實(shí)驗(yàn)方案采用篇

1、良膚乳膏各成分的透皮特性研究1、 良膚乳膏各成分的理化性質(zhì)研究:溶解性能，分配性能，解離性能（已完成）2、 良膚乳膏中各成分的檢測(cè)方法的建立1、良膚乳膏中個(gè)單一成分的HPLC條件的建立：丹皮酚 色譜條件為甲醇：水（45:55），十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑，C18柱，流速為1ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)為244nm(藥典條件)。對(duì)照品的制備：稱取適量的丹皮酚對(duì)照品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成20g/ml的對(duì)照品溶液。供試品的制備：取丹皮酚提取物適量于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成一定濃度的供試品溶液。梣酮，以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑，以甲醇：水（60:40）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為236n

2、m，理論塔板數(shù)按梣酮峰計(jì)算不得低于3000；對(duì)照品的制備：稱取適量的梣酮對(duì)照品于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成60g/ml的溶液即得。供試品的制備：取白鮮皮提取物適量于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成一定濃度的供試品溶液白鮮堿：以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑，以甲醇：水（52:48）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，柱溫30對(duì)照品的制備：精密稱取白鮮堿對(duì)照品適量于50ml容量瓶中，加甲醇制成供試品的制備：取白鮮皮提取物適量于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成一定濃度的供試品溶液甘草次酸：以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑，流動(dòng)相為乙腈：0.05%磷酸水梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)234nm，理論塔板數(shù)按

3、照對(duì)照品的制備：精密稱取甘草次酸對(duì)照品適量于50ml容量瓶中，加甲醇溶解制成供試品的制備：取甘草提取物適量于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，制成一定濃度的供試品溶液 在經(jīng)過良膚乳膏各成分的透皮特性實(shí)驗(yàn)后，將會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將良膚乳膏的各成分作拆方組合處理，采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法，對(duì)組合后的方案進(jìn)行方法學(xué)考察以及相互影響的驗(yàn)證試驗(yàn)。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別配制五個(gè)不同濃度的丹皮酚（梣酮，白鮮堿，甘草次酸）的對(duì)照品溶液，進(jìn)行液相分析，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3、線性范圍的考察： 精密配制一系列濃度的丹皮酚、白鮮堿、梣酮及甘草次酸對(duì)照品溶液，按色譜條件進(jìn)樣分析，將各對(duì)照品溶液的濃度C與峰面積A進(jìn)行線性擬

4、合，4、方法回收率 精密吸取6份已知含量的丹皮酚、白鮮堿、梣酮、甘草次酸供試品1ml，分別精密加入一定量的丹皮酚、白鮮堿、梣酮、甘草次酸對(duì)照品，按供試品溶液的制備及上述色譜條件操作，計(jì)算回收率。 回收率%=（C-A）/B100% 式中 A為供試品所含被測(cè)成分量； B為加入對(duì)照品量； C為實(shí)測(cè)值。5、精密度試驗(yàn)： 粗密吸取丹皮酚、梣酮、白鮮堿、甘草次酸對(duì)照品溶液20l，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定丹皮酚、梣酮、白鮮堿、甘草次酸的峰面積，計(jì)算RSD（精密度系指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。三、透皮實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚

5、的選擇（豬皮，有毛大小鼠皮膚，裸鼠皮膚，蛇皮，尸皮，病變皮膚,人造皮膚，人工膜）1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚的制備: 小鼠，用眼科剪剪去腹部的毛，脫頸椎處死，取腹皮，置于玻璃平板上，除去粘連物與脂肪組織，用雙蒸水洗凈，浸泡在生理鹽水中，置于4度冰箱中保存?zhèn)溆?。大鼠：脫頸椎處死，用眼科剪將腹部的毛剪短，用自制的脫毛劑涂抹于短毛處，待一段時(shí)間后，用溫水將脫毛膏洗去，用干紗布或棉花將皮膚擦凈，取腹部皮膚，置于玻璃平板上取出皮下脂肪組織與粘連物，用雙蒸水洗凈，置于生理鹽水中，于4度冰箱中冷藏備用。豬皮：將市售的豬皮用雙蒸水洗凈，用拔毛法將皮膚表面的豬毛除去，將皮下脂肪層與粘連物去除，置于生理鹽水中，放置在4度冰

6、箱中保存?zhèn)溆?。蛇皮：洗凈，置于生理鹽水4度環(huán)境下備用。1.2實(shí)驗(yàn)皮膚的完整性考察 應(yīng)用光鏡對(duì)皮膚進(jìn)行觀察，看其皮膚表面是否有破損。（方法一）用一種已知透皮速率的藥物，對(duì)皮膚的完整性進(jìn)行檢查試驗(yàn)。（方法二）是否還有更好的完整性考察1.3透皮比較實(shí)驗(yàn) 將處理好的各種完整的無破損的皮膚取出，角質(zhì)層面向供給池，真皮層面向接收池，將皮膚夾緊在Franz擴(kuò)散池，在供給池中加入1ml的丹皮酚溶液作為供給液，接收此中則加入5ml40%的乙醇生理鹽水作為接收液，在Franze擴(kuò)散池進(jìn)行試驗(yàn)，以透皮速率，皮膚滯留量，累計(jì)滲透量，時(shí)滯，滲透速率作為指標(biāo)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)所選皮膚的相似程度進(jìn)行比較選擇。2、透皮

7、實(shí)驗(yàn)各參數(shù)的選擇 篩選出與人體皮膚最為相似的皮膚模型之后，則要對(duì)透皮實(shí)驗(yàn)時(shí)所涉及到的一些試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行考察選擇：2、1擴(kuò)散池轉(zhuǎn)速的確定：預(yù)選定四個(gè)轉(zhuǎn)速進(jìn)行試驗(yàn)，100轉(zhuǎn)，120轉(zhuǎn)，200轉(zhuǎn)，,300轉(zhuǎn)分別在透皮兩小時(shí)后取點(diǎn)，分別取擴(kuò)散池上方，中部，底部三個(gè)位置的點(diǎn)，做液相分析，選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速。（轉(zhuǎn)速的選擇依據(jù)）2、2供給液的配制：經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，丹皮酚在外用制劑方面的濃度范圍較廣，故選擇在其區(qū)間的100300g/ml，梣酮450600g/ml，甘草次酸，白鮮堿，苦參堿濃度配制，同時(shí)按照良膚乳膏中的藥物配比進(jìn)行各成分的供給液配制。并制備丹皮酚的飽和溶液作為供試濃度之一。2、3接收液的選擇：據(jù)文獻(xiàn)報(bào)

8、道，丹皮酚在水中的溶解度在350g/ml左右，屬于略溶物，但是在體外試驗(yàn)中，要在接收池中模擬人體內(nèi)，藥物通過皮膚后會(huì)迅速被血管運(yùn)送到全身的一種“漏槽”模型，故選擇雙蒸水作為透皮接收液不合適，很容易在實(shí)驗(yàn)過程中導(dǎo)致接收此種藥物濃度過高或者飽和的現(xiàn)象，影響藥物的透過，故選擇，生理鹽水組，20%PEG400生理鹽水，40%PEG400生理鹽水，30%乙醇生理鹽水，40%乙醇生理鹽水，pH6.8磷酸鹽緩沖液，pH4.4磷酸鹽緩沖液作為比較的接收液種類以主藥溶解性能篩選體外經(jīng)皮滲透試驗(yàn)中的接收液2、4各成分的皮膚/生理鹽水分配系數(shù)的測(cè)定 精密稱取50mg的干燥皮膚樣品，取一定量的丹皮酚，梣酮、白鮮堿、甘

9、草次酸生理鹽水溶液一起加入安瓿瓶中，密封，于(32士l)恒溫水浴攪拌24該測(cè)定方法是否被公認(rèn)，是否有可信度。h后，取樣，用0.45微孔濾膜保溫過濾，進(jìn)樣20l，按照分析方法測(cè)定藥物的濃度。 各成分在皮膚/生理鹽水系統(tǒng)中的分配系數(shù)以兩相中藥物重量濃度的比來表示，其中生理鹽水的密度按1.0g/ml計(jì)算。計(jì)算公式見下式：?jiǎn)挝恢亓可睇}水中藥物的量單位重量皮膚中藥物的量3、皮膚各層的獲得： 角質(zhì)層的獲得：角質(zhì)層的獲得方法（膠帶法在采樣時(shí)間點(diǎn)取接收液一定體積，測(cè)定在取樣點(diǎn)時(shí)接收液中的藥物含量，同時(shí)在各取樣后，將皮膚取下，用雙蒸水將皮膚表面的藥物洗凈，并用濾紙將水吸干，下來用膠帶在皮膚表面，反復(fù)粘扯20次

10、，讓后將膠帶剪碎置于離心管中，在離心管中加入5ml甲醇，超聲震蕩10min，放置過夜，再超聲振蕩10min，將膠帶取出，加入甲醇至5ml，將離心管放置于離心機(jī)中離心（5000r/min，離心20min）處理。酶解法，將去除真皮的皮膚置于37度蛋白酶溶液（0.0001%朊胰酶及0.5%碳酸鈉）中處理24h即可，可使活性表皮的活細(xì)胞，獲得角質(zhì)層。表皮的獲得：對(duì)于大鼠，豬的皮膚而言，可以通過熱處理的方法，將皮膚的表皮獲得，具體方法如下：將獲得的皮膚，洗凈，置于65度的熱水中45秒2min，將皮膚取出，用兩塊玻片將皮膚夾住，皮膚上的殘余脂質(zhì)粘連物會(huì)將皮膚粘在下層的玻片上，用手輕輕移動(dòng)上層的玻片，可以將

11、表皮取下，保存方式與全皮的保存方式一致。去除表皮后，剩余的就是真皮部分。去脂角質(zhì)層的獲得：通常采用酶解法和有機(jī)溶劑法（取干燥的角質(zhì)層，浸沒于氯仿一甲醇2:1(v加)溶液中，浸泡24h后取出，揮干有機(jī)溶劑，并真空干燥5h，以除去殘留溶劑。置于干燥器中保存，備用）。4、良膚乳膏中單一成分的體外透皮實(shí)驗(yàn)：4、1丹皮酚的體外透皮特性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前期準(zhǔn)備：準(zhǔn)備丹皮酚，白鮮堿，梣酮，甘草次酸的供給液，接收液丹皮酚的全皮透過實(shí)驗(yàn)： 選取選定的實(shí)驗(yàn)皮膚，用螺旋測(cè)微尺測(cè)量皮膚的厚度選取一個(gè)濃度的丹皮酚溶液作為供結(jié)液，平行六份，將所選皮膚全皮置于兩個(gè)小室之間，夾緊，角質(zhì)層面向供給池，真皮層面向接收池，在供給池里加入1

12、ml的供給液，在接收池中加入5ml供給液，將全套裝置置于Franz擴(kuò)散池中，溫度為（32度+0.5度），轉(zhuǎn)速為所選轉(zhuǎn)速，采樣點(diǎn)為所選取采樣點(diǎn)，在每次采樣時(shí)，用移液槍精密移取0.8ml，保證無氣泡產(chǎn)生，同時(shí)向接收池中加入0.8ml的空白接收液，將移取的接收液置于1.5ml的ep管中，用注射劑吸取，過0.45微米的有機(jī)濾頭，進(jìn)行色譜分析。待各點(diǎn)取樣結(jié)束后，將皮膚取下，用雙蒸水洗凈表面的藥物，用剪刀剪下擴(kuò)散小室大小的皮膚，并將其剪碎。置于5ml尖頭玻璃管中，加入3ml甲醇，超聲處理30min，再用甲醇補(bǔ)足刻度，繼續(xù)超聲處理30min，將液體導(dǎo)入離心管中，5000r/min處理10min，取上層液過0

13、.45微米有機(jī)濾頭，進(jìn)液相分析。相關(guān)數(shù)學(xué)計(jì)算公式：滲透速率的計(jì)算式中，p、D、分別為藥物的滲透系數(shù)、藥物在皮膚和介質(zhì)中的分配系數(shù)、藥物在皮膚內(nèi)的擴(kuò)散系數(shù)、藥物在介質(zhì)中的溶解度以及皮膚厚度。可見，對(duì)于特定的藥物，其滲透速率由、D、決定，與藥物、介質(zhì)、皮膚三者的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等有關(guān)。累計(jì)滲透量的計(jì)算公式為有效擴(kuò)散面積，為接受液總體積，為第n次取樣時(shí)接受液中藥物的質(zhì)量濃度，為第i次取樣時(shí)接受液中藥物的質(zhì)量濃度，為取樣體積。以藥物的累積透過量（g/cm2）對(duì)取樣時(shí)間t作曲線，并對(duì)曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，求出的直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率（g/(cm2h)），直線與x軸的交點(diǎn)為時(shí)滯tlag（h），根據(jù)

14、下式計(jì)算滲透系數(shù)（cm/s）、增滲比ER。 藥物的皮膚滯留量Qs（g/cm2）可由下式計(jì)算： 其中，A為有效擴(kuò)散面積，V為皮膚提取液總體積，C為皮膚提取液中藥物的濃度。在進(jìn)行單一成分的透皮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理時(shí)，應(yīng)用的是一次線性方程，對(duì)于復(fù)方而言，是否一次線性方程仍可以使用就不得而知了，則需要考察。注：每次試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將皮膚取下，洗凈，置于顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)的形態(tài)，拍照留底。然后再將皮膚做滯留量的實(shí)驗(yàn)處理。丹皮酚的皮膚各層透皮特性實(shí)驗(yàn) 試驗(yàn)方法同4.1.1，皮膚換作各層皮膚丹皮酚在表皮的透皮特性實(shí)驗(yàn)丹皮酚在角質(zhì)層的透皮特性實(shí)驗(yàn)丹皮酚在脫脂角質(zhì)層的透皮特性實(shí)驗(yàn)丹皮酚在真皮層的透皮特性實(shí)驗(yàn)4.2白鮮堿的體外透皮特性實(shí)驗(yàn)白鮮堿的全皮透過實(shí)驗(yàn)白鮮堿的皮膚各層透皮特性實(shí)驗(yàn)白鮮堿在表皮的透皮特性實(shí)驗(yàn)白鮮堿在角質(zhì)層的透皮特性實(shí)驗(yàn)白鮮堿在脫脂角質(zhì)層的透皮特性實(shí)驗(yàn)白鮮堿在真皮層的透皮特性實(shí)驗(yàn)4.3梣酮的體外透皮特性實(shí)驗(yàn)梣酮的全皮透過實(shí)驗(yàn)梣酮的皮膚各層透皮特性實(shí)驗(yàn)梣酮在表皮的透皮特性實(shí)驗(yàn)梣酮在角質(zhì)層的透皮特性實(shí)驗(yàn)梣酮在脫脂角質(zhì)層的透皮特性實(shí)驗(yàn)梣酮在真皮層的透皮特性實(shí)驗(yàn)4.4甘草次酸的體外透皮特性實(shí)驗(yàn)甘草次酸的全皮透過實(shí)驗(yàn)甘草次酸的皮膚各層透皮特性實(shí)驗(yàn)甘草次酸在表皮的透皮特性實(shí)驗(yàn)甘草次酸在角質(zhì)層的透皮特性實(shí)驗(yàn)甘草次酸在脫脂角質(zhì)層的透皮特性實(shí)驗(yàn)甘草次酸在真皮層的透皮特性實(shí)驗(yàn)4、5良膚乳膏