNA分子上決定其攜帶何種氨基酸的區(qū)域，能被AA-tRNA合成酶識別。&核酶(Ribozyme)是一種具有核酸內切酶活性的反義RNA分子，可特異性地切割靶RNA序列，具有解離后重復切割相同靶分子的能力。&核酶的類型：剪切型核酶，催化自身或者異體RNA的切割，相當于核酸內切酶。剪接型核酶，具有核酸內切酶和連接酶兩種活性。&核酶的催化活性：核苷

5、酸轉移作用；磷酸二酯鍵水解作用 ；磷酸轉移反應催化作用 ；脫磷酸作用；限制性內切酶作用 &核酸的雜交：不同來源的、序列互補的單鏈RNA、DNA，或DNA和RNA，根據(jù)堿基互補原則，借助氫鍵連接為雙鏈分子的過程。& 核酸的變性： 指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，但并不涉及共價鍵的斷裂 變性方法：熱變性、酸堿變性、化學變性劑 增色效應（hyperchromicity）由于DNA變性而引起的光吸收增加的現(xiàn)象 DNA的融點（或熔解溫度，Tm）DNA分子的一半發(fā)生變性時的溫度為Tm。DNA分子的變性是一個爆發(fā)過程，變性作用發(fā)生在一個很狹窄的溫度范圍（68），變性曲線為雙曲線 &

6、;核酸的復性：指變性DNA分子在適當條件下，兩條彼此分開的鏈自發(fā)重新締合成為雙螺旋結構復性過程：成核作用；拉拉鏈作用 復性條件：1、足夠的鹽濃度，0.150.50mol/L2、合適的溫度：比Tm低20253、樣品的性質4、DNA的濃度5、DNA片段的大小&分子雜交技術 利用核酸雙鏈的堿基互補、變性和復性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針，與待測樣本中的單鏈核酸互補配對，以判斷有無互補的同源核酸序列的存在。 目的：運用特異性探針鑒定復雜的靶DNA中同源的DNA片段。&雙鏈probe或DNA解鏈主要取決于： 1鏈的長度：鏈越長，需要的 能量多才能解鏈； 2堿基成分：G

7、C含量高，較難變性； 3化學環(huán)境：單價陽離子穩(wěn)定雙鏈，甲酰胺，尿素破壞雙鏈&核酸探針：是指帶有標記的某一特定DNA或RNA片斷，能與待測樣本中單鏈核酸分子互補配對結合，進而檢測同源序列。&將探針標記上一種標識物以便雜交后檢測。常用于標記探針的標識物 ： 同位素：32P , 35S , 3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP ，生物素-dNTP。常用的標記方法：缺口平移法；隨機引物法探針來源：基因組探針；DNA克??；cDNA探針；寡核苷酸探針缺口平移法：DNA酶I；DNA聚合酶I：5 3外切酶活性、5 3的聚合酶活性、隨機引物法：DNA聚合酶I的Klenow亞單位：5 3聚

8、合酶活性。&常用核酸分子雜交方法：Southern 印跡雜交法；Northern 印跡雜交法；斑點雜交或狹縫雜交法；菌落雜交；夾心雜交法；原位雜交&基因芯片是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接將大量DNA探針以點涂的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可得出樣品的信號（即基因序列或表達的信息）突出特點：高度并行性、多樣性、微型化、自動化 &反義核酸（antisense nuleic acid）是根據(jù)堿基互補原理，用人工合成或生物體自身合成的特定互補的DNA或RNA片段（或其化學修飾的衍生物），能夠與目的序列結合，通過空間位阻效

9、應或誘導RNase活性的降解作用，在復制、轉錄、剪接、mRNA轉運及翻譯等水平，抑制或封閉目的基因的表達反義技術：根據(jù)堿基互補原理，用人工合成或生物體自身合成的特定互補的DNA或RNA片段（或其化學修飾產物）抑制或封閉目的基因的表達的技術。有反義DNA、反義RNA、肽核酸&肽核酸，PNA：是指在特定肽鏈上連接不同堿基的核酸。即：以類氨基多肽鏈（N-氨基乙烷基乙酸鏈）代替核酸中的磷酸戊糖骨架，并按一定序列結合上標準的A、G、C、T堿基.第三代反義寡核苷酸藥物（肽核酸）作用 肽核酸可與互補DNA或RNA特異性結合，抑制或封閉基因表達。特點 與靶基因結合能力強，穩(wěn)定性好，易吸收，在體內具有內

10、切酶活性和抑制端粒作用。&反義核酸的有效抑制結合區(qū)：1、mRNA5端非翻譯區(qū)2、mRNA5端編碼區(qū)，主要是3、始密碼AUG4、mRNA5端帽子形成位點5、前體mRNA外顯子和內含子結合部位6、mRNApolyA形成位點7、阻止mRNA的成熟和向胞漿的轉運 &RNA干擾：RNAi：一條短小的單鏈RNA與一條mRNA的互補區(qū)發(fā)生堿基配對作用，從而阻遏這條mRNA的表達。即一種RNA能夠有效地控制另一種RNA的活性。具有RNA干擾作用的RNA分子稱為小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）.&RNAi的效應：siRNA與靶mRNA形成的雙鏈結構阻

11、止其它蛋白因子與靶mRNA的結合；影響靶mRNA其它區(qū)域的空間結構的形成；形成的雙鏈結構體區(qū)會成為雙鏈RNA酶的作用靶標，使靶mRNA被降解。&RNAi 的特點：轉錄后水平的基因沉默；較高的特異性；高效性；可遺傳性及遠距離效應&病毒核酸的一般特征：病毒核酸分子大小差別很大；病毒核酸存在形式多樣；病毒核酸分正、負鏈；病毒基因組具有操縱子結構；噬菌體基因組中無內含子，但動物病毒的基因組中具有內含子；病毒基因組織有重疊基因的存在。&端粒（telomere）真核細胞染色體末端的蛋白質-DNA復合體，是染色體必需的組成部分。&端粒的功能：能封閉正常染色體末端，維持了染色體

12、結構的完整性。保證遺傳信息的完全復制。端粒使染色體具有極性，保證了染色體在細胞周期中的正常行為。在維持細胞核的三維結構及染色體配對中起一定的作用。端粒起到細胞分裂計時器的作用。&端粒酶（telomerase)：化學性質是核糖核蛋白,是一種自身攜帶模板的反轉錄酶，催化端粒DNA的合成，能夠在缺少DNA模板的情況下, 以自身攜帶的RNA為模板，逆轉錄合成端粒DNA并添加于染色體末端，從而維持了端粒長度的穩(wěn)定。端粒酶RNA作為合成端粒DNA的模板；端粒酶蛋白亞基具有逆轉錄酶活性。&真核生物DNA分類 ：非重復序列（單拷貝序列）；輕度重復序列；中度重復序列；高度重復序列&組蛋白

13、：特點：分子量??；堿性蛋白質；含量高，每種分子數(shù)可達6 000萬個；沒有種屬和組織專一性；類型 ： 核小體組蛋白：H2A、H2B、H3、H4；H1組蛋白；功能：組蛋白分子中的正電荷使組蛋白借靜電引力與帶負電荷的磷酸形成穩(wěn)定的鹽鍵，使組蛋白與DNA分子緊密結合。&非組蛋白：特點 ： 酸性蛋白質；帶負電荷；含量低，種類多（數(shù)百），每種僅1萬個分子；具有種屬和組織特異性類型：一半是結構蛋白質；一半為酶類；如DNA聚合酶、RNA聚合酶等功能 ：為序列特異性DNA結合蛋白，能從DNA雙鏈的大溝、小溝中識別特定的堿基排列并與堿基形成氫鍵，從而與一段較短的特異DNA序列結合&重疊基因：病毒和

14、噬菌體中，以有限的堿基編碼更多的遺傳信息。重疊類型：1、異相位基因重疊：終止密碼子與起始密碼子重疊。2、同相位基因重疊：合成的多肽鏈僅長短不同，氨基酸序列相同。3、反相位基因重疊：DNA雙鏈都有編碼功能。&非組蛋白具體功能：參與染色體的構建；啟動基因的復制；調控基因的轉錄 &真核生物組蛋白的共價修飾包括：乙?；?、甲基化、磷酸化。修飾作用的共同點降低組蛋白所攜帶的正電荷。修飾作用表現(xiàn)為周期性，提示可能與組蛋白功能的改變有關&基因：是有功能的DNA片段，含有合成有功能的蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部核苷酸序列，是遺傳的結構和功能單位。包括編碼蛋白質肽鏈或RNA的編碼序列以

15、及保證其轉錄所必需的調控序列。&假基因：不能轉錄或轉錄后不能生成無功能的蛋白質的基因。&完整的基因：前導區(qū)、尾部區(qū)、內含子和外顯子；前導區(qū)（leader） 位于編碼區(qū)的前面，相當于mRNA起始密碼5端的序列；尾部區(qū)（trailer） 位于編碼區(qū)之后，指mRNA3端終止密碼子后面的非翻譯序列；內含子（intron） 位于編碼序列之間，通常指基因中能被轉錄成前體轉錄物，但卻不能成為mRNA組成部分的區(qū)域；外顯子（exon） 即編碼序列，也就是DNA分子中編碼mRNA某一部分序列的區(qū)域。 &原核生物基因特征：功能相關的基因高度集中，構成操縱子；重復序列少；沒有內含子，基因是連

16、續(xù)的；多順反子，構成轉錄單位；絕大部分DNA都是用于編碼蛋白質的，只有很少不編碼的序列；基因組較小，1分子環(huán)狀雙鏈DNA。&真核生物基因特征：1、核基因組由染色體DNA組成：分子量較大；結構復雜；與蛋白質（組蛋白、非組蛋白）結合；2、多數(shù)都是斷裂基因：即編碼序列（外顯子）被非編碼序列（內含子）間隔開；3、基因家族：起源相同、結構相似、功能相關的一組基因。4、大量重復序列（2060）：單一序列、輕度重復序列、中度重復序列、高度重復序列；5、單順反子； &斷裂基因（splite gene）：非編碼序列與編碼序列相連，內含子將編碼區(qū)分隔成多個片段稱內含子是相對的：一個基因中的內含子可

17、能是另一個基因的外顯子；有的內含子可編碼。斷裂基因的意義：有利于儲存較多的遺傳信息；有利于變異和進化。&基因家族：分為編碼RNA的（如snRNA、tRNA、rRNA等）和編碼蛋白質的；分類：基因簇：串聯(lián)排列的基因；（組蛋白基因簇）分散分布的基因家族超基因家族：是由基因家族和單基因組成的較大的基因家族。 組蛋白基因家族；rRNA基因家族&高度重復序列的結構特點分為反向重復序列和衛(wèi)星DNA&反向重復序列：雙鏈DNA分子中某一段序列，方向相反，序列相同，也稱為回文序列。作用：可形成十字形發(fā)夾環(huán)結構與特異的DNA結合蛋白相互作用；含有特異的限制性核酸內切酶識別序列。功能：可能與

18、復制、轉錄的調控有關 &衛(wèi)星DNA：在蔗糖或氯化銫密度梯度超速離心中的浮力密度曲線圖上位于DNA主帶旁邊的小帶DNA。結構：串聯(lián)重復序列，每個重復序列中含有一個短的保守的重復單位，稱為核心序列。功能：染色體定位、染色體折疊壓縮，染色體配對分離。&多順反子：一條mRNA可指導幾條肽鏈合成的共用一個前導序列原癌基因（proto-oncogene）為細胞的正?；颍嗑幋a控制細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖的各種調控因子和活性蛋白，是細胞正常功能所必需；癌基因（oncogene）為原癌基因的突變形式，或改變了表達方式（過量、產物活性的改變，等），其結果是引起正常細胞的癌變。原癌基因的激活

19、與細胞生長和分化密切相關，原癌基因的激活受到嚴格的控制。抑癌基因（anti-oncogene）是正常細胞分裂、生長的負性調控基因，其編碼的蛋白質抑制細胞增殖分裂。抑癌基因失活導致腫瘤的形成。1、基因水平上的缺失、插入、突變和重組；2、轉錄、轉錄后加工、翻譯或蛋白質降解異常；3、蛋白質功能異常；&基因組：細胞中一套完整單體的遺傳物質的總和?；蚪M結構主要指不同的DNA功能區(qū)在DNA分子中的分布和排列情況?；蚪M并非基因的隨機組合，而是功能性的高級結構。&C值(C value) 一種物種的單倍體基因組的DNA總量C值是特異的。不同物種的C值差異極大。在真核生物中，C值一般隨著生物的

20、進化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。&C值悖理：生物的復雜性與基因組的大小并不完全成比例增加&遺傳圖譜（genetic map）：即連鎖圖譜，以具有遺傳多態(tài)性的遺傳標記為“路標”，以遺傳學距離為圖距的基因組圖。&DNA分子遺傳標記：第一代限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）； 第二代小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA）、微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA） ； 第三代單核苷酸多態(tài)性（SNP）； &限制性片段長度多態(tài)性 （RFLP）：原理： DNA序列上的微小變化，甚至1個核苷酸的變化，也能引起限制性內切酶切點的丟失或產生，導致酶切

21、片段長度的變化。優(yōu)點： RFLP的出現(xiàn)頻率遠遠超過了經典的蛋白質多態(tài)性。而且只要選擇得當，生物體內出現(xiàn)共顯性RFLP及RAPD分子標記的頻率較高。局限：一般只能產生限制酶切位點的“切開”和“不切開”兩種情況，所提供的多態(tài)性信息量較小。進行RFLP分析時，既不安全又不易自動化。 &小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA）是指重復單位長度在1565個核苷酸左右的串聯(lián)重復序列，一般長度不超過20kb。散布于人類各染色體的不同部位，其重復次數(shù)（即小衛(wèi)星DNA區(qū)的長度）在人群中是高度變異的。同時又按照孟德爾規(guī)律遺傳，所以是很好的DNA多態(tài)性標記，被廣泛應用于基因定位、DNA指紋分析和遺

22、傳病的連鎖診斷。 &微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）是指重復單位長度在26個核苷酸之間的串聯(lián)重復序列。也稱為簡短串聯(lián)重復序列。&單核苷酸多態(tài)性（SNP）：指基因組中核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性。包括單堿基轉換、顛換、插入/缺失等。&物理圖譜 (physical map)：以一段已知核苷酸序列的DNA片段（序列標記位點sequence tagged site，STS）為路標，以Mb或kb為圖距的基因組圖。 STS其實只是基因組中任何單拷貝的短DNA序列，長度在100500bp之間。物理圖譜是用物理學方法定位的由客觀物組成的圖譜。物理圖的主要

23、內容是建立相互重疊連接的“相連DNA片段群”。&基因圖譜：即基因轉錄圖（cDNA圖），或者基因的cDNA片段圖，也就是表達序列標簽圖。目標：鑒別全部基因，包括RNA基因，以及基因組中其它序列的結構和功能。&人類基因組計劃，HGP：人類基因組即人類一個細胞所包含的DNA結構一整套基因，攜帶決定生物特性的全部遺傳信息即記錄基因組全部DNA序列。&大規(guī)模測序基本策略：“ 逐個克隆法 ”；“ 全基因組鳥槍法 ”&鏈終止法測序(the chain termination method)：基本原理: 通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止

24、反應，產生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。&基因文庫(G-文庫)：是含有某種生物全部基因隨機片段的重組DNA克隆群。基因文庫含有基因組內全部基因片段，包括外顯子和無表達功能的內含子序列。&cDNA文庫(C-文庫) ：是以mRNA互補合成的cDNA的隨機片段的重組DNA克隆群。cDNA文庫不含內含子序列，易于表達。具有組織細胞特異性：不同組織細胞、不同發(fā)育階段，基因表達的情況都不相同，應選擇特異表達的細胞及狀態(tài)；C-文庫比G-文庫小得多，更容易篩選。&轉座子（transposon，Tn）:基因組中存在的能自主復制和位移的一些DNA序列。&

25、;轉座子的共同特點：兩端有反向重復序列（inverted terminal repeats，ITR，IR）；轉座后靶位點重復序列是正向重復（direct repeats，DR）；編碼與轉座有關的蛋白，例如轉座酶；可以在基因組中移動；轉座子是基因組的正常組成成分，不以獨立的形式存在（如噬菌體或質粒DNA）。轉座的發(fā)生不依賴于轉座子和靶位點之間任何的序列同源性，在基因組內由一個部位直接轉移到另一個部位。 轉座以很低的頻率發(fā)生，而且轉座子的插入是隨機的，按照作用過程分類 轉座子 直接以DNA形式介導，遺傳信息的移動是從DNA到DNA。逆轉座子（返座子） 由RNA介導，即遺傳信息的移動是從DNA到RN

26、A再到DNA。&按照結構分類 ：簡單型轉座子 復合型轉座子 轉座子A家族 轉座噬菌體&簡單型轉座子 不含任何宿主基因，常被稱為插入序列（insertional sequence）即IS序列，是可獨立存在的單元，帶有介導自身移動的蛋白。&復合型轉座子 帶有某些宿主基因（如抗藥性基因），其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列。 &TnA家族包括幾個相關的轉座子，其中Tn3和Tn1000最具代表性結構特點：比較大 5kb，兩端不含IS，通常末端有38bp左右的IR，具有獨立的轉座酶和解離酶基因，含抗藥性基因&轉座機制的共同特征：1、基因組靶位點的交錯斷裂；2

27、、轉座子連接到單鏈末端，填補缺口；3、靶位點不具有特異性，但也有插入熱點區(qū)域存在。 轉座子產生的復制或非復制類型：復制型轉座；非復制型轉座；保守型轉座$毒逆轉錄病基因組的結構與功能編碼區(qū)：典型的反轉錄病毒含34個“基因”gag: internal structural protein 病毒核心蛋白基因pol: RNAdependent DNA polymerase 逆轉錄酶基因env: envelop glycoproteins 外膜糖蛋白基因非編碼區(qū)R區(qū)：為基因組兩端的重復序列，每個重復單位1080nt，cDNA()的反轉錄所必需的。PB±: 負鏈cDNA合成的起始位點，稱為引物結

28、合區(qū)可與各種tRNA的3端堿基互補U區(qū)U5 80-100nt(單一序列)；U3 含1701260（或1350）nt，含有強的啟動子，從這里開始合成前病毒DNA$質粒的遺傳特性雙鏈閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），1200kb；質粒復制有賴于宿主細胞的復制，但其自身基因可控制合成的時限及拷貝數(shù)；垂直傳遞；不影響宿主細胞的代謝，但可能賦予宿主細胞新的表型；質粒的復制方式 半保留復制；單向/雙向；單向；雙向；$質粒的遺傳學類型F質粒 性質粒。R質粒 耐藥性質粒。 Col質粒 含有合成大腸桿菌素基因的質粒； 質粒噬菌體 由質粒DNA和噬菌體DNA重組形成的嵌合體。 $根據(jù)復制特點，質粒分類 嚴緊型質粒（

29、stringennt plasmid）其DNA復制與宿主染色體DNA的復制相偶聯(lián)，依賴于蛋白質的合成，復制要求DNA聚合酶的存在； 松弛型質粒（relax plasmid）其DNA復制與宿主染色體DNA的復制不同步，且與蛋白質的合成功能無關；用DNA聚合酶復制，能在沒有蛋白質合成的情況下繼續(xù)復制； 低拷貝質粒與高拷貝質粒 $質粒的不相容性粒的質不相容性指兩種親緣關系相近的質粒不能穩(wěn)定地存在于同一個細胞中。不相容性是由于兩種質粒中具有類似的阻遏物及質粒DNA隨機復制而導致的結果。接合型質粒質粒DNA中帶有編碼細菌配對和質粒轉移的基因，可從一個細胞傳遞給另一個細胞；一般其分子量較大，多為嚴密型質粒

30、。非接合型質粒不能在細胞間水平傳播，但可以借助共同存在于宿主細胞中的接合型質粒，而發(fā)生遷移作用；一般其分子量較小，多為松弛型質粒?；蚬こ讨?，通常采用的是松弛型、非接合型質粒。$廣義的遺傳重組凡是能產生新的基因組合，造成基因型變化的過程，都稱為遺傳重組。包括獨立分配或交換；如減數(shù)分裂中的非同源染色體的自由組合。$狹義的遺傳重組專指涉及DNA分子內的斷裂并重新連接而造成基因重新組合的過程，即基因交換。￥遺傳重組的類型:同源重組;位點特異性重組;轉座作用;異常重組同源重組是依賴大范圍的DNA同源序列的聯(lián)會。重組過程中，兩個染色單體或DNA分子相互交換對等的部分，因此表現(xiàn)出交互的特點。同源重組中負責

31、DNA配對和重組的蛋白質系統(tǒng)無堿基序列的特異性的要求，只要兩條DNA序列表現(xiàn)出同源性(相同或接近)，重組就可以在此序列中的任何一點發(fā)生。重組熱點:一些序列發(fā)生重組的頻率高于其他序列￥同源重組的分子機制 （Holliday模型 ）四個關鍵步驟兩個同源染色體DNA排列整齊；一個DNA的一條鏈斷裂并與另一個DNA對應的鏈連接，形成的連接分子稱為Holliday中間體； 通過分支移動產生異源雙鏈DNA； Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA。 $位點專一性重組att位點為: POP(240bp) ; BOB(23bp)整合過程需要:整合酶 （Int）;寄主的整合宿主因子IHF $

32、噬菌體的整合作用裂解期和溶源化的DNA可以通過位點特異性重組相互轉變（整合和切離）；噬菌體和宿主均有相應的附著點att，噬菌體DNA位點稱為attP，宿主DNA位點稱為attB。其中O序列在二者之間同源，是二者配對及發(fā)生互換的區(qū)域。O序列全長15bp，富含A-T堿基對，無回文序列。 組成核心序列左翼序列右翼序列 AttP POP O P P attB BOB O B B$抗體多樣性產生的原因通過從不同的基因片段中隨機選擇幾個基因片段組合成不同的抗體。 V（D）J重排是不精確的，可在連接位置兩端的任何一端刪除一些堿基或加上原來片段中沒有的堿基。體細胞突變，當一個產生抗體的細胞克隆增殖時，正好遇到

33、外來抗原，將產生抗體基因的突變。$重組信號和12/23規(guī)則每個基因旁都有一個保守的回文結構七聚體5-CACAGTG-3；其旁是保守的九聚體5-ACAAAAACC-3。重排信號序列（recombination signal sequences，RSSs）：指七聚體和九聚體之間的12個堿基或23個堿基序列。12/23規(guī)則保證輕鏈和重鏈的正確連接。12/23規(guī)則即重排信號序列的排列規(guī)則是12bp的信號序列總是與23bp個堿基的信號序列連接。$復制的忠實性DNA復制過程是一個高度精確的過程，據(jù)估計，大腸桿菌DNA復制5´109堿基對僅出現(xiàn)一個誤差，保證復制忠實性的原因主要有以下三點:DNA聚

34、合酶的高度專一性（嚴格遵循堿基配對原則，錯配率為7 ´10-6 ）DNA聚合酶的校對功能（錯配堿基被3-5外切酶切除）起始時以RNA作為引物$DNA復制的酶系:解鏈有關的酶 ;DNA聚合酶類（DNA polymerase） ;引發(fā)酶;DNA連接酶$解鏈有關的酶解鏈酶:解開DNA雙鏈中氫鍵，消耗ATP:解旋酶（helicase）;Rep蛋白 單鏈結合蛋白（ssb）:起穩(wěn)定單鏈DNA的作用拓撲異構酶:復制前拓撲異構酶切斷DNA雙鏈，松開正超螺旋，復制后重新使DNA雙鏈連接，形成負超螺旋￥拓撲異構酶拓撲異構酶在復制叉處消除解鏈過程中產生的超螺旋。拓撲異構酶切開一條鏈，釋放超螺旋后，再連接封

35、閉。拓撲異構酶同時切開兩條鏈，再連接封閉。￥原核細胞中的DNA聚合酶 pol 主要在DNA修復中起作用。 多功能酶，活性包括：53DNA聚合酶活性；35核酸外切酶活性；（校正 作用）53核酸外切酶活性；（缺口平移或切除岡崎片段5引物）Klenow片段：53DNA聚合酶活性；35核酸外切酶活性；pol 又稱為DNA聚合酶全酶； 真正的DNA復制酶。 活性53DNA聚合酶活性；35核酸外切酶活性pol 具有35核酸外切酶活性，所以在DNA修復中有作用。￥真核細胞中的DNA聚合酶DN聚合酶 位置 細胞核 細胞核 線粒體 細胞核 細胞核功能后隨鏈的合成和修復 復制 前導鏈的合成修復 前導鏈的引發(fā)分子量

36、 300K 40K 180-300K170-230K250K3-5外+ + + + -切酶活性引發(fā)酶活性+ - - - -￥原核生物的DNA復制 起始 復制原點 引發(fā)體（起始復合物）形成：DnaA、DnaB、DnaC、組蛋白樣蛋白（HU）、旋轉酶、SSB。復制的延伸 先導鏈的合成：35親本鏈為模板；pol 全酶延伸。 后滯鏈的合成：隨先導鏈的延伸置換出模板，其上RNA引物信號序列出現(xiàn)即合成RNA引物，pol 延伸岡崎片段，pol切除引物和填補空缺，DNA連接酶連接片段。 ￥復制終止由兩個復制叉相遇而終止。終止序列：終止位點Ter ，22bpDNA，結合特異的蛋白。專一性終止蛋白，Tus蛋白：結

37、合到Ter位點，復制叉暫停。子代二價體的解套 ￥子代二價體的解套修復前進行，子代鏈上有缺口，由拓撲異構酶在親本鏈上打開缺口，而解套；修復后進行，則由拓撲異構酶在親本鏈和子代鏈上打開缺口，而解套； ￥真核生物的DNA復制:多起點、雙向復制;復制單元較小;復制叉相遇而終止;終止端粒的復制SV40復制起始點4個5-GAGGC-3序列（大T抗原結合位點）；一個15bp的回文結構（復制時最早解鏈區(qū)域）；一個只有A-T組成的17bp區(qū)域（促進解鏈）；$原核生物和真核生物DNA合成的相同點1. 半保留復制2. 半不連續(xù)性3. DNA 解鏈酶、SSB4. RNA 引物5. 校正閱讀（Proofreading）

38、$原核生物和真核生物DNA合成的區(qū)別區(qū)別原核生物真核生物DNA合成的時期整個細胞生長過程細胞周期的S期復制起點數(shù)單個多個復制子、復制叉移動速度小、少、900 nt/S大、多、50 nt/SRNA引物長度1016核苷酸10個核苷酸岡崎片段長度10002000核苷酸100150核苷酸前導鏈與后隨鏈的合成聚合酶同時控制聚合酶控制前導鏈聚合酶控制后隨鏈$原核生物和真核生物DNA合成的區(qū)別復制起始的許可因子的控制 （復制周期重疊與否）端粒和端粒酶真核中，同步合成組蛋白，形成核小體真核中，全部染色體復制完成以前，各ori不能開始下一輪復制。&線粒體DNA復制過程聚合酶負責mtDNA的復制。D環(huán)復制

39、方式，又稱置換式復制。1、H鏈為模板，從OH開始；2、新的L鏈取代原來的L鏈與H鏈互補結合；原來的L鏈呈D環(huán)；3、至1/3時暴露OL，起動以L鏈為模板的復制；4、復制完成，以環(huán)狀雙螺旋形式釋放，形成兩條環(huán)形DNA分子。&單鏈環(huán)狀DNA的復制(x174 phage )第一階段RF-DNA的形成 “”鏈“/”鏈（RF-DNA）第二階段滾環(huán)復制RF將作為復制的模板。（模式過程） “”鏈產生缺口RF；以“”鏈為模板，DNA聚合酶催化延伸反應；“”鏈被置換；gpA識別鏈復制原點，打開缺口，并結合于鏈5端；剪開被完全置換的鏈，并促使其封閉成環(huán)；&線狀 DNA復制5末端短縮的解決模式1、從開

40、始就采取環(huán)化的形式 噬菌體2、利用自身線性DNA末端的重復序列， 通過末端互補形 成連環(huán)分子（二聚體） T7噬菌體采取連環(huán)分子的形式3、引入蛋白質直接從末端起始復制腺病毒4、末端發(fā)夾結構連接， 復制完成后錯切連接痘病病毒。5、端粒和端粒酶真核生物染色體DNA。&PCR反應的原理1、高溫變性：94左右，目的基因解鏈為單鏈，以作為擴增的模板；2、低溫復性：5560，一對特異性引物分別與模板3端互補結合；3、適溫延伸：72，延伸反應；每一循環(huán)使DNA分子擴增一倍，n次循環(huán)后，理論上DNA分子可擴增為2的N次方。&引物 primers*引物的序列及其與模板結合的特異性是決定PCR反應結

41、果的關鍵。*引物設計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。&逆轉錄PCR（RT-PCR）*RT-PCR是以mRNA為模板，經逆轉錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速擴增（達ngug水平），大大提高mRNA的檢出靈敏度。*該技術主要應用：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統(tǒng)。 &Taqman技術*利用Taq酶的53外切酶活性，在PCR反應系統(tǒng)中加入一個熒光標記探針。該探針可與DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5端標以熒光發(fā)射基因，靠近3端標以熒光淬滅基團。*當探針保持完整時，淬滅基團抑制發(fā)射基

42、團的熒光發(fā)射。發(fā)射基團一旦與淬滅基團發(fā)生分離，抑制作用被解除，可被熒光探測系統(tǒng)檢測到。 *復性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA模板移動，當移動到探針5端將探針切斷，淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來。*模板每復制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數(shù)目和PCR產物數(shù)量是一對一的關系，因此用該技術可對模板進行準確定量。 &基因突變*突變：DNA堿基序列發(fā)生的可遺傳的永久性的改變。*突變可發(fā)生在DNA的不同結構水平：1、染色體畸變2、基因突變*突變原因不同：1、自發(fā)突變2、誘發(fā)突變； *突變的類型堿基序列改變1、點突變：單點突變：

43、只有一個堿基對發(fā)生改變；多點突變：有2個或2個以上堿基對發(fā)生改變；堿基的替代：轉換和顛換；2、堿基插入：通常指較長的堿基序列的增加。3、堿基缺失：通常指較長的堿基序列的缺少 *根據(jù)遺傳信息的改變結果分類1、同義突變（沉默突變） 指沒有改變產物氨基酸序列的密碼子變化。同義密碼子保守改變2、錯義突變 指堿基序列的改變導致蛋白質多肽鏈氨基酸序列變化。3、無義突變 指堿基序列的改變使代表某種氨基酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，結果肽鏈合成提前終止。*突變體對環(huán)境的敏感性不同1、非條件突變：突變基因在任何情況下，都是必需基因，突變引起的基因失活都會導致突變體的出現(xiàn)甚至細胞的死亡。2、條件突變：在一定條件下，突

44、變體能正常生長或近乎正常，但在某種特定條件下，突變成為致死突變。如：溫度敏感型突變*突變方向不同1、正向突變：野生型突變體2、回復突變：突變體野生型回復突變多為第二點突變，即原來的突變位點依然存在，而它的表型效應被基因組第二位點的突變所抑制，故又稱為抑制突變。*影響基因調控的序列1、啟動子突變啟動子上升突變啟動子下降突變；2、組成型突變：結構基因失去負向控制，使細胞產生不依賴于需要的，有固定數(shù)量的蛋白質，即組成型表達。操縱子突變調節(jié)基因突變*適應性突變 #適應性突變是細胞產生的適應于環(huán)境的回復突變。 #適應性突變與一般自發(fā)突變的區(qū)別是： 無需細胞生長，必須有非致死的選擇條件。 #突變的方向與選

45、擇條件對應。&DNA的修復系統(tǒng)1、復制修復 *尿嘧啶糖基酶系統(tǒng) 功能切除進入DNA的尿嘧啶核苷酸。 （1）、 尿嘧啶N-糖基酶切除U； （2）由AP內切酶切除與U相鄰的一段核苷酸，形成缺口； （3）由聚合酶填補缺口； （4）連接酶封閉缺口。 *錯配修復“保存母鏈，修正子鏈” （1）dam甲基化酶可使母鏈在開始DNA合成前的幾秒至幾分鐘內被甲基化，從而得到 保護。 （2）識別母鏈上的GATC序列，并使A甲基化；子鏈的甲基化相對滯后，其時間差為錯配修復提供可能。 *無嘌呤（AP）修復 （1）去嘌呤作用：DNA鏈中的糖苷鍵易發(fā)生水解作用，產生無嘌呤堿或無嘧啶堿位點，尤其是去嘌呤作用更易發(fā)生。

46、 （2）無嘌呤內切酶（AP內切酶）能切除DNA中無堿基核糖，留下一段單鏈DNA，然后由DNA聚合酶填補、DNA連接酶封閉缺口。2、損傷修復 *光復活 光復活酶（PR酶）：修復嘧啶二聚體。 *切除修復 (1)核酸內切酶UreABC識別并切除損傷DNA片段； (2)DNA聚合酶合成一段新鏈置換損傷片段； (3)連接酶封閉。 3、復制后修復 *重組修復 (1)DNA聚合酶越過損傷部位，結果新合成的子鏈有一段空缺。 (2)正常母鏈上與損傷子鏈缺口同源的DNA片段（供體）轉移到缺口上（重組），造成供體的母鏈上帶有缺口，子鏈完整。 (3)供體母鏈的缺口可以子鏈為模板，由DNA聚合酶進行合成修復，形成正常的

47、雙鏈。 *SOS修復 (1)SOS系統(tǒng)使復制叉跳過損傷區(qū)域繼續(xù)合成DNA鏈。 (2)差錯傾向修復 SOS修復中，損傷的模板不能正確復制，而且DNA多聚酶的校正系統(tǒng)放松了對錯誤核苷酸的識別，所以產生的DNA分子往往是無功能的。4、 限制與修飾 &轉錄的基本情況*轉錄：以DNA為模板，按照堿基互補配對原則，合成RNA的過程。*轉錄單位：被轉錄成單個RNA分子的一段DNA稱為一個轉錄單位。 RNA鏈的生物合成起始于DNA模板的一個特定位點，并在另一位點處終止。 轉錄單位可以是一個基因，也可以是多個基因（如操縱子）。 轉錄單位包括啟動子和終止子。*忠實性：轉錄具有高度的忠實性，轉錄具有固定的起

48、點和終點。但因RNA聚合酶缺乏自我校正機制，使得轉錄的忠實性*不對稱轉錄： 1、DNA分子上只有一條鏈可作為模板 2、模板鏈并不總是在同一單鏈上*RNA合成方向：53&原核生物RNA聚合酶*全酶：核心酶因子 *因子：起始階段 （1）識別啟動子，負責模板鏈的選擇和轉錄的起始； （2）不同的因子識別不同的啟動子，從而表達不同的基因，*核心酶：(2)延伸反應 （1）與DNA非特異結合，53移動，解鏈和聚合反應； （2）選擇正確的rNTP底物并催化磷酸二酯鍵的生成； （3）能識別轉錄終止信號，停止轉錄。&真核細胞RNA聚合酶 類型 細胞內定位 催化轉錄產物 對鵝膏蕈堿的反應 核仁 rR

49、NA前體 耐受 核質 mRNA前體 極敏感 核質 5SrRNA tRNA 中度敏感&與轉錄起始和終止有關的DNA結構 *啟動子(promoter) RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列。 *終止子（terminator） DNA上與轉錄終止有關的序列。 *增強子（enhancer） 遠上游序列，100以上，也可以出現(xiàn)在下游。能使與其鄰近的基因轉錄頻率明顯增加的DNA序列。性質：（1）增強效應明顯；（2）增強效應與其位置和取向無關（3）多為重復序列，核心序列TGGAAA/TTT；(4)組織和細胞特異性；(5)沒有基因專一性；(6)增強子單元的協(xié)同作用和倍增效應； &原

50、核生物啟動子 *轉錄起點，多為嘌呤； *Pribnow框（結合位點） TATAAT（TATPuAT），10序列。 *Sextama框（ 識別和初始結合位點）（1）TTGACA，35序列。（2）決定啟動子的強度。 *天然啟動子中二者之間距離多為1520bp，17bp時轉錄效率最高。 &原核生物終止子 *終止信號存在于RNA聚合酶已經轉錄過的序列之中。 *分類：1、不依賴蛋白因子的終止作用；2、依賴于蛋白因子（即因子）的終止作用； *結構共同特點：在終止點之前有一段回文序列，兩個反向重復部分（722bp）之間有一段不重復區(qū)段隔開，導致轉錄后生成的RNA分子產生莖環(huán)結構。&RNA聚合

51、酶的啟動子 組成: *核心啟動子元件 轉錄起始位點：帽子位點，通常為A，兩側為若干嘧啶核苷酸； T ATA框 常在-25bp左右，相當于原核的-10序列； *上游啟動子元件 CAAT盒：-70-80bp， 一致序列為GGC/TCAATCT GC盒：GGGCGG：-80 -110bp&原核生物轉錄過程 *起始階段 封閉二元啟動子復合物：全酶DNA雙鏈 開放二元啟動子復合物：全酶解鏈DNA 三元復合物：全酶DNA二核苷酸 （RNA）*延伸階段因子解離，核心酶催化，在模板指導下沿53延伸RNA鏈； 轉錄泡：DNA解鏈部分保持17bp左右，DNARNA雜交鏈維持12bp；&真核生物mR

52、NA的加工 mRNA的前體：核內不均一RNA（hnRNA） *5端加帽：m7G；5端帽子結構：m7G，以5，5 磷酸酯鍵與pppA或pppG相連的二核苷酸， 即m7GpppX。 mRNA帽子的功能：1、提供核糖體對mRNA的識別信號；2、增加mRNA的穩(wěn)定性（沒有自由的5端）；3、促進某些RNA的合成。 *3端加尾：polyA；3端尾巴結構：poly(A)，多聚(A)尾巴大約40250個左右的聚腺苷酸。 #3端非編碼區(qū)中一種叫做加尾信號序列的控制。 #多聚腺苷酸聚合酶催化轉移； #功能：1、是mRNA由細胞核轉移至細胞質所必需的形式；2、提高了mRNA的穩(wěn)定性。 *剪接 ：剪除內含子，拼接外顯

53、子； *鏈內部核苷酸甲基化修飾。&真核生物rRNA轉錄后加工 *初始轉錄本為45S前體， *18S，5.8S和28S 是一個轉錄本， *5sRNA前體獨立于其他三種rRNA的基因轉錄。 *哺乳動物的rRNA前體的加工有多種途徑。&tRNA的前體加工 *tRNA基因的轉錄單元大多是多順反子： 包括同一個tRNA基因、不同tRNA基因、 rRNA基因 。 *有兩種類型的前體 tRNA 基因：型：（多數(shù)）具3端CCA序列作3修復的信號和最后的界線；酶的作用下切除CCA下游一段序列 ；型：（少數(shù)）沒有3端CCA序列需要添加CCA序列.&RNA的剪接和RNA催化活性 * 剪接：去

54、除初級轉錄產物上的內含子，把外顯子連接為成熟的mRNA的過程。 * 生物體內的各種內含子內含子類型 細胞內定位GU-AG/AU-AC 細胞核，前mRNA（真核）型內含子 細胞核rRNA前體（真核） 、細胞器RNA、少數(shù)細菌RNA型內含子 細胞器RNA、部分細菌RNAtRNA前體內含子 細胞核、tRNA前體（真核）&剪接方式 * 核mRNA內含子：由剪接裝置完成 1、可供識別的特異序列，2、剪接裝置由多種蛋白質和核蛋白組成；3、轉酯反應 * 型和型內含子：自我剪接 1、形成特定的二級結構，2、RNA具有催化剪接的能力；3、轉酯反應 * 酵母tRNA：需要蛋白質酶參與的剪接&RNA

55、的編輯 *定義：轉錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入、丟失或轉換等現(xiàn)象。 *是發(fā)生于mRNA水平的遺傳信息的改變，但DNA模板并未發(fā)生改變，其產物的結構不 能從基因組DNA序列中推導出來。 *序列經過轉錄后加工，有多用途分化的，因此也稱作分化加工。 *RNA的編輯作用的結果是由一個基因可產生不止一種蛋白質。&翻譯（蛋白質的生物合成）1、以氨基酸為原料*以mRNA為模板2、以tRNA為運載工具3、以核糖體為合成場所4、起始、延長、終止各階段蛋白因子參與5、合成后加工成為有活性蛋白質&遺傳密碼 *遺傳密碼（genetic code） mRNA分子上53方向，每三個核苷酸與一種氨基酸對應，全部64種組合所形成的體系。 特性：1、遺傳密碼的方向性與無間隔性2、遺傳密碼的簡并性和擺動性3、遺傳密碼的通用性4、遺傳密碼的偏愛性 *密碼子（codon） 每一個三聯(lián)核苷酸的順序稱為密碼子，也叫三聯(lián)體密碼。 *終止密碼（stop coden） U