生物分離工程課件

1、第一章 生物分離工程概述1.1生物分離在生物技術(shù)中所占位置1 生化分離工程的定義：為提取生物產(chǎn)品時(shí)所需的原理、方法、技術(shù)及相關(guān)硬件設(shè)備的總稱，指從發(fā)酵液、動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)液、酶反應(yīng)液和動(dòng)植物組織細(xì)胞與體液等中提取、分離純化、富集生物產(chǎn)品的過程。 2、單元操作：完成一道工序所需的一種方法和手段。 3、生物技術(shù)：即有機(jī)體的操作和應(yīng)用有機(jī)體生產(chǎn)有用物質(zhì)、改善人類生存環(huán)境的技術(shù)。4、生物技術(shù)的目標(biāo)：就是指利用培養(yǎng)微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞來生產(chǎn)對(duì)人有用的產(chǎn)品。生物技術(shù)的主要目標(biāo)是生物物質(zhì)的高效生產(chǎn)，分離純化是生物產(chǎn)品工程的重要環(huán)節(jié)，因此生物分離是生物技術(shù)的重要組成部分。 5、狹義生物技術(shù)的產(chǎn)物僅為化學(xué)產(chǎn)

2、品，約有100年的歷史。6、獲得產(chǎn)品的有效途徑：原材料、預(yù)處理、生物反應(yīng)、生物分離、產(chǎn)物7、傳統(tǒng)發(fā)酵與現(xiàn)代發(fā)酵比較1.2 生物物質(zhì)和生物分離 種類繁多，包括自然界存在的各種生物資源?，F(xiàn)代生物技術(shù)主要通過生物反應(yīng)過程生產(chǎn)各種物質(zhì)。 現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品的主體是蛋白質(zhì)藥物。1.3生物分離的特點(diǎn)：A生物工程的主要特點(diǎn)是生物制品多種多樣。產(chǎn)品的多樣性導(dǎo)致分離方法的多樣性。B絕大多數(shù)生物分離方法來源于化學(xué)品的分離方法。C生物分離一般比化工分離難度大。a成分復(fù)雜,固體成分包括完整有機(jī)體、培養(yǎng)基及底物中的不溶物，液體成分包括底物可溶物、代謝中產(chǎn)物及目標(biāo)產(chǎn)物。b懸液中的目標(biāo)產(chǎn)物濃度低.1.4生化產(chǎn)品的類型：按用途

3、分類：食品類。保健品類。醫(yī)用類產(chǎn)品。農(nóng)業(yè)用產(chǎn)品。生物試劑類。按分子量大小分類：Mass 1000D：酶、抗原、抗體、多肽、蛋白質(zhì)類按發(fā)酵時(shí)目的產(chǎn)物所在的位置分類：cell內(nèi)：胰島素、白細(xì)胞介素、干擾素、重組蛋白質(zhì) cell外：抗生素（青霉素、紅霉素）、胞外酶（-淀粉酶）等 2.生物分離與一般化學(xué)分離方法的比較2.1、分離過程的分類： 機(jī)械分離（離心、過濾） 傳質(zhì)分離（平衡分離、速率分離） 平衡分離萃取、吸附、沉淀、結(jié)晶、層析等 速率分離膜分離、電滲析、透析2.2生物產(chǎn)品特點(diǎn)： 產(chǎn)物濃度低的水溶液 (原因： a 氧傳遞限制； b 細(xì)胞量; c 產(chǎn)物抑制 組分復(fù)雜(a 大分子; b 小分子; c

4、可溶物; d 不可溶物; e 化學(xué)添加物 產(chǎn)物穩(wěn)定性差( a 化學(xué)降解(pH , 溫度); b 微生物降解 （酶作用， 染菌） 分批操作，生物變異性大 質(zhì)量要求高 （藥品或食品）2.3生物產(chǎn)品要求高質(zhì)量：純度、衛(wèi)生、生物活性分離過程的成本占產(chǎn)品總投資的大部分，因此必須仔細(xì)考慮和設(shè)計(jì)產(chǎn)品的回收和純化過程。設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮下列問題？1. 產(chǎn)品價(jià)值2.產(chǎn)品質(zhì)量3.產(chǎn)物在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的位置4.雜質(zhì)在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的位置5. 主要雜質(zhì)獨(dú)特的物化性質(zhì)是什么？6.不同分離方法的技術(shù)經(jīng)濟(jì)比較上述問題的考慮將有助于優(yōu)質(zhì)、高效產(chǎn)物分離過程的優(yōu)化。2.4方法選擇的基本原則：1)、盡可能簡(jiǎn)單、低耗、高效、快速。2)、分

5、離步驟盡可能少。Why? A) n 為總回收率，n 為各單元回收率。意義？分離步驟越多，回收率越低；如10 = 0.9510 = 0.63，5 = 0.955 =0.77B)、分離步驟多，設(shè)備投入大，人員物資消耗大，生產(chǎn)周期長(zhǎng) How ?3)、避免相同原理的分離技術(shù)多次重復(fù)出現(xiàn)比如，分子篩和超濾技術(shù)按分子量大小分離，重復(fù)應(yīng)用兩次以上，意義就不大了。4)、盡量減少新化合物進(jìn)入待分離的溶液。 A)、引起新的化學(xué)污染；B)、蛋白質(zhì)的變性失活5)、合理的分離步驟次序。 原則是：先低選擇性，后高選擇性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。2.5設(shè)計(jì)前應(yīng)了解的信息：1、在設(shè)計(jì)前，首先要

6、掌握的產(chǎn)物物化性質(zhì)，主要包括：(1)、溶解度及影響因素，包括溫度、pH值、有機(jī)溶劑和鹽等；(2)、分子量和分子形狀。對(duì)于高分子物質(zhì)非常有意義；(3)、沸點(diǎn)和蒸汽壓。對(duì)于熱穩(wěn)定的小分子物質(zhì)非常有意義；(4)、極性大?。?5)、分子電荷及影響因素，包括pH值和鹽等；(6)、功能團(tuán)。功能團(tuán)為萃取劑和特異性吸附的選擇提供依據(jù)；(7)、免疫原性。設(shè)計(jì)親和色譜；(8)、穩(wěn)定性及其影響因素，包括溫度、pH值、毒性試劑等(如青霉素低pH不穩(wěn)定)；(9)、分子的淌度及影響因素，包括pH值、離子強(qiáng)度和鹽等；(10)、等電點(diǎn)pI2、成品規(guī)格（或產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)） 表1.3 五肽胃泌素的上海市藥品標(biāo)準(zhǔn)（1993年版32頁

7、） 指標(biāo)名稱 指標(biāo) 含量（C37H49N7O9S） 97.0-103.0 比旋光度 -25 -29 吸收值比 A(280nm):A(288nm) = 1.12-1.22 氨基酸 各氨基酸之比為1 干燥失重，% 0.53、進(jìn)料的組成和物性 (1) 目的產(chǎn)物的濃度。 高？ 低？ (2) 物料中的與目的產(chǎn)物相近物質(zhì)組成的物理化學(xué)性質(zhì)。 (3) 目的產(chǎn)物的定位。是胞內(nèi)還是胞外？ (4) 菌種的種類和形態(tài)。 (5) 微生物的含量和發(fā)酵液的黏度。4、生產(chǎn)規(guī)模 5、危害性(1)、離心產(chǎn)生的氣溶膠、發(fā)酵產(chǎn)生的廢氣、干燥產(chǎn)生的粉塵等。(2)、目的產(chǎn)物本身的危害性；抗腫瘤代謝類藥物，類固醇類抗生素，激素類藥物等。

8、(3)、試劑危害。萃取試劑CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。(4)、微生物的危害。重組DNA工程菌不能任意排放。這一菌種為新的物種，不能排除對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人的危害。6、分批分離還是連續(xù)純化2.6對(duì)環(huán)境的考慮1）、廢水 A、除菌過濾和滅菌處理； B、符合BOD的要求；2）、廢料 A、滅菌處理； B、綜合利用：動(dòng)物飼料、飼料添加劑，有機(jī)肥料3）、廢氣 A、除菌過濾和滅菌處理； B、廢氣（有機(jī)溶劑）回收4）、溶劑的回收 A、減少環(huán)境排放，減少污染；B、循環(huán)利用，減低成本 2.7生物分離一般包括四步：A不容物的去除：過濾，離心，細(xì)胞破碎 B產(chǎn)物分離：離子交換，萃取（以上分離過程不具備特異性，只是進(jìn)行

9、初分，可提高產(chǎn)物濃度和質(zhì)量。C產(chǎn)品的純化：色譜，電泳，沉淀 D產(chǎn)品的精制：結(jié)晶，干燥1.4 生物分離技術(shù)和原理物質(zhì)分離的本質(zhì)是識(shí)別混合物中不同溶質(zhì)間物理、化學(xué)和生物性質(zhì)的差別，利用能識(shí)別這些差別的分離介質(zhì)和擴(kuò)大這些差別的分離設(shè)備實(shí)行溶質(zhì)間的分離或目標(biāo)組分的純化。性質(zhì)不同的溶質(zhì)在分離操作中具有不同的傳質(zhì)速率和（或）平衡狀態(tài)，從而實(shí)行分離。1) 物理性質(zhì) 力學(xué)性質(zhì)：重力、離心力、膜分離； 熱力學(xué)性質(zhì)：狀態(tài)變化、相平衡； 傳質(zhì)性質(zhì)：粘度、擴(kuò)散、熱擴(kuò)散； 電磁性質(zhì)：電泳、電滲析、磁化； 2）化學(xué)性質(zhì) 化學(xué)熱力學(xué)：化學(xué)平衡； 化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：反應(yīng)速率； 光化學(xué)特性：激光激發(fā)的離子化進(jìn)行同位素分離3）生物

10、學(xué)性質(zhì) 生物分子識(shí)別：生物親和作用； 生物輸送性質(zhì)：生物膜輸送； 生物反應(yīng)、控制：酶反應(yīng)、免疫系統(tǒng)。 平衡分離：定義：根據(jù)溶質(zhì)在兩相間分配平衡的差異實(shí)現(xiàn)分離。溶質(zhì)達(dá)到分配平衡的推動(dòng)力僅取決于系統(tǒng)的熱力學(xué)性質(zhì)。溶質(zhì)達(dá)到相間平衡的過程為擴(kuò)散傳質(zhì)過程，平衡分離又稱擴(kuò)散分離。蒸餾、蒸發(fā)、吸收、萃取、結(jié)晶（沉淀）、泡沫分離、吸附和離子交換等是典型的平衡分離過程。差速分離：定義：利用外力驅(qū)動(dòng)溶質(zhì)遷移產(chǎn)生的速度差進(jìn)行分離的方法。傳統(tǒng)的機(jī)械分離方法：過濾、重力沉降、離心沉降。典型的差速分離法：超濾、反滲析、電滲析、電泳和磁泳。1.5 分離效率的評(píng)價(jià)1）、濃縮率（富積率， 原料 分離器 產(chǎn)品 意義：1）、如mT

11、 1，則目標(biāo)產(chǎn)物得到富積； 2）、如mT = mX，則目標(biāo)產(chǎn)物未得到分離純化。 2) 分離因子(separative factor)，或分離系數(shù)(separative coefficient) 意義：A、目標(biāo)產(chǎn)物濃度，雜質(zhì)濃度，則分離因子大，分離效率；B、a = 1時(shí)，則未分離。故在分離為主要目的時(shí),a 3) 回收率(recovery)：4) 純化因子 對(duì)于具有生物活性的蛋白質(zhì)或酶，常常用分離前后目標(biāo)產(chǎn)物的比活 2. A in U/mg之比表示目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化程度， 非蛋白類雜質(zhì)的去除：（1） DNA A 陰離子交換（pH 4.0) B 親和層析（不被吸附） C 疏水層析（2） 熱原 （蛋白

12、質(zhì)溶液中的去熱原） A 生產(chǎn)過程無菌 B 所有層析介質(zhì)無菌 C 所用溶液無菌D 親和層析（多粘菌素）（3）去病毒 A 加熱 （60 C) B 過濾 C 滅活劑目標(biāo)蛋白的表征和分析方法：（1） HPLC（2） SDS-PAGE（3） 氨基酸順序分析（4） 氨基酸，肽圖，免疫化學(xué)（5） 與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照分析下游加工過程的沿革： 傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)（第一代） 19世紀(jì)60年代-20世紀(jì)50年代 酒精，丙酮，丁醇 第二代生物技術(shù)產(chǎn)品 20世紀(jì)40年代 抗生素，有機(jī)酸，核酸，酶制劑，單細(xì)胞蛋白 第三代 20世紀(jì)70年代中期 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng) 基因工程發(fā)酵產(chǎn)品生化分離技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)：存在的問題：研發(fā)費(fèi)用高、成

13、本高、周期長(zhǎng) 生物工程發(fā)展的瓶頸如何解決？1)、加強(qiáng)基礎(chǔ)理論研究 A、研究非理想溶液中溶質(zhì)與添加物料之間的選擇性機(jī)制、影響因素 1. B、研究界面的結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和傳質(zhì)機(jī)制，以及影響因素 2. C、下游加工過程的數(shù)學(xué)模型的建立和計(jì)算機(jī)模擬。難 2)、完善老技術(shù)：正確對(duì)待“新”、“老”分離技術(shù)3)、發(fā)明新技術(shù) 研發(fā)新型高效經(jīng)濟(jì)的分離技術(shù) 推進(jìn)各分離技術(shù)的雜交 分離技術(shù)與發(fā)酵技術(shù)結(jié)合 強(qiáng)化化學(xué)對(duì)分離技術(shù)的影響 1.4)、高效分離技術(shù)的工程化5)、分離技術(shù)的環(huán)?；锓蛛x工程的發(fā)展動(dòng)向： （1） 操作集成化（擴(kuò)張床，兩水相） （2） 方法集成化（親和與膜結(jié)合） （3） 大分子與小分子相互滲透（兩水相

14、大分子向小分子分配） （4） 親和技術(shù)推廣與配基合成（分子印跡） （5） 優(yōu)質(zhì)層析介質(zhì)開發(fā)（大孔親水介質(zhì)，貫注層析介質(zhì)） （6） 下游技術(shù)與上游技術(shù)相結(jié)合(藕合分離） （7） 改進(jìn)上游因素（改進(jìn)菌種，培養(yǎng)基與發(fā)酵條件） （8） 改善環(huán)境相容性 Chapter 1 思考題1. 生物分離工程在生物技術(shù)中的地位？2.生物分離工程的特點(diǎn)是什么？3.生物分離工程可分為幾大部分，分別包括哪些單元操作？4.在設(shè)計(jì)下游分離過程前，必須考慮哪些問題方能確保我們所設(shè)計(jì)的工藝過程最為經(jīng)濟(jì)、可靠？第二章 細(xì)胞分離與破碎6一、固液分離的類型： 1、過濾(重力過濾器、壓濾器、真空過濾器) 2、離心 3、重力沉降二、懸浮液

15、：指固體顆粒在0.1mm以上的固液分散體系。生物細(xì)胞培養(yǎng)液基本上也是懸浮液。三、培養(yǎng)液的組成：水70-80% + 固體細(xì)胞及碎片20-30%(對(duì)微生物發(fā)酵)+ 少量的代謝成物 + 細(xì)胞破裂后的內(nèi)容物 +殘存的培養(yǎng)基成分四、培養(yǎng)液的基本特征A、細(xì)胞成分及碎片大小不一，顆粒大小，分離成本。B、固液密度相近，黏度高：沉降和離心分離困難C、固體成分可壓縮可變形 + 高黏度：過濾困難，黏附在濾布，錯(cuò)流過濾形成凝膠層D、動(dòng)植物細(xì)胞抗剪切力差：錯(cuò)流膜過濾和離心等不適E、流變性復(fù)雜，非牛頓型流體，青霉素發(fā)酵液為卡森型流體，120h鏈霉素發(fā)酵液為擬塑性流體，灰色鏈絲菌發(fā)酵液為塑性流體。 備注： 在高分子液體范疇

16、內(nèi)，可以粗略地把非牛頓型流體分為： 純粘性流體，但流動(dòng)中粘度會(huì)發(fā)生變化，如某些涂料、油漆、食品等。 粘彈性流體，大多數(shù)高分子熔體、高分子溶液是典型的粘彈性流體，而且是非線性粘彈性流體。一些生物材料，如細(xì)胞液，蛋清等也同屬此類。 流動(dòng)性質(zhì)有時(shí)間依賴性的流體。如觸變性流體，震凝性流體。 對(duì)微小而形狀多變的微生物細(xì)胞，發(fā)酵液和其它生物溶液的固液分離就變得復(fù)雜了 。 一般，由于料液通常都是高的非牛頓粘度流體或者是高度可壓縮濾餅，發(fā)酵液和其它生物溶液是極其難以過濾的，因此，必須對(duì)這些生物分離程序進(jìn)行修改。五、預(yù)處理的目的:（1） 改變發(fā)酵液的物理性質(zhì) (黏度、顆粒大小、顆粒穩(wěn)定性等)，固液分離速度，分離

17、器分離效率；）（2） 目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移其中一相(多數(shù)為液相)；（3） 六、目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移其中一相(多數(shù)為液相)；六、預(yù)處理的方法：1加熱：.最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理方法是加熱。加熱不僅可以增加料液的操作特性，也可以對(duì)其進(jìn)行滅菌。但加熱變性的方法只適合于對(duì)熱穩(wěn)定性的產(chǎn)物。加熱可產(chǎn)生： 黏度、促凝聚、固體成分體積、破壞凝膠結(jié)構(gòu)、增加空隙率、去蛋白2、調(diào)pH值：方法簡(jiǎn)單有效、成本低廉 pH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH可改善其過濾特性。 對(duì)于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)作為雜質(zhì)存在于液體中時(shí)，常采用調(diào)pH至等電點(diǎn)使兩性物質(zhì)沉淀。另外，在膜分離中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，常通

18、過調(diào)整pH，改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，以減少吸附造成的堵塞和污染。此外，細(xì)胞、細(xì)胞碎片及某些膠體物質(zhì)等在某個(gè)pH下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于固液分離。3、凝聚和絮凝1).通過電解質(zhì)的加入促進(jìn)原始溶液的凝聚和絮凝2).主要作用為增大混合液中懸浮粒子的體積，提高固液分離速度，同時(shí)可除去一些雜質(zhì)。3).凝聚：指在投加的化學(xué)物質(zhì)（鋁、鐵的鹽類或石灰等）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成mm 大小塊狀凝聚體的過程。膠體粒子(10-100nm)中性鹽促進(jìn)下脫穩(wěn)相互聚集成大粒子（1mm）機(jī)理：a 中和粒子表面電荷 b 消除雙電層結(jié)構(gòu)凝聚劑種類：A、無機(jī)鹽類：如硫酸鋁、明礬、硫酸鐵、硫酸亞鐵、FeC

19、l3、AlCl3、ZnCl2、硫酸鎂等；B、無機(jī)堿：如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等；C、聚合無機(jī)鹽，如聚合鋁、聚合鐵。 機(jī)理：A、破壞雙電層，B、水解后膠體吸附，C、氫鍵結(jié)合等。4).絮凝：指使用絮凝劑（天然的和合成的大分子量聚電解質(zhì)）將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。大分子聚電解質(zhì)將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成絮凝團(tuán)的過程。 機(jī)理：架橋作用絮凝劑種類：A、陽離子類，如聚丙烯酰胺(+)、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺；B、陰離子類，如聚丙烯酸納、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺(-)；C、非離子類，如聚丙烯酰胺(0)、環(huán)氧化乙烯。

20、機(jī)理：絮凝劑主要起中和電荷、橋架和網(wǎng)絡(luò)作用 凝聚和絮凝技術(shù)能有效的改變細(xì)胞菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài),使其聚集起來,增大體積以便固液分離,常用于菌體細(xì)小而且黏度大的發(fā)酵液的預(yù)處理中.4、惰性助濾劑 5加入反應(yīng)劑發(fā)酵液的帶電現(xiàn)象發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子的表面，一般都帶有電荷，帶電的原因很多，主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。通常發(fā)酵液中細(xì)胞或菌體帶有負(fù)電荷，由于靜電引力的作用使溶液中帶相反電荷的粒于（即正離子）被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。4、惰性助濾劑： 一種顆粒均勻、質(zhì)地堅(jiān)硬的粒狀物質(zhì)，用于擴(kuò)大過濾表面的適應(yīng)范圍，減輕細(xì)小顆粒的快速擠壓變形和過濾介質(zhì)的堵塞。

21、 使用方法：A、預(yù)涂層；B、按一定比率混合。 助濾劑種類：硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的炭、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣，及它們的混合物等。 用量標(biāo)準(zhǔn)：A、單位質(zhì)量助濾劑所產(chǎn)生的最大濾液產(chǎn)量(最常用)；B、或最長(zhǎng)周期；C、或最快流速；D、或?yàn)V餅的最大空間利用度。5加入反應(yīng)劑有時(shí)加入某些不影響目的產(chǎn)物的反應(yīng)劑，可消除發(fā)酵液中某些雜質(zhì)對(duì)過濾的影響，從而提高過濾速率。 加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4 、磷酸鋁 等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，并且能使膠狀物和懸浮物凝固，從而改善過濾性能。七、發(fā)酵液的相對(duì)純化1.無機(jī)離子的去除

22、Ca2+ 、Mg2+ 、Fe2+等Ca2+離子濃度較高時(shí)，可采用可溶性鹽，如草酸鈉等Mg2+離子的去除一般采用加入三聚磷酸鈉磷酸鹽處理，也能大大降低Ca2+ 、Mg2+離子的濃度鐵離子，可加入黃血鹽，使其形成普魯士藍(lán)沉淀而除去2雜蛋白的去除利用各種沉淀方法，可以去除液相中各種蛋白質(zhì)。常用的有等電點(diǎn)沉淀法、變性沉淀法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、反應(yīng)沉淀法等。這些沉淀方法既可以作為除雜質(zhì)的方法，也可以作為提取目標(biāo)產(chǎn)物的技術(shù)手段。3多糖的去除 酶解法可將混合液中的不溶性多糖物質(zhì)酶解，使其轉(zhuǎn)化為溶解度較大的單糖，從而改變流體的流動(dòng)特性，提高過濾速率。4有色物質(zhì)的去除 發(fā)酵液中有色物質(zhì)可能是由于微生物生長(zhǎng)

23、代謝過程分泌的，也可能是培養(yǎng)基（如糖蜜、玉米漿等）帶來的，色素物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)的多樣性增加了脫色的難度。 色素物質(zhì)的去除，一般以使用離子交換樹脂、離子交換纖維、活性炭等材料的吸附法來脫色最為普遍。2.1 細(xì)胞分離大部分工業(yè)生物分離的第一步往往是將不溶物質(zhì)從發(fā)酵液中除去。這些不溶性固體的濃度和顆粒大小的變化范圍很寬。濃度可高達(dá)每單位體積含60%的不溶性固體，又可低至每單位體積僅含0.1%。粒徑的變化可以從直徑約為1um的微生物，到直徑為1mm的不溶性物質(zhì)。對(duì)于這些濃度較小，粒徑較大，硬度較強(qiáng)的不溶物，我們可以采用過濾方法分離。當(dāng)發(fā)酵液不易被過濾純化時(shí)，我們可以采用離心的方法來分離。與過濾設(shè)備相比，離

24、心設(shè)備的價(jià)格昂貴。但當(dāng)固體顆粒細(xì)小而難以過濾時(shí)，離心操作往顯得十分有效。離心分離是基于固體顆粒和周圍液體 密度 存在差異，在離心場(chǎng)中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程，當(dāng)靜置懸浮液時(shí)，密度較大的固體顆粒在重力作用下逐漸下沉，這一過程稱為沉降。由于沉降和離心相似，這兒就放在一塊討論。離心產(chǎn)生的固體濃縮物和過濾產(chǎn)生的濃縮不同。通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。但是，對(duì)大多數(shù)生物發(fā)酵液可以離心但不能有效地過濾分離，所以離心往往是很有效的方法。1、顆粒的沉降當(dāng)一固體微粒通過無限連續(xù)介質(zhì)時(shí)，它的運(yùn)動(dòng)速度受兩種力的影響：一是微粒受到因微粒和流體介質(zhì)間密

25、度不同而產(chǎn)生的浮力作用；二是微粒所受到的流體阻力作用。根據(jù)沉降作用力可分為：重力沉降、離心沉降根據(jù)沉降粒子間相互影響程度可分為：自由沉降和干擾沉降4.1 重力沉降（Gravitational sedimentation） （1）球形顆粒的自由沉降速度 以重力的方向?yàn)檎较?什么情況下顆粒在流體中會(huì)發(fā)生沉降過程？ 直徑為d、顆粒密度為s的球形顆粒在密度為流體中的重力和浮力分別為： 顆粒做勻速運(yùn)動(dòng)，沉降速度恒定不變，該速度稱為自由沉降速度。達(dá)到恒定的沉降速度時(shí)，合力為（球形顆粒的自由沉降速度）（2）阻力（曳力）系數(shù)（Drag coefficient） 與流體的流動(dòng)阻力系數(shù)類似，阻力（曳力）系數(shù)與顆

26、粒沉降雷諾數(shù)有關(guān)，即注意：其中d為顆粒直徑，u0為顆粒的沉降速度，、分別為流體的密度與粘度。 通過實(shí)驗(yàn)得到曳力系數(shù)與雷諾數(shù)的關(guān)系繪成算圖,將他們回歸成關(guān)聯(lián)式為： 層流區(qū)（Stokes區(qū)，Re0 2或0.3） 過渡區(qū)（Allen區(qū)， 2 Re0 500） 湍流區(qū)（牛頓區(qū)， 500 Re0 200000后，驟然下降，在Re0 =(310)105范圍內(nèi)可近似取= 0.1。 以上的沉降過程為在重力作用下球形顆粒的自由沉降： 顆粒為球形； 顆粒沉降時(shí)彼此相距較遠(yuǎn)，互不干擾； 容器壁對(duì)沉降的阻滯作用可以忽略； 顆粒直徑不能小到受流體分子運(yùn)動(dòng)的影響。在實(shí)際情況中還需考慮以下因素的影響： 干擾沉降； 端效應(yīng)；

27、 分子運(yùn)動(dòng)； 非球形； 液滴或氣泡的運(yùn)動(dòng) 。離心力： Stocks Force(粘滯力)：離心沉降速度：分離因子定義Fr：離心力/重力加速度(g)的比值意義：衡量離心設(shè)備的離心程度的重要技術(shù)參數(shù)，用于離心機(jī)的分類 注意：離心沉降與重力沉降的類比。顆粒離心沉降的速度方向是由圓心沿徑向指向外周，但由于顆粒和流體同時(shí)做圓周運(yùn)動(dòng)，顆粒的實(shí)際運(yùn)動(dòng)軌跡是一個(gè)半徑逐漸擴(kuò)大的螺旋線。離心沉降速度并不是顆粒的實(shí)際運(yùn)動(dòng)速度，只是其在徑向上的分量。 對(duì)于沉降，重力沉降加速度為重力加速度）g= d2(s-)g/(18) (2.6)離心沉降加速度則不同a=r2 s= d2(s-)r2/(18) (2.16)-轉(zhuǎn)鼓回轉(zhuǎn)角

28、速度，r/s） r為轉(zhuǎn)鼓中心軸線與微粒間距離，m 代入得 （2.15）s= d2(s-)r2/(18) (2.16)還可以用 表達(dá)其中S稱為沉降系數(shù)，是溶劑物性的常數(shù)沉降系數(shù)S計(jì)算：顆粒在20C 水中的Sw,20為v 為溶質(zhì)(顆粒)的單位質(zhì)量的體積, h w,20和h L,T分別為20 C 的水和T C 溶劑的黏度，rw,20和rL,T 分別為20 C 的水和T C 溶劑的密度。 Sw,20與溶質(zhì)（顆粒）濃度有關(guān)： 為c0時(shí)的沉降系數(shù)(20 C 的水), k為常數(shù)可以得到溶質(zhì)完全沉降所需的時(shí)間：1） 差速離心分級(jí)2）區(qū)帶離心 （密度梯度離心）：差速區(qū)帶離心、平衡區(qū)帶離心 按分離因子Fr分類 1

29、)、常速離心機(jī)Fr 8000-15000g 4)、超速離心機(jī)，F(xiàn)r = 20,000 1,000,000g用途分類 1)、分析性：超速離心機(jī) 2)、制備性：A、實(shí)驗(yàn)室用；B、工業(yè)用工業(yè)應(yīng)用分類 1)、管式離心機(jī) 2)、多室離心機(jī)（管式離心機(jī)的變形） 3)、碟式離心機(jī)：、人工排渣式, 、噴嘴排渣式, 、活塞排渣式 4)、螺旋卸料沉降離心機(jī) 5)、離心過濾 6)、三足式離心機(jī)離心過濾 計(jì)算流量方程：注：流量為非常數(shù)，時(shí)間增加，濾餅厚度增加，而流量減小。濾餅形成時(shí)間方程： 意義：得到濾餅厚度(R0-RC)所需時(shí)間，用于工藝放大 Q超速離心機(jī)：分離因子在100,000g以上的離心設(shè)備 應(yīng)用：A. 測(cè)定

30、分子量:B. 大分子的純度鑒定C. 大分子的構(gòu)相變化D. DNA半保留復(fù)制概念： 過濾是在外力作用下，利用過濾介質(zhì)使懸浮液中的液體通過，而固體顆粒被截留在介質(zhì)上，從而實(shí)現(xiàn)固液分離的一種單元操作。過濾介質(zhì)具有多孔結(jié)構(gòu)，可以截留固體物質(zhì)，而讓液體通過；我們把待過濾的懸浮液成為濾漿（Slurry），而過濾后分離出的固體稱為濾渣或?yàn)V餅（Filter cake），通過過濾介質(zhì)的液體稱為濾液（Filtrate）。 （1）過濾介質(zhì)（Filter medium）： 過濾介質(zhì)應(yīng)具有以下特性：多孔性，足夠的機(jī)械強(qiáng)度，盡可能小的流動(dòng)阻力，耐腐蝕性，耐熱性，易于再生。 工業(yè)上常見的過濾介質(zhì)：織物介質(zhì)、堆積介質(zhì)、多孔固

31、體介質(zhì)、多孔膜。 （2）過濾分類： 深層過濾、濾餅過濾 （3）過濾推動(dòng)力：重力（漏斗過濾）、壓力（加壓過濾）或真空（抽濾）、離心力（離心過濾）。 （4）濾餅的可壓縮性 （5）助濾劑：助濾劑本身就是一性能良好的過濾介質(zhì)，是一種堅(jiān)硬、不規(guī)則的小顆粒，它能形成結(jié)構(gòu)疏松、空隙率大、不可壓縮的濾餅，很大程度改善過濾難度。助濾劑使用方法主要有兩種：混合、預(yù)涂。過濾過程數(shù)學(xué)描述 達(dá)西方程： 1、適用于不可壓縮和簡(jiǎn)單的可壓縮濾餅 2、普遍使用于生物分離過程過濾基礎(chǔ)理論;Darcy定理U = 流體的速度(in: m/s)，Dp = 壓力差(in: Pa)，l = 床層厚度(in: m)，K = Darcys 滲

32、透系數(shù)，與流體和床層的性質(zhì)有關(guān)。Kozenys 方程 對(duì)于發(fā)酵液的過濾,要用Kozenys方程 K = Kozenys 常數(shù)，一般K = 5（在大量均勻的球形顆粒中），其他顆粒K = 3.5-5.5，顆粒，K；S = 單位體積顆粒中顆粒的表面積；h = 發(fā)酵液黏度(in: Pa s)；e = 床層的空隙率，即空隙體積與總體積的比值。方程適應(yīng)條件：A、薄層區(qū)域表面的流速，B、非常高的孔隙率，C、非常廣的顆粒尺寸的分布，D、纖維狀的、可壓縮的和吸濕性的填充物。意義：過濾的基礎(chǔ)方程，揭示了過濾流速與各因素的關(guān)系過濾速度：濾餅阻力與濾餅干重之間的關(guān)系: 為濾餅的平均比阻，不可壓縮性濾餅的為常數(shù)，可壓縮

33、性濾餅的為壓差的函數(shù)，經(jīng)驗(yàn)表達(dá)式為：比阻(平均質(zhì)量比阻 m/kg)定義式 S = 單位體積顆粒中顆粒的表面積rs：干濾餅的密度(in kg/m-3)。意義：A、反映過濾的難易程度，越大，越困難；B、與顆粒大小、孔隙率等的關(guān)系。n濾餅可壓縮度，當(dāng)濾餅不可壓縮時(shí)，n = 0；對(duì)于高度可壓縮濾餅，則n 1。b = 濕濾餅的質(zhì)量：干濾餅的質(zhì)量。意義：A、對(duì)于可壓縮料液，高壓不一定增加流量B、比阻與壓力的關(guān)系隨著過濾操作的進(jìn)行，濾餅量不斷增加，與濾液體積Q之間關(guān)系如下：=濕濾餅/干濾餅；cs=干濾餅/液料 cs=濕濾餅/液料；1- cs= 濾液/液料；Q濾液體積Q/（ 1- cs）= 液料體積LQ/ （

34、 1- cs）= 液料質(zhì)量所以Ruths 方程 在過濾操作中，被截留的固相顆粒在介質(zhì)形成濾餅。過濾的阻力來自過濾介質(zhì)和濾餅。過濾流量可表達(dá)為 Q：濾液體積(in m3)，A：過濾面積(in m2)，b 濕濾餅:干濾餅，cs：料液中干固相成分的濃度(in: kg/kg)，r：濾液密度，Q0：相當(dāng)于過濾介質(zhì)阻力時(shí)的虛擬濾液體積(in m3)，一定過濾介質(zhì)的Q0為常數(shù)。 意義：過濾的流量方程恒壓過濾方程(最常用模式)恒壓條件下對(duì)Ruths方程積分：t0：為透過虛擬體積所要的虛擬時(shí)間。在一般條件下Q0可忽略，上式為：意義：中試后放大的理論依據(jù)恒速過濾恒速條件下對(duì)Ruths方程積分：過濾設(shè)備過濾設(shè)備從傳

35、統(tǒng)的板框式過濾機(jī)到旋轉(zhuǎn)式真空過濾設(shè)備，種類很多。常用新型過濾器：轉(zhuǎn)鼓真空過濾器應(yīng)用：大規(guī)模生物分離的主要過濾設(shè)備，用于較難分離的低黏度發(fā)酵液優(yōu)點(diǎn)：、大規(guī)模，、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單，、濾布裝卸容易、易保養(yǎng)維護(hù)。缺點(diǎn)：、占地大，單位體積利用率低，、周期性中斷進(jìn)料、濾布利用率低，、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵。圓盤真空過濾器應(yīng)用：同上。優(yōu)點(diǎn)：、超大規(guī)模(400 m2)，極易實(shí)行大型化分離，、占地小，單位體積利用率高，、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵液，B、設(shè)備投資高。 帶式真空過濾器應(yīng)用：大規(guī)模分離的主要過濾設(shè)備，可分離較難分離的低黏度的發(fā)酵液，對(duì)濾餅洗滌要求高。 優(yōu)點(diǎn)：)、發(fā)酵液處

36、理量大，濾餅厚達(dá)200mm， )、濾餅洗滌容易，效果好，無須攪拌， )、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單，清洗保養(yǎng)容易。 缺點(diǎn)：)、占地大，有效過濾面積低， )、壓力低，僅應(yīng)用于低黏度發(fā)酵液， )、設(shè)備投資高。 壓力系列：帶式、板框、加壓、氣壓罐式壓濾機(jī)應(yīng)用：用于很難處理的、高黏度、高細(xì)顆粒含量的發(fā)酵液的固液分離。優(yōu)點(diǎn)：、操作壓高.Mpa以上，的 顆粒含量，高含量的細(xì)顆粒， 、濾餅含水量低，濾液澄清， 、自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)單，清洗保養(yǎng)容易。缺點(diǎn)：、占地大，有效過濾面積低，、設(shè)備投資高，能耗高。如何選擇過濾器？1、濾液的澄清度2、顆粒大小的分布3、發(fā)酵液的黏度4、固體顆粒的濃度5、濾餅的干燥度6、濾餅的洗滌7、生產(chǎn)

37、能力中試實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的路線 ：1、確定生產(chǎn)能力（例：150T/d） 2、確定中試實(shí)驗(yàn)的規(guī)模（一般按生產(chǎn)能力縮小100倍，即150/100 = 1.5T/d） 3、 測(cè)定重要參數(shù)，如 a，Q0等 4、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件確定不同的實(shí)驗(yàn)條件：預(yù)處理、助濾劑、壓力等濾餅的厚度與時(shí)間關(guān)系濾餅的孔隙率與壓力關(guān)系不同壓力下濾液的體積與時(shí)間的關(guān)系濾餅的洗滌、脫水、排脫等濾液的澄清度，以及上述方程要求的數(shù)據(jù)利用方程等 5、計(jì)算：A、過濾面積A，確定型號(hào)(以恒壓為例) 6、放大100倍 生產(chǎn)能力(= 100A)結(jié)論： 離心和過濾是去除不溶物的主要方法，生物分離工業(yè)首先要去除不溶物，大的、硬的不溶物可用過濾方法去除， 對(duì)于大

38、部分發(fā)酵液，助濾劑或者其它預(yù)處理方法有利于過濾，但也有沒有效果的。另外一些小的、難過濾的固體顆?？捎秒x心分離。2.2細(xì)胞破碎 胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細(xì)胞代謝物細(xì)胞本身： 單細(xì)胞蛋白（SCP）胞內(nèi)產(chǎn)品:堿性磷酸酯酶，基因工程產(chǎn)物，植物細(xì)胞產(chǎn)物等2 .2.1 細(xì)胞的結(jié)構(gòu) 細(xì)胞壁的組成和破碎阻力細(xì)菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)，主要阻力來自于壁結(jié)構(gòu)交換的緊密程度和厚度。真菌：多糖，蛋白質(zhì)，脂類，葡聚糖，幾丁質(zhì)，主要阻力來自于壁強(qiáng)度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理 物理法化學(xué)法固體剪切法(珠磨法)酶溶法液體剪切法化學(xué)降解法（

39、酸堿法）撞擊法表面活性劑法超聲法有機(jī)溶劑膨脹法滲透法萃取法細(xì)胞破碎理論 1)、細(xì)胞破碎A 壓撞 B 剪切 Ca 滲透 Cb 凍脹 D 破壁破膜2)、產(chǎn)物釋放：主要有高壓勻漿、珠磨、撞擊破碎和超聲波破碎等方法1)、固體剪切法(珠磨法, c最有效的物理破碎法)影響因素：a) 轉(zhuǎn)盤外緣速度b) 珠粒添量和大小c) 溫度：溫度在5-40C范圍內(nèi)對(duì)破碎影響較小。但研磨產(chǎn)熱，功率 ，溫度 。如產(chǎn)物熱不穩(wěn)定，必須控溫。d) 細(xì)胞濃度x：最佳x由實(shí)驗(yàn)確定。一般產(chǎn)熱量隨細(xì)胞濃度的降低而下降，但單位細(xì)胞重量的能耗 。通常懸液中細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)量濃度在60-120g/L、酵母細(xì)胞質(zhì)量濃度在140-10g/L時(shí)破碎效果較理

40、想e) 破碎效率：f) 流量Q：破碎為一級(jí)反應(yīng)。Q, E，R；Q，E，R。2)、液體剪切法(最常用的方法之一)影響因素：操作壓力p：p, R ;相反, R 。溫度 2C /10MPa 。破碎次數(shù)N：N，R 。溫度：比速度k與溫度有關(guān)，溫度25C，k1.5倍。細(xì)胞抗破碎系數(shù)a：a酵母=2.9，a大腸桿菌 = 2.1。細(xì)胞種類：影響k值。細(xì)胞濃度：優(yōu)點(diǎn)：A、在大規(guī)模cell破碎中，高壓勻漿機(jī)和珠磨機(jī)用得最多;B、高壓勻漿機(jī)最適合于酵母和細(xì)菌;C、珠磨機(jī)可用于酵母和細(xì)菌，但對(duì)真菌菌絲和藻類更合適.3) 撞擊破碎法優(yōu)點(diǎn)：A、細(xì)胞破碎僅發(fā)生在撞擊的一瞬間，破碎程度均勻，避免反復(fù)和過度破碎；B、破碎的程度

41、可無級(jí)調(diào)節(jié)，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，特別適合于細(xì)胞器的回收；C、實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模均可應(yīng)用。 4) 超聲破碎法(1525kHz)l 超聲波破碎法利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。l 超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發(fā)生器和換能器組成，發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。機(jī)理：在超聲作用下產(chǎn)生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力。優(yōu)點(diǎn)：適合于多種細(xì)胞的破碎缺點(diǎn)：A、影響因素多，如振幅、黏度、表面張力、液體體

42、積和流速、探頭材料和形狀；B、超聲產(chǎn)生超氧離子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、產(chǎn)熱大，需控溫；E、不易放大，僅應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎?；瘜W(xué)破碎法酶溶法、酸堿法、有機(jī)溶劑胞溶法、表面活性劑法酶溶法：利用酶分解細(xì)胞壁上特出的化學(xué)鍵，使細(xì)胞壁破碎。優(yōu)點(diǎn)：A、產(chǎn)品釋放的選擇性；B、提取速度和收效高；C、產(chǎn)品的破壞小；D、對(duì)外界環(huán)境，如pH和溫度等要求低；E、不殘留細(xì)胞碎片。酶解（酶溶法 Enymatic lysis)l 利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。溶菌酶（lysozyme)適用于革蘭氏陽性菌細(xì)胞的

43、分解，應(yīng)用于革蘭氏陰性菌時(shí)，需輔以EDTA使之更有效地作用于細(xì)胞壁。l 真核細(xì)胞的細(xì)胞壁不同于原核細(xì)胞，需采用不同的酶。l 自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自身產(chǎn)生的酶來溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過程繼續(xù)下去?？墒?，改變其生長(zhǎng)環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。 l 酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。堿和表面活性劑能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來。天然的表面活性劑有膽酸鹽和磷脂等 l 合成的表面活性劑可分離子型和非離子型，離子型如十二烷基

44、硫酸鈉（SDS，陰離子型）；十六烷基三甲基溴化銨（陽離子型）。非離子型如Triton X-100和吐溫（Tween）等 l 有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 滲透壓沖擊法l 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。 凍結(jié)-融化法l 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增

45、加細(xì)胞的親水性能，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。 1、機(jī)械法和化學(xué)法的比較 機(jī)械破碎法缺點(diǎn)：A、高能、高溫、高噪音、高剪切力(四高)，易使產(chǎn)品變性失活；B、非專一性，胞內(nèi)產(chǎn)物均釋放，分離純化困難；C、細(xì)胞碎片大小不一，難分離。化學(xué)破碎法缺點(diǎn)：A、費(fèi)用高；B、引起新的污染，尤其是其他化學(xué)方法；C、一般只有有限的破碎，常需與其他物理法連用。2、破碎方法的選擇選擇的一般原則：A、提取產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，用機(jī)械法破碎B、提取產(chǎn)物在細(xì)胞膜附近，用化學(xué)法C、提取產(chǎn)物與細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)合，可采用化學(xué)法和機(jī)械法結(jié)合的方法 破碎技術(shù)雜交研究應(yīng)注意的問題：A、

46、雜交技術(shù)可產(chǎn)生很大優(yōu)勢(shì)。B、破碎技術(shù)對(duì)下游分離技術(shù)的影響。破碎顆粒清除，產(chǎn)物的分離純化C、在發(fā)酵階段，考慮到發(fā)酵過程和環(huán)境對(duì)破碎難易程度的影響D、菌種的培育，胞內(nèi)產(chǎn)物 胞外產(chǎn)物3、細(xì)胞破碎的評(píng)價(jià) 直接計(jì)數(shù)法方法：樣本稀釋 - 染色 - 上樣 計(jì)數(shù)。計(jì)算：同上。優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：A、計(jì)數(shù)時(shí)間長(zhǎng)，B、只有活細(xì)胞才被計(jì)數(shù)，誤差大，C、細(xì)胞聚集時(shí)，不利計(jì)數(shù)，D、染色誤差。間接計(jì)數(shù)法方法：樣本離心 - 取上清液 - 測(cè)特定蛋白質(zhì)或酶 - 與理論的最大值比較。計(jì)算：Rm：理論最大值，R：實(shí)驗(yàn)測(cè)得值。優(yōu)點(diǎn)：A、方法客觀可靠，尤其對(duì)蛋白質(zhì)和酶，B、有多種選擇的指標(biāo)，胞內(nèi)位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，

47、靈活性大。缺點(diǎn)：影響因素多，如溫度、pH值、剪切力、溶液的稀釋等。解決辦法：篩選相對(duì)穩(wěn)定和恒定的指標(biāo)。1、利用珠磨法破碎酵母細(xì)胞時(shí)，酵母內(nèi)各種酶的釋放速率常數(shù)不同。一般靠近細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的酶釋放速度快，而細(xì)胞內(nèi)部或細(xì)胞器內(nèi)的酶隨破碎的進(jìn)行緩慢釋放出來。因此，選擇發(fā)現(xiàn)地釋放目標(biāo)產(chǎn)物是可能的，關(guān)鍵是要知道目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)和在細(xì)胞同存在的位置，選擇適當(dāng)?shù)钠扑榉椒ê筒僮鳁l件。2、選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞膜附近時(shí)，可采用較混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、滲透壓沖擊法和凍結(jié)融化法等。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，則需采用強(qiáng)烈的機(jī)械破碎法（2）選擇性

48、溶解目標(biāo)產(chǎn)物當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合的狀態(tài)時(shí)，調(diào)節(jié)溶液PH值，離子強(qiáng)度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。同時(shí)，溶液性質(zhì)應(yīng)使其他雜質(zhì)不易溶出。另外機(jī)械破碎法和化學(xué)法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標(biāo)產(chǎn)物釋放率條件下，降低細(xì)胞的破碎程度。第三章初級(jí)分離63.1 沉淀分級(jí) 沉淀是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)溶解度降低、由液相變成固相析出生成固體凝聚物的現(xiàn)象。常用加入試劑的方法，改變?nèi)軇┖腿苜|(zhì)的能量平衡來降低其溶解度，使產(chǎn)物離開溶液生成不溶性顆粒，沉降析出。沉淀具有濃縮與分離的雙重作用。與結(jié)晶聯(lián)系：在本質(zhì)上都是 新相 析出的過程，主要是物理變化，

49、當(dāng)然也存在化學(xué)反應(yīng)的沉淀或結(jié)晶。區(qū)別：結(jié)晶為同類分子或離子以有規(guī)則 排列形式析出，沉淀為同類分子或離子以無規(guī)排列形式析出。優(yōu)點(diǎn)：A、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、放大容易，產(chǎn)物濃度越高沉淀越有利，收率越高； B、原料液體積很快地減小1050倍，從而簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費(fèi)用；C、使中間產(chǎn)物保持在一個(gè)中性溫和的環(huán)境；D、及早地將目標(biāo)pro.從其pro.水解酶分離出來，避免pro降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；E、用沉淀法作為pro色譜分離前處理，可使使用色譜分離的限制因素降低到最少。缺點(diǎn)：A、沉淀物可聚集有多種物質(zhì)，如大量鹽類和溶劑，所以沉淀法所產(chǎn)品純度通常都比結(jié)晶法低；B、過濾較困難蛋白質(zhì)的表面特性蛋白質(zhì)溶解：相似

50、者相溶aa的親水性和疏水性：有利因素：親水性，包括氫鍵、極性基團(tuán)、離子化側(cè)鏈、親水a(chǎn)a所占的比例等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基團(tuán)、疏水a(chǎn)a所占的比例等。如纖維蛋白原。1、蛋白質(zhì)的溶解與什么有關(guān)呢？2、蛋白質(zhì)的溶解特性：蛋白質(zhì)的溶解行為是一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)象 以及分子周圍的環(huán)境 所決定。蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解。蛋白質(zhì)是兩性高分子電解質(zhì)（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的 20 種氨基酸組成。在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基

51、具有向內(nèi)部折疊的趨勢(shì)，使親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質(zhì)的疏水區(qū)大，疏水性強(qiáng)。因此，蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。3、蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定因素：蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydration shell)可以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）因此，可通過降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層厚度（電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。蛋白質(zhì)可以看作是一個(gè)表面分布有正、負(fù)電荷的球體，這種正、負(fù)電荷是由氨基和羧基的離子化形成的，換句話說，該球體是帶有均衡電荷分布的膠體顆粒。因此，蛋白質(zhì)的沉淀，實(shí)際上與膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似。蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。因溶液是電中性的，水中應(yīng)有等當(dāng)量的反離子存在。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。l 吸引力l 顆粒間的相互作用l 顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。l Van der Waals 力l Keeson 引力（偶極力）l Debye 引力 （誘導(dǎo)力）l London 引力 （色散力）是最重要的一種引力，因?yàn)樗蟹肿佣际强梢员粯O化的，所以它