實用pcr流程表

1、臨床PCR檢驗流程記錄表 檢驗日期： 檢驗項目： HBV-DNA 擴增儀中保存文件名 使用說明：嚴格按單一流向進行實驗，即試劑準備區(qū)標本制備區(qū)擴增區(qū)，嚴禁逆向移動。本記錄表的流向亦遵循此流程；各項工作執(zhí)行后在相應項目前的方框內打“”；本記錄表最后歸檔保存在PCR實驗室擴增區(qū)的專用文件夾中，以備查找。實驗前準備試劑在有效期內 擴增儀、加樣器、金屬浴、溫濕度計等儀器在校準有效期內（校準之日起1年） 生物安全柜的濾膜在使用有效期內 離心管、帶濾芯吸頭已經過質檢合格 各區(qū)按消毒液配制SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液和70%酒精，即用即配。 打開通風設備操作者 試劑準備區(qū)實

2、驗前：更換專用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 實驗臺面清潔（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 冰箱溫度：冷藏室（28） ； 冷凍室（-20±2） 實驗室溫度 （允許范圍：1530）；相對濕度： （允許范圍：30%70%）PCR試劑來源： 試劑廠家：口 深圳匹基生物工程有限公司 批號： 檢驗項目： HBV-DNA 本次實驗用量： 人份； 剩余量： 人份其他有關試劑配制： 儀器設備使用：離心機：正常 不正常 ； 振蕩器：正常 不正常； 生物安全柜： 口 正常 口 不正常實驗后： 按實驗室清潔消毒SOP清潔實驗室臺面、地面、加樣器和離心機，并進行紫外線照射30分鐘以上。 按實驗室

3、廢棄物處理SOP處理實驗廢棄物。 操作者 檢驗日期： 檢驗項目： HBV-DNA 樣本處理區(qū)實驗前：更換專用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 實驗臺面清潔（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 冰箱溫度：冷藏室（28） ； 冷凍室（-20±2） 實驗室溫度 （允許范圍：1530）；相對濕度： （允許范圍：30%70%）HBV-DNA陽性室內質控物來源： 濃度及批號： 擴增位置：HBV-DNA陰性室內質控物來源： 批號： 擴增位置：所處理的HBV-DNA標本（對應標本接收的唯一編號）及擬擴增位置：1917253341495765738189210182634425058667482

4、90311192735435159677583914122028364452606876849251321293745536169778593614223038465462707886947152331394755637179879581624324048566472808896核酸提取及加樣過程：按乙型肝炎病毒DNA熒光定量PCR操作程序SOP進行。 儀器設備使用： 生物安全柜： 正常 不正常； 恒溫金屬?。?；離心機： 正常 不正常； 振蕩器： 正常 不正常； 低溫離心機：制冷：正常 不正常； 離心：正常 不正常 實驗后： 按實驗室清潔消毒SOP清潔實驗室臺面、地面、加樣器和離心機，并進行

5、紫外線照射30分鐘以上。 按實驗室廢棄物處理SOP處理實驗廢棄物。 口 使用后標本冷凍保存3個月，以備復查。 操作者 檢驗日期： 檢驗項目： HBV-DNA 擴增及產物分析區(qū)實驗前：更換專用工作服、戴口罩、帽子、鞋套 實驗臺面清潔（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭） 實驗室溫度 （允許范圍：1530）；相對濕度： （允許范圍：30%70%）LightCycler擴增儀操作：開機自檢及運行正常； 按LightCycler操作使用SOP進行編程、參數(shù)設定HBV-DNA 標準曲線計算值：Slope 值： Intercept值： r2值： 室內質控結果：陰性質控物結果： ；陽性質控物結果：

6、 口填寫室內質控記錄、質控圖； 是否失控：口否 口是室內質控結果：陰性質控物結果： ；陽性質控物結果： 口填寫室內質控記錄、質控圖； 是否失控：口否 口是失控原因及分析：（失控判斷標準及原因分析按室內質控SOP進行）實驗結果：見所附擴增儀打印結果實驗結果有效性判斷：有效 無效（依據(jù)實驗結果有效性判斷SOP進行）實驗后： 按實驗室清潔消毒SOP清潔實驗室臺面、地面、加樣器和離心機，并進行紫外線照射30分鐘以上。 按實驗室廢棄物處理SOP處理實驗廢棄物。 操作者 1. 操作步驟：1.2.1 取n個1.5ml的滅菌離心管，作好標記。（n=樣本數(shù)+1管HCV陰性對照+1管HCV強陽性對照+1管HCV臨

7、界陽性對照）1.2.2 向上述離心管中分別加入25ul蛋白酶溶液。1.2.3 分別加入待測樣本、HCV陰性對照、HCV臨界陽性對照和HCV強陽性對照各200ul.1.2.4 加入200ul新鮮配制的裂解液工作液，蓋上蓋子，振蕩15秒，充分混勻。（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。1.2.5 56攝氏度溫浴15分鐘。瞬時離心，以去除管蓋上的滴液。1.2.6 加入250ul無水乙醇，蓋上蓋子，徹底混勻（振蕩15秒）。在室溫下靜置5分鐘（15-25攝氏度）。注意：如果環(huán)境溫度超過25攝氏度，無水乙醇需預冷。瞬時離心，以去除管蓋上的滴液。1.2.7 將n個核酸提取柱放入收集管中，小心地將

8、步驟中的液體移入核酸提取柱中。蓋上蓋子，6000*g離心1分鐘。倒掉收集管中的廢液，將提取柱重新放入收集管中。（如果離心后核酸提取柱中仍有部分液體，以更高的速度再次離心，確保提取柱中無殘余的液體）1.2.8 小心的打開核酸提取柱的蓋子，加入500ul洗液1，蓋上蓋子，6000*g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將提取柱重新放入收集管中。1.2.9 小心的打開核酸提取柱的蓋子，加入500ul洗液2，蓋上蓋子，6000*g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將提取柱重新放入收集管中。1.2.10 小心的打開核酸提取柱的蓋子，加入500ul無水乙醇，蓋上蓋子，6000*g離心1分鐘，丟棄收集管，將提取柱

9、放入新的收集管中。1.2.11 20000*g高速離心3分鐘，徹底去除乙醇。1.2.12 丟棄收集管，將核酸提取柱放入干凈的1.5ml離心管中，打開提取柱的蓋子， 56攝氏度溫浴3分鐘，以徹底去除殘余的液體。1.213 將核酸提取柱放入另一干凈的1.5ml離心管中，小心打開提取柱的蓋子，加入60ul洗脫液（請將洗脫液加到膜的中央），蓋上蓋子，室溫靜置5分鐘。20000*g高速離心1分鐘收集濾出液，做好標記，4攝氏度保存?zhèn)溆?。提取的病毒核酸應?小時內用于PCR擴增，或在-70攝氏度下可以保存一個月。2. 擴增試劑準備（PCR前準備區(qū)） 從試劑盒中取出HCV RT-PCR反應液、Enzyme M

10、ix , 在室溫下融化后，2000*g離心5秒。設所需要的PCR反應管數(shù)（玻璃毛細管）為n（n=樣本數(shù)+1管空白對照+1管HCV陰性對照+1管HCV強陽性對照+1管HCV臨界陽性對照+4管HCV定量標準品），每個測試反應體系配制如下表： 試劑 HCV RT-PCR反應液 Enzyme Mix 用量 n*13ul n*2ul 計算好各試劑的使用量，加入到一適當體積試管中，充分混勻均勻后2000*g離心10秒，向各玻璃毛細管中分裝15ul，轉移至樣本處理區(qū)。3. 加樣（樣本處理區(qū)）吸取10ul樣本處理步驟中收集得到的RNA溶液及HCV定量標準品分別加入到上述反應管中（空白對照直接加入10ul洗脫液

11、），蓋緊反應管管蓋，連同Roche專用金屬反應管套放在離心機中，于2000*g離心10秒，將毛細管轉移到檢測區(qū)。將毛細管排放好放入熒光PCR檢測儀內，記錄樣本擺放順序。4. RT-PCR反應（檢測區(qū)）4.1 循環(huán)條件設置ProgramCyclesTemperature攝氏度Incubation Time(min:sec)TemperatureTransitionRate( 攝氏度/sec)AcquisitionModeAnalysisMode1 1 50 30:00 20 NoneNone2 1 95 15:00 20 NoneNone3 45 95 00:05 20 NoneQuantifi

12、cation 50 00:30 20 Single 72 00:20 10None反應體系為25ul.具體設置方法請參照各儀器使用說明書。4.2 儀器檢測通道選擇選擇F1檢測通道：HCV內對照（IC）選擇F2檢測通道。4.3 樣本的設定在擴增開始前條件設定時，將HCV定量標準品設為“Standard”并輸入試劑盒內給定濃度值，待檢樣本和對照品設定為“Unknown”。結果分析條件設定1. 對HCV的曲線和HCV內對照（IC）的曲線進行分別分析。2. 分析方式選擇Fit Points，基線調整選擇Arithmetic,閾值（threshold）設定原則以閾值線剛好超過正常HCV陰性對照曲線的最高

13、點，且正常HCV陰性對照病毒滴度為0.0IU/ml為準。具體設置方法請參照各儀器使用說明書。質控標準1. 將HCV定量標準品1-4的濃度值輸入，儀器將自動以HCV定量標準品的濃度值為橫坐標，以其實際測得的外標Ct值為縱坐標給出標準曲線，標準曲線的擬和度絕對值應大于等于0.980，四個HCV定量標準品的Ct值都應<38.0，否則視為定量結果無效。2. HCV陰性對照、空白對照HCV RNA應為0.0IU/ml；HCV強陽性對照HCV RNA應為5.0E+05-1.0E+07IU/ml；HCV臨界陽性對照應為1.0E+03-1.0E+05 IU/ml；且HCV陰性對照、HCV臨界陽性對照中HCV內對照（IC）的Ct值都應小于等于33，否則此次實驗視為無效。所有實驗從樣本處理開始重做。結果判斷1. 檢測樣本中1.0E+03 IU/ml小于等于HCV RNA小于等于5.0E+07 IU/ml，測定結果有效，可直接報告相應的濃度值。2. 檢測樣本中HCV RNA大于5.0E+07 IU/ml，可按實際測得值報告相應的病毒滴度，亦可將該樣本用正常人血漿按10倍梯度稀釋到本試劑盒定量檢測線性范圍內后重新測定，測定結果應以稀釋倍數(shù)進行校正。3. 檢測樣本中0.0IU/ml小于HCV RNA小于1.0E+03 IU/ml，且HCV內對照（IC）的Ct值