食品微生物檢驗技術

1、第五章 食品衛(wèi)生細菌學檢驗技術自然界廣泛分布的微生物，在食品的生產(chǎn)、包裝、運輸、貯藏及銷售過程中經(jīng)常有機會污染食品，而食品本身含有豐富的營養(yǎng)物質，一旦條件適宜，污染的微生物便可在食品中生長繁殖，其后果不僅可使食品腐敗變質而造成浪費，還可使食用的人畜致病，甚至引起暴發(fā)性食物中毒。防止食品污染，搞好食品衛(wèi)生，是一個關系人民健康的大問題，也是一個關系到外貿(mào)和經(jīng)濟的重要問題。食品衛(wèi)生細菌學檢驗是以細菌學的指標來檢查食品是否合乎衛(wèi)生要求，結合食品理化檢驗和衛(wèi)生學調查，可以正確了解食品的衛(wèi)生情況，給予確切的衛(wèi)生評價，并為食品衛(wèi)生管理等方面采取有效措施提供科學根據(jù)。第一節(jié) 食品衛(wèi)生細菌學檢驗總則一、樣品采集

2、在食品檢驗中，所采集的樣品必須具有代表性，即所取樣品能夠代表食品的所有部分。食品的衛(wèi)生質量受到其加工批號、原料情況（原料的來源、種類、所在的地地區(qū)、季節(jié)等）、加工方法、保藏條件、運輸、銷售等環(huán)節(jié)的影響，要根據(jù)一小份樣品的檢驗結果來說明一大批食品的衛(wèi)生質量問題或一起食品中毒事件的性質，必須經(jīng)過周密考慮，設計出一種科學的取樣方法。采取什么樣的取樣方法主要取決于檢驗目的。目的不同，取樣方法也不同。檢驗目的可以是判斷一批食品的質量合格與否，還可以是查找食品中毒病原微生物，還可以是鑒定畜禽產(chǎn)品中是否存在人畜共患的病原體。目前國內(nèi)外使用的取樣方法多種多樣，如按食品的危害程度抽樣，按百分比抽樣再混合一起檢驗

3、等。（一）樣品的分類樣品可分為大樣、中樣、小樣三種。大樣指一整批，；中樣指從樣品各部分取的混合樣國，一般為200g；小樣既檢樣，一般以25g為準，用于檢驗分析用。（二）樣品的采集采樣必須在無菌條件下進行操作。采樣的工具：如鏟子、匙、采樣器、試管、廣口瓶、剪刀等，都必須是無菌的。不同種類的樣品采樣方法不同。1.液體食品的采樣將樣品充分混勻，用無菌操作開啟包裝，用100mL無菌注射器進行抽取，注入無菌盛樣容器中。2.半固體食品的采樣用無菌操作方式拆開樣品包裝，然后用無菌勺子從幾個部位挖取樣品，注入無菌盛樣容器中。3.固體樣品的采樣如為大塊整體食品應用無菌刀具和鑷子從不同部位割取，割取時應注意樣品的

4、代表性，兼顧深度與廣度，若檢驗目的是了解食品的污染情況，可只取表層樣品；如為小塊大包裝食品應從不同部位的小塊上切取樣品，注入無菌盛樣容器中。如果樣品是粉末狀，應邊取邊混合。4.冷凍食品的采樣大包裝小塊冷凍食品的采樣按小塊個體取樣；大塊冷凍食品可以用無菌刀從不同部位削取樣品或用無菌小手鋸從冷凍塊了鋸取樣品，也可以用無菌鉆頭鉆取碎樣品，注入無菌盛樣容器中。冷凍食品采樣后、樣品應保持冷凍狀態(tài)（放在冰內(nèi)、冰箱的冰盒中或低溫冰箱內(nèi)保存），非冷凍食品只需在0-5中保存即可。另外，如樣品是袋、瓶、罐裝的，應取完整未開封的。5.生產(chǎn)工序監(jiān)測采樣（1） 車間用水自來水樣從車間各水龍頭上采取冷卻水，湯料從車間容器

5、不同部位用100mL無菌注射器抽取。（2） 車間臺面、用具及加工人員等表面的衛(wèi)生監(jiān)測用板孔5cm2的無菌采樣板及5支無菌棉簽擦拭25 cm2 臺面面積。若所采表面干燥，則用無菌稀釋濕潤棉簽后擦拭；若表面有水，則用干棉簽擦拭即可，擦拭后立即將棉簽頭用無菌剪刀剪入無菌盛樣容器中。（3） 車間空氣采樣將5個直徑90mm的普通營養(yǎng)瓊脂平板分別置于車間的四角和中部，打開平皿蓋5min，然后蓋上平皿送檢。6.食品中毒微生物檢驗的取樣當懷疑發(fā)生食物中毒時，應及時收集可疑中毒源食品或餐具等，同時收集病人的嘔吐物、糞便或血液等。7.人畜共患病原體微生物檢驗的取樣當懷疑某一動物產(chǎn)品可能攜帶人畜共患病原體時，應結合

6、畜禽傳染病學的基礎知識，采取病原體最集中、最易檢出的組織或體液送檢。（三）樣品的標簽采樣后應立即貼上標簽，每件樣品必須標記清楚樣品名、來源、數(shù)量、采樣地點、采樣人、采樣時間（年、月、日）等相關內(nèi)容。.二、送檢采樣后樣品送達食品衛(wèi)生微生物檢驗室的時間越短越好，一般不宜超過3h。如因路途遙遠等原因無法在3h內(nèi)到達，應進行適當?shù)蜏靥幚恚抢鋬鰳悠繁３衷?-5的環(huán)境中，冷凍食品的樣品則需保存在泡沫塑料隔熱箱中（內(nèi)放冰塊可維持0以下）。送檢時，必須認真填寫申請單，以供檢驗人員參考。三、樣品處理食品樣品種類多樣、來源復雜，各類預檢樣品在進行檢驗之前，必須根據(jù)食品種類的不同性狀特征，經(jīng)過預處理后制備成稀釋液

7、才能進行相關各項檢驗。1.液體樣品處理液體樣品是指粘度不超過牛乳的非粘性食品的樣品。液體樣品的處理可將樣品充分混合后，直接用無菌吸管準確吸取25mL樣品加入225mL蒸餾水或生理鹽水及有關檢驗的增菌液中，制成110稀釋液。在開瓶、開罐等打開樣品容器時，一定要注意表面消毒，無菌操作。具體方法是用點燃的酒精棉球灼燒瓶口無菌，用石碳酸紗布蓋好，再用無菌開瓶器將蓋打開。如是含有二氧化碳的液體飲料則需先倒入無菌的小瓶中，覆蓋無菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部退出后再進行檢驗；如是酸性食品則需用100g/L無菌過的碳酸鈉調節(jié)pH至中性后再進行檢驗。2.固體或粘性液體食品處理固體食品或粘性液體食品無法使用吸管進

8、行吸取，其處理方法是用無菌容器準確稱取待檢樣品25g，加入至預溫45的無菌生理鹽水或蒸餾水中，使用振蕩器或手動搖蕩致其溶化，盡快檢驗。一般從樣品稀釋到接種培養(yǎng)最好不超過15min。（1）固體食品處理固體食品的處理相對比較復雜，主要處理方法有以下幾種：搗碎均質法：稱取 100g或以上的樣品剪碎混勻，從中準確稱取25g放入內(nèi)含225mL無菌稀釋液的無菌均質杯中，以800010000r/min均質12min。此法對大部分固體樣品適用。剪碎振搖法：稱取 100g或以上的樣品剪碎混勻，從中準確稱取25g進一步剪碎，裝入內(nèi)含225mL無菌稀釋液及適量直徑為5mm左右的玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振

9、搖50次，振幅不小于40cm。研磨法：稱取 100g或以上的樣品剪碎混勻，從中準確稱取25g放入無菌乳缽中充分研磨后再的稀釋瓶中，蓋緊后，充分搖勻。整粒振搖法：有完整自然保護膜的顆粒狀樣品（如蒜瓣、青豆等）可直接稱取25g整粒樣品放入內(nèi)含225mL無菌稀釋液及適量直徑為5mm左右的玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊后，用力快速振搖50次，振幅不小于40cm。（2）冷凍樣品處理冷凍樣品在檢驗前首先要進行解凍，解凍方法有兩種：一種是解凍溫度控制在0-4之間，時間不超過18h；另一種是溫度在45以下，時間不超過15min。樣品解凍后，無菌操作方式稱取25g，放入225mL無菌稀釋液中，制成均勻的110混懸液。（

10、3）粉末狀或顆粒狀樣品處理用無菌勺或其他適用工具將樣品攪拌均勻后，無菌操作方式稱取待檢樣品25g，放入225mL無菌的生理鹽水中，充分振搖混勻，制成110稀釋液。四、檢驗與報告（一）檢驗食品衛(wèi)生微生物檢驗室接到送檢申請單，應立即登記，填寫實驗序號，并按檢驗要求，立即將樣品放在冰箱或冰盒中，積極準備條件進行檢驗。按不同的檢驗項目及時進行檢驗。按國家標準檢驗方法規(guī)定，食品微生物檢驗主要檢驗項目包括菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌的檢驗，其中致病菌的檢驗包括腸道致病菌檢驗與致病性球菌檢驗等。（二）報告按檢驗項目完成各類檢驗后，檢驗人員應及時填寫檢驗報告單，簽字后送主管人員核實簽字，加蓋單位印章，以示生效，

11、后立即送交食品衛(wèi)生監(jiān)督人員處理。 檢驗報告發(fā)出后，陰性樣品可即時處理；陽性樣品要待報告發(fā)出3d后（特殊情況可適當延長）方可處理；進口食品的陽性樣品，需保存6個月方能處理。第二節(jié) 食品衛(wèi)生微生物檢驗中常見檢樣的制備一、肉與肉制品檢樣的制備健康畜禽的肉、血液及內(nèi)臟器官組織一般是無菌的。但畜禽的疲勞、饑餓等機體原因會降低個體的抵抗力，造成細菌由腸道侵入血液和組織；在畜禽屠宰加工過程中，會沾染到環(huán)境中的各種微生物，而且越一到后面的工序，微生物污染越嚴重；另外肉類的運輸與保藏也會繼續(xù)受到污染。在空氣污濁、環(huán)境溫度較高的條件下，微生物會迅速繁殖，有時肉表面上的微生物可達億萬個。肉制品雖然大多經(jīng)過濃鹽或高溫

12、等處理，肉上不耐濃鹽或高溫的微生物都會死亡。但形成的芽孢孢子卻不受高鹽或高溫的影響而存活下來，如肉毒桿菌的芽孢體可以在臘肉、火腿、香腸中存活。因此，為保證食品衛(wèi)生，防止疾病傳播，有必要對肉及肉制品進行嚴格的微生物檢驗。而微生物檢驗的第一步就是進行檢樣制備。（一）檢樣制備一般所需材料用品：1現(xiàn)場采樣用具：采集箱、無菌塑料袋、有蓋搪瓷盤；無菌刀、剪子、鑷子；無菌具塞廣口瓶；無菌棉簽；溫度計；編號牌（可現(xiàn)場用蠟筆、紙制作）。2.樣品處理一般材料用品：無菌刀、剪子、鑷子；無菌乳缽；無菌海砂或玻璃砂；酒精燈；無菌水、量筒等（二）生肉及臟器檢樣的制備一般在屠宰前先進行獸醫(yī)衛(wèi)生學檢查，這些檢查一般是以臨床及

13、病理解剖為主。動物患病毒性疾病、外傷但沒有化膿的，一般不需作細菌學檢查，但如有下列情況則應進行衛(wèi)生細菌學檢查：（1）動物在宰殺兩小時后才取出腸子者。（2）放血不充分者。（3）根據(jù)基本情況不能斷定能否食用者。（4）宰殺前動物有患病狀態(tài)的如有胃腸疾患、動物瘦弱或體溫降低者。（5）疑似患傳染病、化膿性疾病、腸道疾病及其他原因而急需屠宰的動物。（6）衛(wèi)生監(jiān)督機關或獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督機關認為有必要進行細菌學檢查時。1.樣品的采?。ㄈ樱┤缧柽M行細菌學檢驗，生肉及內(nèi)臟樣品的采取，應遵循以下幾點要求：（1）屠宰場屠宰后的畜肉，可于開腔后，立即用無菌刀采取兩腿內(nèi)側肌肉50 g，或者劈半后采取兩側背部最長肌肉各50

14、g送檢。（2）冷藏或銷售中的生肉，可用無菌刀采取腿肉或其他部位的肌肉100 g。（3）作病原菌的檢測時，應以無菌刀采取脾、全部腎臟，肝門部帶淋巴結部位的肝臟。（4）如取膽囊，則應注意勿使膽汁流出。（5）采取腸淋巴結時應將腸系膜一起取出。樣品采取后，應立即放入無菌玻璃容器或無菌后的其它容器內(nèi)，樣品中不得加入任何防腐劑，立即送檢。最長時間不超過3h。送檢時注意冷藏，檢樣送達化驗室應立即檢驗或放置冰箱暫存。2.檢樣的處理先將檢樣進行表面消毒（用沸水燙3-5s或表面灼燒消毒）。再用無菌剪子取檢樣深層肌肉25g，放入無菌乳缽內(nèi)用無菌剪子剪碎后，加無菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入無菌水225mL，混勻后即

15、配成110稀釋液。（二）禽類檢樣的制備1取樣新鮮或冷凍家禽采取整只，放入無菌容器中；帶毛野禽可放在清潔容器中。立即送檢。其他處理要求如同上述生肉。2.檢樣處理先將檢樣進行表面消毒，用無菌剪子或刀去皮后，剪取肌肉25g（一般可從胸部或腿部剪?。Ｆ渌幚硪笸?。帶毛野禽去毛后，同家禽檢樣相同處理。（三）各類熟肉制品1.取樣各類熟肉制品，如醬鹵肉、熏烤肉、熟灌腸、臘肉、肉松、肉脯、肉干等，一般采取200g，熟禽采取整只，均需放入無菌容器中，立即送檢。其他處理要求如上述生肉。2.檢樣處理直接切取或稱取25g，臘腸、香腸等生灌腸需先進行表面消毒，然后用無菌剪子剪取內(nèi)容物25g，其他處理如生肉。不同

16、檢驗目的檢樣的制備也有所不同，如是要通過檢驗肉及肉制品的細菌含量來判斷其質量鮮度，采用上述方法進行檢樣制備；如需檢驗肉及肉制品受外界環(huán)境污染程度或需檢驗其是否帶有某種致病菌，則應采用棉拭采樣法。（四）棉拭采樣法的檢樣制備一般可用板孔5cm2的金屬制作規(guī)板壓在樣品上某一點上，將無菌過的棉拭稍蘸濕，在板孔5cm2的范圍內(nèi)揩抹多次，再將規(guī)板板孔移壓另一點，用另一棉拭揩抹多次，以此類推，共移壓揩抹10次，總面積50cm2，共用10支棉拭。每支棉拭揩抹完畢后立即剪斷（或燒斷），再分別投入盛有50mL無菌水的三角瓶或大試管中，然后立即送檢。檢驗前必須先充分振搖，然后吸取三角瓶或大試管中的液體，作為原液，再

17、按要求做10倍遞增稀釋。如果檢驗目的是檢查是否帶有致病菌，則可不用規(guī)板，在可疑部位用棉拭揩抹即可二、乳與乳制品檢樣的制備乳是營養(yǎng)價值最豐富的食品之一，也是微生物良好的培養(yǎng)基，是最便于微生物繁殖的食品。乳房表面、擠乳者的手和工具、容器以及飼養(yǎng)的衛(wèi)生管理條件等，都能引起微生物污染。因此乳及乳制品的微生物檢驗也是必不可少的。（一）乳及乳制品乳檢樣的制備所需材料用品采樣箱、攪拌棒、勺子、無菌具塞廣口瓶、無菌塑料袋、溫度計、75%酒精棉球、酒精燈和乙醇、編號用品等。（二）樣品的采取1. 散裝或大型包裝乳品以無菌刀或無菌勺于不同部位取至少200g具代表性的樣品，置無菌容器內(nèi)，鮮乳一般需在4h內(nèi)送至實驗室。

18、取樣時應注意以下幾點：（1）每件樣品取樣前刀、勺必須清洗無菌；（2）應注意取樣部位、取樣量等的代表性；（3）氣溫較高或路途較遠的情況下應進行冷藏；（4）不得使用任何防腐劑。2. 小型包裝乳品采取原包裝品，直接送檢。各種小型包裝乳品的取量：生奶、消毒奶、酸奶、煉乳、奶粉1瓶或1包；奶油1塊（113g）；奶酪（干酪）一個。3.成批產(chǎn)品按每批產(chǎn)品的千分之一采樣，不足千件者抽一件。小包裝按最小包裝量采樣。（三）樣品的處理1鮮奶、酸奶以無菌操作方式去掉瓶口的紙罩紙蓋，瓶口經(jīng)火焰無菌后以無菌操作取樣25mL,放入盛有225mL無菌生理鹽水的三角瓶中，振搖均勻。酸奶若有水分析出于表層，應先去除水分后再做稀釋

19、。2煉乳先用溫水洗凈煉乳包裝表面，再用點燃的乙醇棉球將瓶口或鐵制包裝表面消毒后，用無菌開罐器打開包裝，以無菌操作稱取10g檢樣，置一盛有90 mL無菌生理鹽水（0.9%氯化鈉）的三角瓶內(nèi)，振搖混勻。3奶油用無菌操作打開奶油包裝，取適量檢樣置無菌三角瓶內(nèi)，于45水浴或恒溫箱中加熱，溶化后立即取出，以無菌吸管吸取25 mL加入裝有225mL無菌生理鹽水或奶油稀釋液（瓶裝稀釋液應預置于45水浴中保溫）的三角瓶內(nèi)，振搖混勻。必要時作系列連續(xù)稀釋。從檢樣溶化到接種完畢時間不應超過30min。奶油稀釋液的配制：格林氏液（氯化鈉9g，氯化鉀0.12g，氟化鈣0.24g，碳酸氫鈉0.2g，蒸餾水1000mL）

20、250mL，瓊脂1g加蒸餾水750mL，加熱溶解，分裝每瓶225mL，再經(jīng)121滅菌15min。 4奶粉罐裝奶粉的開罐取樣方法同煉乳，袋裝奶粉先用75%酒精進行袋口消毒后，以無菌操作方式打開包裝，稱取25 g檢樣置入裝有適量玻璃珠的無菌的三角瓶內(nèi)，將225mL無菌生理鹽水緩緩加入，振搖使其充分溶解和混勻。5.奶酪用無菌刀削去部分表面封臘，再點燃酒精棉球消毒表面，然后用無菌刀切開奶酪，無菌操作方式切取表面與深層檢樣各少許，放入無菌乳缽中切碎，加入少量生理鹽水研成糊狀。三、蛋與蛋制品檢樣的制備（一）所需材料用品采樣箱、有蓋搪瓷盤、無菌具塞廣口瓶、無菌塑料袋、電鉆與鉆頭、攪拌棒、金屬制雙層旋轉式套管

21、采樣器、鋁鏟、勺子、玻璃漏斗、溫度計、75%酒精棉球、酒精燈和乙醇、編號用品等。（二）樣品的采取1鮮蛋采取完整的鮮蛋，先用流水沖洗外殼，再用75%酒精棉球涂擦表面消毒后，放入無菌容器中，加封做好標記后送檢。2全蛋粉、蛋黃粉、蛋白片、巴氏消毒全蛋粉將包裝的開口處用75%酒精消毒，然后開蓋用無菌采樣器（如金屬制雙層旋轉式套管采樣器等）斜插入包裝底部，使樣品填滿采樣器后提出包裝外，再用無菌小勺自上、中、下部采樣，置無菌的廣瓶中，一般每件樣品采200g左右，不得少于100g。標記后送檢。3冰全蛋、冰蛋黃、冰蛋白、巴氏消毒冰全蛋先將包裝開口處用75%酒精消毒，然后開蓋，用無菌電鉆由頂部到底部斜角鉆入，緩

22、緩鉆取，抽出電鉆，從中取檢樣200g左右，裝入無菌廣口瓶中，標記后送檢。4.成批產(chǎn)品全蛋粉、蛋黃粉、蛋白片、巴氏消毒全蛋粉等產(chǎn)品以一日或一班產(chǎn)量為一批，檢驗沙門氏菌按每批總量5%抽樣，且每批最少不得少于3個檢樣。如是測定菌落總數(shù)或大腸桿菌，每批按裝罐過程前、中、后取樣3次，每次取樣50g，混合為一個檢樣。冰全蛋、冰蛋黃、冰蛋白、巴氏消毒冰全蛋等產(chǎn)品按每500kg取樣一件，如是測定菌落總數(shù)或大腸桿菌，每批按裝罐過程前、中、后取樣3次，每次取樣50g，混合為一個檢樣。（三）檢樣的處理1鮮蛋（1）蛋殼用無菌生理鹽水棉拭擦拭后，將棉拭直接置肉湯培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)?；蛘邔⒄货r蛋放入無菌小燒杯或平皿中，按檢樣

23、要求加入定量無菌生理鹽水或液體培養(yǎng)基，用無菌棉拭將蛋殼表面充分擦洗后，以擦洗液作為檢樣培養(yǎng)。（2）蛋內(nèi)容物（蛋清及蛋黃）將蛋殼用洗滌劑刷洗及沖凈后，將雞蛋浸入0.1%升汞水溶液內(nèi)10分鐘后取出，用無菌棉花或紗布擦干，在雞蛋上置消毒孔巾，再一次用酒精棉球消毒蛋殼，用無菌刀敲破蛋殼后取出蛋白、蛋黃或全蛋液置有玻璃珠的無菌容器內(nèi)，充分搖勻后待檢。2全蛋粉、蛋黃粉、蛋白片、巴氏消毒全蛋粉將樣品放入裝有無菌玻璃珠的無菌瓶內(nèi)，按比例加入無菌生理鹽水充分搖勻后待檢。3冰全蛋、冰蛋黃、冰蛋白、巴氏消毒冰全蛋將裝有冰蛋樣品的容器浸泡于流動冷水中，待樣品融化后取出，再放入裝有無菌玻璃珠的無菌瓶中，充分搖勻后待檢。

24、4蛋制品樣品沙門氏菌增菌培養(yǎng)方法以無菌操作方式稱取樣品，接種于亞硒酸鹽煌綠或煌綠肉湯等增菌培養(yǎng)基（裝于有玻璃珠的無菌瓶內(nèi)）中，蓋緊蓋子，充分搖勻，再放入36（±1）恒溫箱中培養(yǎng)20（±2）h。如果是用亞硒酸鹽煌綠進行增菌培養(yǎng)，各種蛋與蛋制品的樣品接種量都為30g，培養(yǎng)基量為150mL。若是用煌綠肉湯進行增菌培養(yǎng)，不同的蛋與蛋制品接種量、培養(yǎng)基濃度與用量有所不同，見表5-1。表5-1 煌綠肉湯增菌培養(yǎng)時不同單及蛋制品檢樣接種量、培養(yǎng)基濃度與用量一覽表檢樣種類檢樣接種量（g）培養(yǎng)基濃度（g.mL-1）培養(yǎng)基用量(mL)全蛋粉6（加24mL無菌水）1.72.5×10-4

25、120蛋黃粉6（加24mL無菌水）1.72.5×10-4120蛋白片6（加24mL無菌水）1×10-6120冰全蛋301.72.5×10-4150冰蛋黃301.72.5×10-4150冰蛋白301.72×10-5150四、水產(chǎn)品檢樣的制備（一）檢樣制備常用材料用品采樣箱、有蓋搪瓷盤、無菌具塞廣口瓶、無菌塑料袋、無菌刀、鑷子、無菌棉簽、濕度計、編號用品等。（二）樣品的采取水產(chǎn)品食品采樣時，要按檢驗目的與水產(chǎn)品種類來確定采樣量。一般除大型魚類與海獸只割取其局部作為樣品外，其他水產(chǎn)品大多采取完整個體。在以判斷質量鮮度為目的時，魚類與較大型貝殼類以個體

26、為一件樣品，單獨采取，并且對成批水產(chǎn)品做質量判斷時，須采取多個個體做多件檢驗以反映全面質量；對于小型魚類和蝦、小蟹等樣品只進行混合采樣，須采取更多個體，了般采樣5001000g；魚糜制品（如魚丸、灌腸等）和熟制品一般采樣250g，樣品采取后放入無菌容器中。（三）樣品的處理1魚類一般采取檢樣部位為背肌。取鮮魚310條，流水洗凈去鱗，用75%酒精擦凈并消毒魚背，待干后用無菌解剖刀在其背部沿脊椎切開約5cm長的切口，再沿垂直于脊椎的方向切開兩端使兩塊背肌分別向兩側翻開，然后用無菌刀或剪子剪取25g魚肉，放入無菌乳缽中，用無菌剪子剪碎，加無菌海砂或玻璃砂研磨（也可用均質器），磨碎后加入225mL無菌生

27、理鹽水，混勻待檢。剪取樣品時應注意勿觸破及粘上魚皮；如果是魚糜制品和熟制品應先在乳體中磨碎后再加生理鹽水混勻待檢。2蝦類一般采取的部位是腹節(jié)內(nèi)的肌肉。用流水將蝦沖洗干凈，摘去頭胸節(jié)后，用無菌剪子剪去腹節(jié)與頭胸節(jié)連接處的肌肉，然后將腹節(jié)內(nèi)的肌肉擠入無菌乳缽內(nèi)，去腸管后取25g，以后處理如同魚類檢樣。3蟹類一般采取部位為胸部肌肉。以流水將蟹體沖洗干凈，揭開殼蓋及腹部，除去鰓條后，再置流水下沖洗干凈，以75%酒精棉球擦試前后外壁以消毒，置于無菌搪瓷盤上，待干后用無菌剪刀剪開成為左右兩半，將一半蟹體內(nèi)的肉擠出（用手指從足根向剪開的一端擠壓），稱取25g置滅菌乳缽內(nèi)，以后處理如同魚類檢樣。4貝殼類一般采

28、取部位為貝殼的內(nèi)容物。以流水將貝殼刷洗干凈，然后放在鋪有無菌毛巾的搪瓷盤或工作臺上，采樣操作者雙手用75%酒精棉球消毒后，用無菌鈍刀緩緩打開貝殼，再用無菌鑷子取出整個內(nèi)容物，稱取25g置無菌乳缽內(nèi)，以后處理如同魚類檢樣。 以上采樣及處理方法是以檢驗水產(chǎn)品肌肉內(nèi)細菌含量從而判斷新鮮度為目的的。如果要檢驗水產(chǎn)品是否污染某種致病菌時，檢驗部位應為胃腸消化道及鰓等呼吸器官：魚類采取腸管和鰓；蝦類采取頭胸節(jié)內(nèi)的內(nèi)臟和腹節(jié)外沿處的腸管；蟹類采取胃和鰓；貝殼類的螺類采取腹足肌肉以下的部分，雙殼類采取覆蓋在斧足外層的內(nèi)臟和鰓。五、飲料、冷凍飲品檢樣的制備 （一）檢樣制備常用材料用品采樣箱、有蓋搪瓷盤、無菌具塞

29、廣口瓶、無菌塑料袋、無菌刀、鑷子、無菌棉簽、濕度計、編號用品等。（二）樣品的采取1.碳酸飲料、瓶（桶）裝飲用水、果汁（漿）及果汁飲料、含乳飲料、果子露、果汁水等采樣時應以原包裝為樣品單位，小包裝以4杯為一件，大包裝者，以1桶或1瓶為一件，采取2瓶。散裝飲料樣品用無菌操作方式采取500mL置于無菌容器中。2.冰淇淋、冰棍等冷凍食品采原包裝樣品單位2個單位，如為散裝則用無菌勺采樣200克、食品冰塊以500g為一件，采后置于無菌容器內(nèi)。冰棍如果班次產(chǎn)量在2萬支以下，一班為一批；班產(chǎn)量在2萬支以上的，以工作臺為一批。采樣方法是一批取3件，一件取3支。此類樣品采取后應放在隔熱容器內(nèi)。以上所有樣品采取后，

30、立即送檢。最長不超過3h。（三）樣品的處理1.瓶（罐）裝飲料用點燃的酒精棉球灼燒包裝開口處滅菌，再用石炭酸紗布蓋好，如果是塑料瓶，瓶口可用75%酒精棉球擦拭滅菌。然后用無菌開瓶器將蓋啟開。含二氧化碳的飲料可倒入另一無菌容器中，勿蓋緊，覆蓋一層無菌紗布，輕輕搖蕩，使氣體全部逸出后待檢2.冰棍用無菌鑷子除去包裝，將冰棍部分放入無菌磨口瓶中，木簽留在外面，蓋上瓶蓋，用力抽出木棒，或用無菌剪子剪去木簽，然后置于45的水浴中30min，溶化后檢驗。3.冰淇淋置于無菌容器內(nèi)，待其溶化后檢驗。六、調味品檢樣的制備調味品包括醬油、醬類和醋等，是以豆類、谷類為原料發(fā)酵而成的食品。（一）樣品的采取1.醬油與食醋具

31、包裝者采取原包裝，散裝的樣品用無菌吸管采取適量。2.醬類用無菌勺子采取適量，放入無菌磨口瓶中。（二）樣品的處理1.瓶裝樣品用點燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，再用石炭酸紗布蓋好，然后用無菌開瓶器啟開檢驗。2.醬類用無菌操作方式稱取25g，放入無菌容器中，加入蒸餾水225mL，制成混懸液待檢。3.食醋用200300g/L的無菌碳酸鈉溶液調節(jié)pH至中性。七、冷食菜、豆制品檢樣的制備冷食菜多為蔬菜和熟肉制品不經(jīng)加熱而直接食用的涼拌菜；豆制品是以大豆為原料制成的含大量蛋白質的食品。這兩類食品加工后，在盛裝、運輸及銷售過程中易受到微生物的污染，如不加強衛(wèi)生管理，極易造成食物中毒及腸道疾病的傳播。（一)樣品的采

32、取1. 冷食菜將樣品混勻后，采取200g放入無菌容器中。2.豆制品采取接觸盛裝容器邊緣、底部、及上部等不同部位的樣品共200g，放入無菌容器中。（二）樣品的處理以無菌操作方式稱取檢樣25g，放入裝有225mL蒸餾水中，制成混懸液待檢。八、糖果、糕點和蜜餞檢樣的制備糖果、糕點和蜜餞等食品大多是由糖、牛奶、雞蛋、水果等原料制成甜食。營養(yǎng)豐富，易于細菌繁殖。造成食品變質。對于這類食品進行微生物檢驗也是很有必要的。其檢樣制備方法如下。（一）樣品的采取糖果采取原包裝樣品。 糕點和蜜餞用無菌鑷子夾取不同部位樣品，放入無菌容器中。（二）樣品的處理1.糖果 用無菌鑷子夾取包裝紙，稱取樣品25g，放入已預溫至4

33、5的225mL無菌生理鹽水中，制成110稀釋液，待溶化后即可檢驗。2.糕點如有包裝，用無菌鑷子夾取下包裝紙，采取外層及中心部位；如為帶餡糕點，用無菌操作稱取糕點外皮及內(nèi)餡25g，如為奶花糕點，采取奶花與糕點部分共25g（兩者比例11），采后置于無菌乳缽內(nèi)，先加入25 mL無菌生理鹽水研磨成乳液，然后加入200mL滅菌生理鹽水混勻制成110的稀釋液。3.蜜餞 無菌操作方式采取不同部位共25g，置于無菌乳缽內(nèi)，先加入25 mL無菌生理鹽水研磨成乳液，然后加入200mL滅菌生理鹽水混勻制成110的稀釋液。九、酒類檢樣的制備酒類因含酒精，一般不進行微生物學檢驗，需檢驗的主要是酒精度低的發(fā)酵酒，特別是散

34、裝生啤酒，因不加熱常生存大量細菌。酒類的檢樣制備方法如下。（一）樣品的采取若是瓶裝酒類采取原包裝樣品2瓶；若是散裝的酒類則用無菌容器采取500mL，放入無菌磨口瓶中。（二）樣品的處理1.瓶裝酒類用點燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，然后用無菌石炭酸紗布蓋好，再用無菌開瓶器啟開蓋子；含二氧化碳的酒類可倒入一無菌容器中，口勿蓋緊，覆蓋一無菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體完全逸出后即可檢驗。2.散裝酒類可直接吸取進行檢驗。十、方便面檢樣的制備方便面類食品以小麥粉、蕎麥粉、綠豆粉、米粉等為主要原料，添加食鹽或面質改良劑，加適量水調制、壓延、成型、汽蒸后，經(jīng)油炸或干燥處理，達到一定熟度的糧食制品。在加工、存放、銷售過程

35、中常會污染細菌，造成變質。其檢樣制備如下。（一）樣品的采取袋裝或碗裝方便面類采取3袋（碗）；簡易包裝的采取200g.（二）樣品的處理如果樣品未配調味包，用無菌操作開封取樣，稱取25g樣品，加入225mL無菌生理鹽水制成110的稀釋液；如為配有調味料的方便面類則需將面塊與全部調料及配料一起稱取25g，按11加入無菌生理鹽水，制成檢樣勻質液，然后再稱取10mL勻質液加入90mL無菌生理鹽水中制成110的稀釋液，待檢。十一、罐藏食品檢樣的制備與檢驗罐藏食品是將食品原料經(jīng)過預處理后裝入容器，經(jīng)殺菌、密封后制成的，通常稱為罐頭。罐藏食品是處于商業(yè)無菌狀態(tài)。商業(yè)無菌指的是罐藏食品經(jīng)過適度的熱殺菌后，不含有

36、致病的微生物，也不含有在通常溫度下能在其中繁殖的非致病性微生物的狀態(tài)。并不是完全滅菌（完全不存在活菌）。因為完全滅菌，當溫度達121以上時，會加速罐頭的香味消散、色澤和堅實度的改變以及營養(yǎng)成分的損失。所以采用商業(yè)無菌的方法。其檢驗方法如下。（一） 審查生產(chǎn)操作記錄工廠檢驗部門對送檢產(chǎn)品的下述操作記錄應認真進行審閱，并妥善保存至少3年備查。1. 殺菌記錄殺菌記錄包括自動記錄儀和相應的手記記錄，記錄紙上要標明產(chǎn)品品名、規(guī)格、生產(chǎn)日期和殺菌鍋號。每一項圖表記錄都應由殺菌操作者親自記錄和簽名，由車間專人審核簽字，最后由工廠檢驗部門審定后簽字。2. 殺菌后的冷卻水有效氯含量測定的記錄3. 罐頭密封性檢驗

37、記錄罐頭密封性的全部記錄應包括空罐與實罐卷邊封口質量和焊縫質量的常規(guī)檢查記錄，記錄上應明確標記批號與罐數(shù)等，并由檢驗人員和主管人員簽字。（二） 抽樣方法可采用下列抽樣方法之一。1. 按殺菌鍋抽樣低酸性食品罐頭在殺菌冷卻完畢后每個殺菌鍋抽樣2罐，3kg以上的大罐每鍋抽一罐，酸性食品罐頭每鍋抽1罐。一般一個班的產(chǎn)品組成一個檢驗批，將各鍋的樣罐組成一個檢驗批送檢，每批每個品種取樣基數(shù)不得少于3罐。產(chǎn)品應按鍋劃分堆放，這樣在遇到由于殺菌操作不當引起問題時，也可按鍋處理。2. 按生產(chǎn)班（批）次抽樣（1）取樣數(shù)為1/6000，尾數(shù)超過2000者增取1罐，每班（批）每個品種不得少于3罐。（2）某些產(chǎn)品班產(chǎn)量

38、較大時，則以30000罐為基數(shù)，30000罐以內(nèi)其取樣數(shù)按1/6000；超過30000罐則按1/20000取樣，尾數(shù)超過4000者增取1罐.（3）個別產(chǎn)品產(chǎn)量過小，同品種、同規(guī)格可合并班次為一批進行取樣，但并班總數(shù)不超過5000罐，每個班次取樣不得少于3罐。（三）稱量用電子秤或天平稱量，1kg及以下的罐頭精確到1g，1kg以上的罐頭精確到2g。各罐頭的質量減去空罐的平均質量即為該罐頭的凈重。稱量前對樣品進行記錄編號。（四）保溫將全部樣罐下述分類在規(guī)定溫度下按規(guī)定時間進行保溫（表5-2）。保溫過程中應每天檢查，如有胖聽或泄漏等現(xiàn)象，立即剔出做開罐檢查。表5-2 樣罐保溫溫度及時間罐頭種類溫度/時

39、間/天低酸性罐頭食品36±110酸性罐頭食品30±110預定要送往熱帶地區(qū)（40以上）的低酸性罐頭食品55±157（五）開罐（1）取保溫過的全部罐頭，冷卻到常溫后，按無菌操作方式開罐檢驗；（2）將樣罐用溫水和洗滌劑洗刷干凈，用自來水沖洗后擦干。放入無菌室，以紫外光殺菌燈照射30min。（3）將樣罐移置于超凈工作臺上，用75%酒精棉球擦拭無代號端，并點燃滅菌（胖聽罐不能燒）。用無菌衛(wèi)生開罐刀或罐頭打孔器開啟（帶湯汁的罐頭開罐前要適當振搖），開罐時不能傷及卷邊結構。（六）留樣開罐后，用滅菌吸管或其他適當工具以無菌操作取出內(nèi)容物1020mL（g），移入無菌容器中，保存于

40、冰箱內(nèi)。待該批罐頭檢驗得出結論后方可棄去。（七）pH測定取樣測定pH值，與同批中正常罐進行比較，看是否有顯著差異。（八）感官檢查在光線充足、空氣清潔無異味的檢驗室中將罐頭內(nèi)容物傾入白色搪瓷盤內(nèi)，由有經(jīng)驗的檢驗人員對產(chǎn)品的外觀、色澤、狀態(tài)和氣味等進行觀察和嗅聞，用餐具按壓食品或戴薄指套以手指進行觸感，鑒別食品變質的跡象。（九）涂片染色鏡檢1.涂片對感官或pH檢查結果認為可疑的，以及腐敗時pH反應不靈敏的（如肉、禽、魚類等）罐頭食品樣品，均應進行涂片染色鏡檢。帶湯汁的罐頭樣品可用接種環(huán)挑取湯汁涂于載玻片上。固態(tài)食品可以直接涂片或用少量滅菌生理鹽水稀釋后涂片。待干后用火焰固定。油脂性食品涂片自然干燥

41、并火焰固定后，用二甲苯流洗，自然干燥。2.染色鏡檢用革蘭染色法染色、鏡檢，至少觀察5個視野，記錄細菌的染色反應、形態(tài)特征及每個視野的菌數(shù)。與同批的正常樣品進行對比，判斷是否有明顯的微生物增殖現(xiàn)象。（十）接種培養(yǎng)保溫期間出現(xiàn)的胖聽、泄漏或開罐檢查發(fā)現(xiàn)pH、感官質量異常、腐敗變質，進一步鏡檢發(fā)現(xiàn)有異常數(shù)量細菌的樣罐。均應及時進行微生物接種培養(yǎng)。對需要接種培養(yǎng)的樣罐（或留罐）用滅菌的適當工具移出約1mL（g）內(nèi)容物，分別接種培養(yǎng)。接種培養(yǎng)約為培養(yǎng)基的1/10.要求在55溫箱培養(yǎng)。在接種前培養(yǎng)基管應在55水浴中預熱至該溫度，接種后立即放入55溫箱培養(yǎng)。1.低酸性罐頭食品低酸性罐頭食品（每罐）接種培養(yǎng)基

42、、管數(shù)入培養(yǎng)條件見表5-3。表5-3 低酸性罐頭食品的檢驗培養(yǎng)基管數(shù)培養(yǎng)條件/時間/天皰肉培養(yǎng)236±1（厭氧）96120皰肉培養(yǎng)255±1（厭氧）2472溴甲酚紫-葡萄糖肉湯（帶倒管）236±1（需氧）96120溴甲酚紫-葡萄糖肉湯（帶倒管）255±1（需氧）2472注：此表引自中華人民共和國國家標準GB/T4789.26-2003罐頭食品商業(yè)無菌的檢驗2.酸性罐頭食品酸性罐頭食品（每罐）接種培養(yǎng)基、管數(shù)入培養(yǎng)條件見表5-4。表5-4 酸性罐頭食品的檢驗培養(yǎng)基管數(shù)培養(yǎng)條件/時間/天酸性肉湯255±1（需氧）48酸性肉湯230±1（需

43、氧）96麥芽浸膏湯230±1（需氧）96注：此表引自中華人民共和國國家標準GB/T4789.26-2003罐頭食品商業(yè)無菌的檢驗（十一）微生物培養(yǎng)檢驗程序及判定 1.檢驗程序將按表5-3或表5-4接種的培養(yǎng)基分別放入規(guī)定溫度的恒溫箱進行培養(yǎng)，每天觀察培養(yǎng)生長情況，低酸性罐頭食品培養(yǎng)檢驗程序如圖5-1。2.判定（1）對在36培養(yǎng)有菌生長的溴甲酚紫-葡萄糖肉湯管，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，并涂片染色鏡檢。如果是含桿菌的混合培養(yǎng)物或球菌、酵母菌或霉菌的純培養(yǎng)物，不再往下檢驗。如僅有芽孢桿菌則判為嗜溫性需氧芽孢桿菌。如僅有桿菌無芽孢則為嗜溫性需氧桿菌。如需進一步證實是否是芽孢桿菌，可轉接于錳鹽營養(yǎng)瓊

44、脂平板在36培養(yǎng)后再作判定。2.對于在55培養(yǎng)有菌生長的溴甲酚紫-葡萄糖肉湯管，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，并涂片染色鏡檢。如有芽孢桿菌，則判為嗜熱性需氧芽孢桿菌。如僅有桿菌無芽孢則為嗜熱性需氧桿菌。如需進一步證實是否是芽孢桿菌，可轉接于錳鹽營養(yǎng)瓊脂平板在55培養(yǎng)后再作判定。3.對于在36培養(yǎng)有菌生長的皰肉培養(yǎng)管，涂片染色觀察。如為不含桿菌的混合菌相，不再往下進行。如有桿菌，帶或不帶芽孢，都要轉接于兩個血瓊脂平板（或卵黃瓊脂平板），在36分別進行需氧和厭氧培養(yǎng)。在需氧平板上有芽孢生長，則為嗜溫性兼性厭氧芽孢桿菌。在厭氧平板上生長為一般芽孢則為嗜溫性厭氧芽孢桿菌。如有梭狀芽孢桿菌，應用皰肉培養(yǎng)基原培養(yǎng)液進

45、行肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗（按GB/T4789.12）。4.對于在55培養(yǎng)有菌生長的皰肉培養(yǎng)管，涂片染色鏡檢。如有芽孢，則有嗜熱性厭氧芽孢桿菌或硫化腐敗性芽孢桿菌。如無芽孢僅有桿菌，轉接于錳鹽營養(yǎng)瓊脂平板，在55厭氧培養(yǎng)，如有芽孢則為嗜熱性厭氧芽孢桿菌，如無芽孢則為嗜熱性厭氧桿菌。同樣，若是酸性罐頭食品，則對有微生物生長的酸性肉湯和麥芽膏湯管進行觀察，并涂片染色鏡檢，按所發(fā)現(xiàn)的微生物類型進行判定。（十二）罐頭密封性檢驗對確定有微生物繁殖的樣罐均應進行密封性檢驗以判定該罐是否泄漏。將已洗凈的空罐，經(jīng)35烘干，根據(jù)單位的設備條件進行減壓或加壓試漏。1.減壓試漏往烘干的空罐內(nèi)小心地注入清水至八九分滿，

46、將一帶橡膠圈的有機玻璃板妥當安放罐頭開啟端的卷邊上，使能保持密封。啟動真空泵，關閉放氣閥，用手按住蓋板，控制抽氣，使真空表從0Pa升至6.8×104Pa（510mmHg）的時間在1min以上，并保持此真空度1min發(fā)上，傾側空罐，仔細觀察罐內(nèi)底蓋卷邊及焊縫處有無氣泡產(chǎn)生，凡有同一部位連續(xù)產(chǎn)生氣泡的，就判斷為泄漏。記錄漏氣的時間和真空度，并在漏氣部位做上記號。2.加壓試漏用橡皮塞將空罐的開孔塞緊，開動空氣壓縮機，慢慢開啟閥門，使罐內(nèi)壓力逐漸加大，同時將空罐浸沒在盛水玻璃缸中，仔細觀察罐外底蓋卷邊及焊縫處有無氣泡產(chǎn)生，直至壓力升到0.7kgf/cm2（1kgf/cm2=98.0665kP

47、a）并保持2min，凡有同一部位連續(xù)產(chǎn)生氣泡的，應判斷為泄漏。記錄漏氣的時間和真空度，并在漏氣部位做上記號。（十三）結果判定 1.商業(yè)無菌的判定該批（鍋）罐頭食品經(jīng)審查生產(chǎn)操作記錄屬于正常；抽取樣品經(jīng)保溫試驗未胖聽或泄漏；保溫后開罐，經(jīng)感官檢查、pH測定、涂片鏡檢和接種培養(yǎng)，確證無微生物增殖現(xiàn)象，則為商業(yè)無菌。2.商業(yè)有菌的判定該批（鍋）罐頭食品經(jīng)審查生產(chǎn)操作記錄，未發(fā)現(xiàn)問題國抽取樣品經(jīng)保溫試驗有1罐或1罐以上發(fā)生胖聽或泄漏；或保溫后開罐，經(jīng)感官檢查、pH測定、涂片鏡檢和接種培養(yǎng)，確證有微生物增殖現(xiàn)象，則為非商業(yè)無菌。附：罐頭食品商業(yè)無菌檢驗專用培養(yǎng)基1.溴甲酚紫-葡萄糖肉湯 （1）成分蛋白胨

48、10g，牛肉浸膏3g，葡萄糖10g，氯化鈉5g，溴甲酚紫0.04g（或1.6%酒精溶液2mL），蒸餾水1000mL。 （2）制法將上述成分（溴甲酚紫除外）加熱攪拌溶解，調pH至6.87.2，加入溴甲酚紫，分裝于帶有小倒管的中號試管中，每管1mL0，121滅菌15min。2.酸性肉湯 （1）成分多價蛋白胨5g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，磷酸氫二鉀4g.蒸餾水1000mL。（2）制法將上述各成分加熱攪拌溶解，調pH至4.85.2，121滅菌15min，切忌過分加熱。3.麥芽浸膏湯 （1）成分麥芽浸膏15g，蒸餾水1000mL（2）制法將麥芽浸膏在蒸餾水充分溶解，濾紙過濾，調pH至4.54.9，分裝

49、，121滅菌15min。4.錳鹽營養(yǎng)瓊脂按GB/T4789.28-2003配制營養(yǎng)瓊脂，每1000mL加入硫酸錳水溶液1mL（100mL蒸餾水溶解3.08g硫酸錳）。觀察芽孢形成情況，最長不超過10d。第三節(jié) 菌落總數(shù)的檢驗技術菌落總數(shù)是指食品經(jīng)過處理并在一定條件下培養(yǎng)后，所得1mL（g）檢樣所含細菌菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)主要是用于判斷食品被污染程度的標志，此外可用這種方法觀察細菌在食品中繁殖動態(tài)，以便為檢樣進行衛(wèi)生學評價時提供依據(jù)。每種細菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時應用不同的培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間 、pH、需氧性質等）來培養(yǎng)不同的細菌，因此菌落總數(shù)的檢驗有標準平板培養(yǎng)計數(shù)法、嗜冷菌計數(shù)

50、、嗜熱菌（芽孢）計數(shù)、厭氧菌計數(shù)、革蘭陰性菌計數(shù)等方法。在實際工作中，細菌總數(shù)測定常用一種方法去做，就是國際標準規(guī)定的平板計數(shù)法。一、 菌落總數(shù)的標準平板培養(yǎng)計數(shù)法（一） 原理平板菌落計數(shù)法，是根據(jù)每個活的細菌能長出一個菌落的原理設計的。取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高，是一種檢測污染活菌數(shù)的方法，也是目前國際上許多國家所采用的方法。使用該法應注意：一般選取菌落數(shù)在30300之間的平板進行計數(shù)，過多或過少均不準確；為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入0001的2，3，5一氯化三苯基四氮唑(T

51、TC)；本法限用能形成菌落的微生物。所得結果只包含一群能在營養(yǎng)瓊脂上生長的嗜中溫需氧菌的菌落總數(shù)，并不表示樣品中實際存在的所有細菌菌落總數(shù)。這種方法廣泛應用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細菌檢驗，是最常用的活菌計數(shù)法。（二） 培養(yǎng)基和試劑1. 培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g，瓊脂15-20g，牛肉膏3g，蒸餾水1000mL，氯化鈉5g，pH7.2-7.4。制法：將除瓊脂外的其他成分溶于蒸餾水中，用15%的NaOH調節(jié)pH，使之控制在7.2-7.4之間。再加入瓊脂，加熱使之溶解，再于121高壓滅菌15min。2. 無菌生理鹽水成分：氯化鈉0.9 g，蒸餾水100mL。制法：根據(jù)需要按比例進行配制。

52、一個檢樣一般需250mL。稱取2.2g氯化鈉加入250蒸餾水溶解后，取2支大試管，每支裝9 mL的生理鹽水，再量取225 mL生理鹽水裝入500 mL的含適量玻璃珠的廣口瓶或三角瓶中；剩余的裝入另一支試管中，全部包扎后于121高壓滅菌15min。其他試劑還有75%乙醇、磷酸鹽緩沖稀釋液等。（三）儀器設備恒溫培養(yǎng)箱：（36±1）；冰箱；恒溫水浴箱：（46±1）；托盤天平、均質器；1 mL無菌吸管（具0.01mL 刻度）；10mL 無菌吸管（具o.lmL 刻度）或微量移液器及吸頭；容量250 mL 、500 mL的無菌錐形瓶；無菌培養(yǎng)皿（直徑90 mm）；pH 計或pH 比色管

53、或精密pH 試紙； 無菌刀、剪子、鑷子；酒精燈；放大鏡或（和）菌落計數(shù)器或PetrifilmTM1）自動判讀儀。（四） 檢驗程序 菌落總數(shù)的標準平板培養(yǎng)計數(shù)法檢驗程序見圖5-1（五） 操作步驟1.培養(yǎng)基的制備 根據(jù)檢測樣品量的大小，計算所需營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)其和生理鹽水的用量，然后按（二）中所述方法配制好備用。2. 樣品稀釋、分裝與培養(yǎng)（1）以無菌操作取有代表性的樣品盛于無菌容器內(nèi)。如有包裝，則用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。以無菌操作取25g樣品，放入裝有225mL無菌生理鹽水的無菌均質杯內(nèi)，于8000r/min檢樣做幾個適當倍數(shù)稀釋度選擇2-3個適宜稀釋度，各取1mL加入無菌平皿內(nèi)每皿加入適

54、量瓊脂培養(yǎng)36±1，48±2h菌落計數(shù)報 告圖5-1 菌落總數(shù)的檢驗程序均質1-2min，制成1：10的樣品稀釋液。如樣品均質時間超過2min，應在均質杯外加冰水冷卻。（2） 用1mL無菌吸管準確吸取1：10的樣品稀釋液1mL，放入裝有9mL無菌生理鹽水的試管中。迅速振搖，將樣品混勻，制成1：100的樣品稀釋液。振搖時，幅度為30cm，7s內(nèi)振搖25次。注意吸管尖不要碰著瓶口及管內(nèi)稀釋液。吸入的液體應先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端離開液面并貼在容器內(nèi)壁將液體調至所要求的刻度。（3）另取一支1mL無菌吸管，按（2）的操作程序，做10倍遞增樣品稀釋液（圖5-2）。每遞

55、增1次，換用1支無菌1mL無菌吸管。10-110-810-710-310-210-610-510-4圖5-2 樣品10倍遞增稀釋示意圖（4）根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求，或對檢樣污染情況的估計，選擇23個適宜的樣品稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，以吸取該樣品稀釋液的吸管移1mL樣品稀釋液到作了適宜標志的無菌平皿中，每個稀釋度做兩平皿。（5）樣品稀釋液移入平皿后，分別加12-15mL的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（約45左右）到平皿內(nèi)。立即轉動平皿使樣品稀釋液和瓊脂培養(yǎng)基充分混合。要防止把混合物濺到平皿壁和蓋上。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL稀釋劑的另一無菌平皿作空白對照。將樣品液加入平皿后應立即傾注瓊脂培

56、養(yǎng)基，每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間不得超過20min。（6） 培養(yǎng)待瓊脂凝固后將平皿翻轉，立即放進36±1的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48±2h。培養(yǎng)箱應保持一定的濕度，經(jīng)48h培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基的失重不得超過15%。（六）菌落總數(shù)的計數(shù)方法培養(yǎng)后，立即計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)。如不能立即計數(shù)，應將平板存放于0-4，但不得超過24h。操作者對同一平板復核自己的計數(shù)結果，其差異應在5%之內(nèi)，而其他人對這一平板重復計數(shù)，其差異應在10%這內(nèi)。否則，應找出原因，加以校正。適宜稀釋度的兩個平板的菌落數(shù)平均值或兩個稀釋度的平板菌落數(shù)平均值乘以相應稀釋度倍數(shù)計算出每克（毫升）樣品中平板菌落數(shù)。1平皿菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30300的平皿作為菌落總數(shù)測定標準。做平皿菌落計數(shù)時，可用肉眼觀察，必要時可用放大鏡檢查，以防遺漏。每一個稀釋度應采用兩個平皿平均數(shù)，如其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，以無片狀菌落生長的平皿計算該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平皿的一半，而另一半菌落分布很均勻，則可計算半個平皿后乘以2代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如果有鏈狀菌落生長，如只有一條鏈