動(dòng)物寄生蟲的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

1、動(dòng)物寄生蟲的分子生物學(xué)研究進(jìn)展作者 :張其艷,楊曉花 來源 :動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 |云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650212摘 要:動(dòng)物寄生蟲的分子生物學(xué)研究始于 20世紀(jì) 90年代中期, 雖然起步 較晚,但進(jìn)展極快。近 10年來,研究廣度已涉及所有重要的寄生原蟲,并已擴(kuò) 展到了具有重要公共衛(wèi)生意義的部分寄生蠕蟲, 研究深度已進(jìn)入寄生蟲的基因序 列測(cè)定分析、分類比對(duì)鑒定、診斷方法的建立和免疫學(xué)研究領(lǐng)域,建立了近 50種寄生蟲的 cDNA 文庫。我國雞球蟲、旋毛蟲等蟲種的分子生物學(xué)研究達(dá)到和接 近世界先進(jìn)水平。 這些研究成果和技術(shù)水平, 已為動(dòng)物寄生蟲病的研究和防控工 作展示了新的前景。關(guān)鍵詞:分

2、子生物學(xué); 動(dòng)物寄生蟲學(xué);相互關(guān)系2004年 11月, 中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)在廣西桂林召開了第五 次代表大會(huì)暨第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)。會(huì)議交流和收錄到 2002年以來有代表性的重 要論文和論文摘要共計(jì) 247篇(全文 84篇,摘要 163篇。其中,應(yīng)用先進(jìn)的分 子生物學(xué)、免疫學(xué)和生物化學(xué)等現(xiàn)代科學(xué)技術(shù),在寄生蟲病原基因?qū)W和分類學(xué), 新型診斷方法的研究探討和建立, 基因功能分析研究和免疫制劑研制等方面的論 文和論文摘要就達(dá) 127篇(全文 48篇,摘要 79篇,占論文總數(shù)的 51.4%1。這 過半數(shù)的論文及論文所顯示的學(xué)術(shù)水平, 表明我國在動(dòng)物寄生蟲學(xué)和寄生蟲病學(xué) 的研究上,已初步完成了從

3、傳統(tǒng)寄生蟲學(xué)向寄生蟲分子生物學(xué)研究階段的過渡, 極大的拓展了寄生蟲學(xué)的研究領(lǐng)域, 充分開拓和展示了分子生物學(xué)新技術(shù)、 新方 法在寄生蟲分類學(xué)和寄生蟲病診斷及防控上的重要作用和地位。 本文就會(huì)議的相 關(guān)論文結(jié)合分子生物學(xué)的發(fā)展情況綜述如下。1分子生物學(xué)發(fā)展史的簡要回顧分子生物學(xué)是在細(xì)胞生物學(xué)、 生物化學(xué)、 遺傳學(xué)和微生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā) 展起來的一門進(jìn)展極快的新興學(xué)科。 大體分為 3個(gè)發(fā)展階段:20世紀(jì) 50年代前, 處于細(xì)胞染色體水平的基因遺傳學(xué)研究階段; 之后, 進(jìn)入 DNA 大分子水平的基因 分子生物學(xué)研究階段;70年代后,DNA 的重組和 DNA 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展日趨完善, 使分子生物學(xué)進(jìn)

4、入了一個(gè)全新的階段, 基本形成了系統(tǒng)的現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論 和實(shí)用操作技術(shù)體系。其中,最重要的技術(shù)發(fā)明和技術(shù)方法表現(xiàn)為如下幾點(diǎn):1972年 Paul Berg 在體外建立了 DNA 的重組技術(shù),奠定了基因工程的基礎(chǔ)。1973年,Boyer H 等首次用質(zhì)?？寺?DNA,并發(fā)現(xiàn)和建立了多種克隆載體; 1974年首次實(shí)現(xiàn)了異源真核基因在大腸埃希菌中的表達(dá),隨之逐步建立了在多 種微生物、動(dòng)物和植物體內(nèi)的真核表達(dá)系統(tǒng)和原核表達(dá)系統(tǒng)。1985年 Mulli K 等發(fā)現(xiàn)可用大腸埃希菌大片段聚合酶在體外擴(kuò)增單拷貝的 哺乳動(dòng)物基因,完成了體外生物的化學(xué)合成基因技術(shù),使 DNA 片段以 2n 倍增, 奠定了 P

5、CR 的技術(shù)基礎(chǔ)。由此建立了許多 PCR 新技術(shù),如 RT-PCR、DD-PCR 技術(shù)等。可擴(kuò)增和顯示來源于多種細(xì)胞或組織的 mRNA 的 cDNA 等。1996年又建立了 代表性差異分析(RDA方法,應(yīng)用于基因差別表達(dá)的分析。20世紀(jì) 90年代后期,為適應(yīng)大規(guī)模、高通量的基因表達(dá)分析,區(qū)別不同組 織、 不同細(xì)胞、 不同階段和不同狀態(tài)下基因表達(dá)上的差異, 新建立的技術(shù)有表達(dá) 序列標(biāo)簽法(EsTs技術(shù)(吳乃虎, 1998, 微點(diǎn)陣基因芯片(microarray技術(shù)(賀 林等,2000,基因表達(dá)系列分析(SAGE技術(shù)(王彩虹等,2001和 cDNA 微點(diǎn)陣 (Schena等,1995等檢測(cè)試劑盒或

6、探針。1977年 Sanger F 等發(fā)明了雙脫氧法測(cè)定 DNA 序列,Maxam A M 和 Gilbert W 也于同年建立了化學(xué)修飾法測(cè)定 DNA。 1986年 Ansorge W 的首臺(tái)自動(dòng) DNA 測(cè)序儀 投入使用。1998年全基因組鳥槍法(wholegenomeshotgun作為成熟技術(shù)實(shí) 際應(yīng)用,至 2001年,完成了人類基因組和模式生物基因組的 DNA 測(cè)序計(jì)劃。分子生物學(xué)領(lǐng)域的這些新技術(shù)和新方法, 在獸醫(yī)學(xué)的病原、 診斷、 免疫和疫 病監(jiān)測(cè)控制等方面都得到了較廣泛的應(yīng)用, 取得了一些成果, 從一個(gè)側(cè)面為分子 生物學(xué)技術(shù)方法的完善和發(fā)展作出了積極貢獻(xiàn)。2分子生物學(xué)在動(dòng)物寄生蟲學(xué)

7、研究上的應(yīng)用和成果2.1動(dòng)物寄生蟲的分子生物學(xué)研究歷史概況和主要成果動(dòng)物寄生蟲及其引發(fā)疫病的防治, 是預(yù)防獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要組成部分。 除寄 生原蟲為單細(xì)胞結(jié)構(gòu)、 生物學(xué)特性較單純外, 其余寄生蟲病原體較大, 結(jié)構(gòu)較為 復(fù)雜, 在分子水平對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)研究, 比病毒、 細(xì)菌和原生動(dòng)物要復(fù)雜和困難 得多。 對(duì)寄生蟲進(jìn)行分子生物學(xué)的研究大多起步于 20世紀(jì) 90年代中后期, 但由 于有許多成熟的分子生物學(xué)研究技術(shù)和方法可供借鑒, 所以, 寄生蟲的分子生物 學(xué)研究雖然起步較晚,但研究的起點(diǎn)一般都較高,研究進(jìn)展也較快 2。2002年前,國內(nèi)已對(duì)重要的動(dòng)物和人畜共患寄生蟲病原體,如血吸蟲、肝 片吸蟲、豬帶

8、絳蟲、棘球絳蟲、弓形蟲、隱孢子蟲、球蟲、旋毛蟲等,利用基因 組計(jì)劃的細(xì)菌人工染色體、 酵母人工染色體技術(shù), 以及芯片技術(shù)、 聚類分析技術(shù)、 表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)、 熒光原位雜交技術(shù)、 體內(nèi)選擇技術(shù)和同線性分析技術(shù)等, 對(duì) 病原寄生蟲的核酸、 蛋白組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究, 對(duì)大部分所研究的寄生蟲種構(gòu) 建了某發(fā)育階段或系統(tǒng)發(fā)育階段的 cDNA 數(shù)據(jù)庫,對(duì)部分蟲種構(gòu)建了遺傳圖、物 理圖、 序列圖和基因圖。 同時(shí), 利用 PCR 及其相關(guān)的 PCR/RELP、 PCR-RAPD、 PCR-TRF、 PCR-核酸雜交技術(shù)、PCR/ISH等技術(shù)方法,對(duì)部分寄生蟲進(jìn)行了分類鑒定,并對(duì) 其重要功能基因進(jìn)行克隆和篩選

9、, 已成為診斷和研究寄生蟲病的重要手段。 同期, 國際上對(duì)血吸蟲基因組的研究較多,也取得了較大的進(jìn)展。1998年 12月,完成了蠕蟲代表種秀麗線蟲的基因組測(cè)序,為世界最早完成 的真核多細(xì)胞生物基因組全序列測(cè)定。 為各種寄生蟲利用基因組測(cè)序的現(xiàn)代分類 學(xué)和物種鑒定創(chuàng)造了模式條件。在分子免疫學(xué)方面, Kohler(德國和 Milstein(英國在 1975年成功獲得單 克隆抗體(McAb后,現(xiàn)已報(bào)告的動(dòng)物用 McAb 已有數(shù)百種,幾乎包羅了流行嚴(yán)重 的動(dòng)物傳染病和寄生蟲病。 在世紀(jì)之交, 已研制成功了一批重要疫病快速而準(zhǔn)確 的 McAb 試劑盒,投入了臨床和檢測(cè)使用。為這些疫病的診斷方法和免疫預(yù)防

10、技 術(shù)展現(xiàn)了可期望的前景。意大利的 Ferrcio R,在細(xì)胞因子的研究中發(fā)現(xiàn)“熱休克蛋白(HSP”,經(jīng) 對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的研究, 發(fā)現(xiàn) HSP 在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答, 參與寄生蟲分化, 抵御寄生 蟲感染方面有明顯作用。國外已對(duì)錐蟲、利什曼原蟲、瘧原蟲、血吸蟲等重要寄 生蟲的 HSP 展開了研究。利用基因重組技術(shù), 已研制成功牛巴貝斯蟲苗和瘧原蟲苗, 現(xiàn)已發(fā)展到基因 核酸疫苗的研制。 目前, 已報(bào)道的人用和獸用寄生蟲核酸疫苗的實(shí)驗(yàn)室研究有瘧 原蟲、血吸蟲和利什曼原蟲等 3。2.22002年以來動(dòng)物寄生蟲分子生物學(xué)研究的新進(jìn)展從總體上看, 國內(nèi)外對(duì)動(dòng)物寄生蟲分子生物學(xué)的研究在近幾年又有了一些新 的進(jìn)展。

11、分子生物學(xué)研究的一些最新技術(shù)和最新方法開始在動(dòng)物寄生蟲上應(yīng)用, 使研究的范圍有所擴(kuò)大,研究的深度也有所加強(qiáng) 4-5。我國寄生蟲分子生物學(xué)研究對(duì)象和范圍有所擴(kuò)大, 在過去研究的基礎(chǔ)上對(duì)雞 球蟲的研究已擴(kuò)展到了幾乎所有種、 屬和其它動(dòng)物球蟲、 隱孢子蟲。 新增了對(duì)羊 泰勒蟲(TheileriaSP、中華泰勒蟲(T.sinensis、牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、 綿羊無漿體(Anaplasmaovis、 動(dòng)物附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon、 伊氏錐蟲和犬、 貓、牛、羊賈第蟲(Giardia等主要危害種原蟲的研究,增加了對(duì)土耳其斯坦東 畢吸蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、犬弓首蛔蟲、擬地新線蟲(P.decipi

12、ens、雞異刺線蟲、 豬蛔蟲、雞蛔蟲、犬鉤蟲、盲囊線蟲(C.rudolphii、毛首線蟲、犬惡絲蟲等寄 生蠕蟲的分子生物學(xué)研究。 其中, 對(duì)雞球蟲、 旋毛蟲的研究已達(dá)到和接近世界先 進(jìn)水平。建立了一些寄生蟲的 cDNA 文庫,開展了部分蟲種的分子生物學(xué)分類研究。 國內(nèi)一些學(xué)者采用 RNA 抽提、RT-PCR 擴(kuò)增和克隆,進(jìn)行 EnMc-2(Gd序列分析和 與 EtMlc-2(Ht序列比較; 或?qū)⑿蛄袦y(cè)定結(jié)果與登錄 GenBank 的基因進(jìn)行比對(duì)(SI值等方法,對(duì)國內(nèi)異源、異地的同種或同屬不同種的一些寄生性原蟲、蠕蟲進(jìn) 行了同源性差異鑒定, 解決了部分在分類學(xué)上有爭議蟲種的分類學(xué)定位問題, 在

13、原蟲方面表現(xiàn)較為突出。如廣東謝明權(quán)等對(duì)雞的毒害艾美耳球蟲(Eimeria necatrix廣東株、北京株,堆型艾美耳球蟲(E.acervulina北京株、廣東株的 序列比對(duì),證實(shí)為異地同源同種;陶建平等對(duì)來自國內(nèi)外不同地區(qū)的 11株巨型 艾美耳球蟲(E.maxima進(jìn)行 RAPD 分析,證實(shí)為同一種,但有蟲株間親源關(guān)系遠(yuǎn) 近差異; 安健等也對(duì)柔嫩艾美耳球蟲 4個(gè)不同蟲株進(jìn)行了 mRNA 的差異顯示測(cè)定, 證實(shí)有 2株同源, 有 2株為未知新序列。 張浩吉等將本地采集的牛附紅細(xì)胞體的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行鑒定測(cè)序, 結(jié)果與 GenBank 中登錄的溫氏附紅細(xì)胞體(E.wenyonii的同源性為 97

14、%;劉琴等用采自水牛的巴貝斯蟲進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后的 18s rRNA 片 段測(cè)序,結(jié)果與 GenBank 中登錄的 15種已知巴貝斯蟲均有差異,即定為新種東方巴貝斯蟲(Babesiaorientalis,修正了原定種為牛巴貝斯蟲的結(jié)論;羅 建勛等用同種方法對(duì)我國 8株黃牛的巴貝斯蟲進(jìn)行分類鑒定和比對(duì), 確定國內(nèi)巴 貝斯蟲為牛巴貝斯蟲、 雙芽巴貝斯蟲、 大巴貝斯蟲、 卵形巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未 定種共 5個(gè)種。翁亞彪等用 ITS 及 5.8S 序列分析,證實(shí)國內(nèi)弓形蟲 QH 綿羊株、 ZS 人株、SH 人株、CN 豬株的序列完全一致,與 GenBank 上登錄的 RH 株也一致, 均為同一蟲種。

15、 另外, 以分子生物學(xué)的多種方法鑒定, 顯示我國旋毛蟲為 2個(gè)蟲 種,即豬的 T.spiralis 和犬的 T.nativa,并確認(rèn)人的旋毛蟲病在南方和中原主 要由豬旋毛蟲種引起,東北主要由犬旋毛蟲種引起。同時(shí), 還完成和建立了 2種旋毛蟲、 部分艾美耳球蟲、 土耳其斯坦東畢吸蟲、 溫氏附紅細(xì)胞體、 豬囊尾蚴、 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、 牛巴貝斯各蟲種和水牛東方巴貝斯 蟲、綿羊無漿體、弓形蟲、羊巴貝斯蟲、羊泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、奶牛附紅細(xì)胞 體廣西株、賈第蟲、日本血吸蟲、肝片吸蟲、大片吸蟲、擬地新線蟲、雞異刺線 蟲、異尖線蟲、雞蛔蟲、豬蛔蟲、弓首蛔蟲、犬鉤蟲、豬毛首線蟲等蟲種的基因 測(cè)序;并在國內(nèi)建立了相

16、應(yīng)的 cDNA 文庫,為寄生蟲分子生物學(xué)研究創(chuàng)造和提供 了更好的基礎(chǔ)條件。擴(kuò)大了寄生蟲分子生物學(xué)診斷和檢測(cè)方法的應(yīng)用范圍, 特別在原蟲方面有所 突破。但因寄生原蟲的同屬異種較多,吸蟲、絳蟲、線蟲因蟲體較大,結(jié)構(gòu)和生 長發(fā)育過程復(fù)雜等原因。 應(yīng)用分子生物學(xué)的一般方法進(jìn)行大多數(shù)寄生蟲病的診斷 和檢測(cè),尚存在準(zhǔn)確性、特異性較差,交叉反應(yīng)不易排除的問題;應(yīng)用高層次分 子生物學(xué)技術(shù),又存在成本過高、操作復(fù)雜、不易推廣等困難。2.3動(dòng)物寄生蟲基因工程疫苗的研究進(jìn)展利用現(xiàn)代免疫學(xué)、 生物化學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法, 進(jìn)行動(dòng)物寄生蟲疫 苗的研究,近幾年也取得了一系列可喜的進(jìn)展 5。目前,囊尾蚴及棘球蚴基因重

17、組疫苗的研制已基本成功。棘球蚴苗 EG95可 誘導(dǎo)牛產(chǎn)生 96%100%的保護(hù)率;羊帶絳蟲 45W-GST 融合蛋白重組蟲苗,可誘導(dǎo) 羊產(chǎn)生 92%以上的保護(hù)率,對(duì)牛無鉤絳蟲也有較高保護(hù)率,該苗即將進(jìn)入市場(chǎng)。 類似的豬囊尾蚴基因重組苗,減蟲率和完全保護(hù)率已分別達(dá)到 99.2%和 55.5%。 豬囊尾蚴細(xì)胞苗的研究也已獲得成功,使工廠化規(guī)模化生產(chǎn)成為可能。吸蟲疫苗研究較多的是日本血吸蟲和肝片吸蟲, 周金春等(2001用重組的副 肌球蛋白(RSJ97免疫水牛,3次免疫后腹部貼片感染日本血吸蟲尾蚴,結(jié)果免 疫組減蟲率為 49.9%, 肝臟減卵率為 57.3%。 另外, 發(fā)現(xiàn) GST、 FABP、膜蛋

18、白(Sjc 23、卵黃鐵蛋(Ferl等也是血吸蟲疫苗的重要候選抗原;GST 還具有交叉反應(yīng) 抗原決定簇, 對(duì)多種血吸蟲都具有抗性, 使研制廣譜抗血吸蟲疫苗成為可能。 肝 片吸蟲的 GST 重組抗原,可使綿羊感染減少 48%、牛減少 50%。總體看,有效的 吸蟲基因重組苗在短期內(nèi)尚難出現(xiàn)。血矛線蟲、食道口線蟲、仰口線蟲是主要危害牛、羊的一大類線蟲,但抗消 化道線蟲疫苗的研制至今無大的突破。目前,最有效的是用具有氨酞酶 A 或 M 活性的 110ku 的整合膜蛋白(H11制作的疫苗,試驗(yàn)效果非常好,在持續(xù) 23周人工感染下, 可使羔羊達(dá)到 90%以上保護(hù)率, 但因抗原分子表位含有復(fù)合糖成分, 難以在