生物化學(xué)0氨基酸與蛋白質(zhì)

1、.o 結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白的折疊單位結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白的折疊單位 較小的蛋白質(zhì)分子或亞基往往是單結(jié)構(gòu)域的。較小的蛋白質(zhì)分子或亞基往往是單結(jié)構(gòu)域的。 結(jié)構(gòu)域一般有氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)域一般有氨基酸殘基。 結(jié)構(gòu)域之間常常有一段柔性的肽段相連，形成所謂的鉸鏈區(qū)，結(jié)構(gòu)域之間常常有一段柔性的肽段相連，形成所謂的鉸鏈區(qū)，使結(jié)構(gòu)域之間可以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)。使結(jié)構(gòu)域之間可以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)。 結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能，幾個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，可體結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能，幾個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，可體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能。現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能。 例：例：脫氫酶類的多肽主鏈有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是起催化作用的結(jié)構(gòu)

2、域，兩者組合成脫氫酶的脫氫功能區(qū)。 結(jié)構(gòu)域間的裂縫，常是酶的活性部位，也是反應(yīng)物的出入口結(jié)構(gòu)域間的裂縫，常是酶的活性部位，也是反應(yīng)物的出入口.整個(gè)多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)整個(gè)多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上盤旋、折疊，形成的特定的整個(gè)空域的基礎(chǔ)上盤旋、折疊，形成的特定的整個(gè)空間結(jié)構(gòu)。間結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈中所有原子的空間排布。三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈中所有原子的空間排布。. 大的球形蛋白大的球形蛋白(200(200氨基酸以上氨基酸以上) )，常常含有幾個(gè)，常常含有幾個(gè)結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域。 許多在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相差很遠(yuǎn)的氨基酸堿基在許多在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相差很遠(yuǎn)的氨基酸堿基在三級(jí)結(jié)構(gòu)上相距很近

3、。三級(jí)結(jié)構(gòu)上相距很近。 球形蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)很密實(shí)，大部分的水分子球形蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)很密實(shí)，大部分的水分子從球形蛋白的核心中被排出，這使得極性基團(tuán)間從球形蛋白的核心中被排出，這使得極性基團(tuán)間以及非極性基團(tuán)間的相互用成為可能。以及非極性基團(tuán)間的相互用成為可能。.主要的是二硫鍵，二硫鍵不指導(dǎo)多肽鏈的折疊，三級(jí)結(jié)構(gòu)形成后，二硫鍵可穩(wěn)定此構(gòu)象。氫鍵氫鍵范德華力范德華力分子間及基團(tuán)間作用力分子間及基團(tuán)間作用力定向效應(yīng)： 極性基團(tuán)間誘導(dǎo)效應(yīng)： 極性與非極性基團(tuán)間分散效應(yīng)： 非極性基團(tuán)間疏水相互作用疏水相互作用離子鍵離子鍵鹽鍵鹽鍵共價(jià)健共價(jià)健.5、表面常常有空穴，配體結(jié)合部位（活性中心）1、含有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)

4、元件2、具有明顯的折疊層次3、分子呈現(xiàn)球狀或橢球狀4、疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在外表. 有些對(duì)稱的寡聚蛋白是由兩個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱的等同有些對(duì)稱的寡聚蛋白是由兩個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱的等同結(jié)構(gòu)成分組成，這種等同的結(jié)構(gòu)成分稱為結(jié)構(gòu)成分組成，這種等同的結(jié)構(gòu)成分稱為。 如血紅蛋白如血紅蛋白2222就是由兩個(gè)原體就是由兩個(gè)原體組成。組成。有時(shí)也把原體稱為單體。有時(shí)也把原體稱為單體。 四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中每一個(gè)球狀蛋白質(zhì)稱為四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中每一個(gè)球狀蛋白質(zhì)稱為（或（或），亞基一般由一條多肽鏈組成。），亞基一般由一條多肽鏈組成。只有一個(gè)亞基的蛋白質(zhì)稱為只有一個(gè)亞基的蛋白質(zhì)稱為。.亞基間相互作用的表面是不同

5、的，形成亞基間相互作用的表面是不同的，形成線形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒線形或螺旋形的高聚物，如微管，病毒外殼。外殼。1、同多聚與雜多聚、同多聚與雜多聚（homomultimeric and heteromultimeric)2、同種締合與異種締合（、同種締合與異種締合（isologus and heterologus)亞基間相互作用的表面是相同的，形成的亞基間相互作用的表面是相同的，形成的結(jié)構(gòu)是對(duì)稱的。結(jié)構(gòu)是對(duì)稱的。.1 1、降低比表面積，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、降低比表面積，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性2 2、豐富蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，以行使更復(fù)雜的功能。、豐富蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，以行使更復(fù)雜的功能。3 3、提高

6、基因編碼的效率和經(jīng)濟(jì)性。、提高基因編碼的效率和經(jīng)濟(jì)性。4 4、使酶的催化基團(tuán)匯集，提高催化效率。、使酶的催化基團(tuán)匯集，提高催化效率。5 5、形成一定的幾何形狀，如細(xì)菌鞭毛。、形成一定的幾何形狀，如細(xì)菌鞭毛。6 6、適當(dāng)降低溶液滲透壓。、適當(dāng)降低溶液滲透壓。7 7、具協(xié)同效應(yīng)和別構(gòu)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性的調(diào)節(jié)、具協(xié)同效應(yīng)和別構(gòu)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性的調(diào)節(jié).別構(gòu)蛋白的別構(gòu)部位與效應(yīng)物的結(jié)合改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而對(duì)活性部位產(chǎn)生的影響。 除了有活性部位（結(jié)合底物）外，還有別構(gòu)部位（結(jié)合調(diào)節(jié)物）。有時(shí)活性部位和別構(gòu)部位分屬不同的亞基（活性亞基和調(diào)節(jié)亞基），活性部位之間以及活性部位和調(diào)節(jié)部位之間通過蛋白質(zhì)構(gòu)象的

7、變化而相互作用。.就是別構(gòu)效應(yīng)，別構(gòu)部就是別構(gòu)效應(yīng)，別構(gòu)部位與效應(yīng)物的結(jié)合對(duì)活位與效應(yīng)物的結(jié)合對(duì)活性部位的影響性部位的影響 同位效應(yīng)一般是指活性部位之間的效應(yīng)。同位效應(yīng)一般是指活性部位之間的效應(yīng)。同位效應(yīng)是別構(gòu)效應(yīng)的基礎(chǔ)，別構(gòu)效應(yīng)同位效應(yīng)是別構(gòu)效應(yīng)的基礎(chǔ)，別構(gòu)效應(yīng)可以看成是對(duì)同位效應(yīng)的一種修飾可以看成是對(duì)同位效應(yīng)的一種修飾.一種配基的結(jié)合促進(jìn)后續(xù)配一種配基的結(jié)合促進(jìn)后續(xù)配基的結(jié)合，基的結(jié)合，S S型配體結(jié)合曲線。型配體結(jié)合曲線。一種配基的結(jié)合抑制促進(jìn)后續(xù)一種配基的結(jié)合抑制促進(jìn)后續(xù)配基的結(jié)合。配基的結(jié)合。促進(jìn)活性部位與配基結(jié)合的別促進(jìn)活性部位與配基結(jié)合的別構(gòu)效應(yīng)物。構(gòu)效應(yīng)物。抑制活性部位與配基結(jié)

8、合的別抑制活性部位與配基結(jié)合的別構(gòu)效應(yīng)物。構(gòu)效應(yīng)物。.8段直的段直的-螺旋組成，分別命名為螺旋組成，分別命名為A、B、CH，拐彎處是由拐彎處是由18個(gè)氨基酸組成的松散肽段（無規(guī)卷曲）。個(gè)氨基酸組成的松散肽段（無規(guī)卷曲）。4個(gè)個(gè)Pro殘基各自處在一個(gè)拐彎處，另外殘基各自處在一個(gè)拐彎處，另外4個(gè)是個(gè)是Ser、Thr、Asn、Ile。 血紅素輔基血紅素輔基 ，扁平狀，結(jié)合在肌紅蛋白表面的一個(gè)洞穴內(nèi)。，扁平狀，結(jié)合在肌紅蛋白表面的一個(gè)洞穴內(nèi)。是哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)氧的蛋白質(zhì)。是哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)氧的蛋白質(zhì)。由一條多肽鏈（珠蛋白）和一個(gè)血紅素輔基組成。由一條多肽鏈（珠蛋白）和一個(gè)血紅素輔基組成。球狀分子，單結(jié)

9、構(gòu)域。球狀分子，單結(jié)構(gòu)域。.His93His64.p255.在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)O2.接近于球體，接近于球體，4 4個(gè)亞基分別在四面體的四個(gè)角上，個(gè)亞基分別在四面體的四個(gè)角上，每個(gè)亞基上有一個(gè)血紅素輔基。每個(gè)亞基上有一個(gè)血紅素輔基。 、 鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的很相似。鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的很相似。成人：成人： HbAHbA： 2 2 2 2 98% 98% ， HbAHbA2 2： 2 2 2 2 2% 2% 胎兒：胎兒： HbF HbF 2 2 2 2早期胚胎：早期胚胎： 2 2 2 2.增加增加COCO2 2的濃度、降低的濃度、降低pHpH能顯能顯著提高血紅蛋白亞基間的協(xié)同著提高血紅蛋白

10、亞基間的協(xié)同效應(yīng)，降低血紅蛋白對(duì)效應(yīng)，降低血紅蛋白對(duì)O O2 2的親的親和力，促進(jìn)和力，促進(jìn)O O2 2的釋放，反之，的釋放，反之，高濃度的高濃度的O O2 2也能促使血紅蛋白也能促使血紅蛋白釋放釋放H+ H+ 和和COCO2 2 。血紅蛋白上有血紅蛋白上有COCO2 2和和BPGBPG結(jié)合部位，因此，血紅蛋結(jié)合部位，因此，血紅蛋白還能運(yùn)輸白還能運(yùn)輸COCO2 2 。波耳效應(yīng).BPG是血紅蛋白的負(fù)效應(yīng)物。BPG（2,3-二磷酸甘油酸）通過與它的兩個(gè)亞基形成鹽鍵穩(wěn)定了血紅蛋白的脫氧態(tài)的構(gòu)象，因而降低脫氧血紅蛋白的氧親和力。BPG進(jìn)一步提高了血紅蛋白的輸氧效率。在肺部，PO2超過100torr，因

11、此，即使沒有BPG，血紅蛋白也能被飽和，在組織中，PO2低，BPG降低血紅蛋白的氧親和力，加大血紅蛋白的卸氧量。（1 1）高山適應(yīng)和肺氣腫的生理補(bǔ)償變化；）高山適應(yīng)和肺氣腫的生理補(bǔ)償變化；BPGBPG升高。升高。（2 2）血庫儲(chǔ)血時(shí)加入肌苷可）血庫儲(chǔ)血時(shí)加入肌苷可BPGBPG。BPG 2,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸.協(xié)同效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)、波耳效應(yīng)波耳效應(yīng)、別構(gòu)效應(yīng)別構(gòu)效應(yīng)使血紅蛋白的輸氧能力達(dá)到最高使血紅蛋白的輸氧能力達(dá)到最高效率效率. 抗原是指進(jìn)入異體機(jī)體后，能致敏淋抗原是指進(jìn)入異體機(jī)體后，能致敏淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異抗體，并能與抗體發(fā)生特巴細(xì)胞產(chǎn)生特異抗體，并能與抗體發(fā)生特異結(jié)合的物質(zhì)（主要有蛋白

12、質(zhì)、核酸及其異結(jié)合的物質(zhì)（主要有蛋白質(zhì)、核酸及其它高分子化合物）。它高分子化合物）。.抗原性由抗原分子表面特殊的化學(xué)抗原性由抗原分子表面特殊的化學(xué)基團(tuán)決定（一級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)），基團(tuán)決定（一級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)），這種決定或控制抗原性的化學(xué)基團(tuán)。這種決定或控制抗原性的化學(xué)基團(tuán)。包括免疫原性和抗原特異性。包括免疫原性和抗原特異性。是指誘導(dǎo)特異免疫反應(yīng)的能力。是指誘導(dǎo)特異免疫反應(yīng)的能力。是指與抗體特異結(jié)合的能力。是指與抗體特異結(jié)合的能力。被免疫活性細(xì)胞識(shí)別，從而激活免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體。被免疫活性細(xì)胞識(shí)別，從而激活免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體。與相應(yīng)抗體的與相應(yīng)抗體的FabFab結(jié)合。結(jié)合。.是在對(duì)抗原刺激的

13、免疫應(yīng)答中，是在對(duì)抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B B淋巴細(xì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合、產(chǎn)生免疫反應(yīng)的球蛋白，也特異性結(jié)合、產(chǎn)生免疫反應(yīng)的球蛋白，也稱免疫球蛋白。稱免疫球蛋白。高度特異性高度特異性多樣性多樣性幾乎所有的外源蛋白都能誘導(dǎo)相應(yīng)的特異性抗體，幾乎所有的外源蛋白都能誘導(dǎo)相應(yīng)的特異性抗體，人體內(nèi)任一時(shí)刻約有人體內(nèi)任一時(shí)刻約有1010，000000種抗體存在。種抗體存在。.抗原抗體反應(yīng)的條件：抗原抗體反應(yīng)的條件： 抗原決定簇與抗體結(jié)合部位構(gòu)象互補(bǔ)?？乖瓫Q定簇與抗體結(jié)合部位構(gòu)象互補(bǔ)。 二者各有對(duì)應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，通過作用力使二者結(jié)二者各有對(duì)應(yīng)

14、的化學(xué)基團(tuán)，通過作用力使二者結(jié)合（離子鍵、氫鍵合（離子鍵、氫鍵 等）等）抗體是抗體是2 2價(jià)的，抗原是多價(jià)的。價(jià)的，抗原是多價(jià)的。 抗體極度過剩，抗原分子所有價(jià)被抗體的飽和，可溶?？贵w極度過剩，抗原分子所有價(jià)被抗體的飽和，可溶。 抗原一抗體比例適中，形成網(wǎng)狀的抗原抗原一抗體比例適中，形成網(wǎng)狀的抗原抗體復(fù)合物，抗體復(fù)合物，不可溶。不可溶。 抗原極度過剩，抗體被飽和，可溶?？乖瓨O度過剩，抗體被飽和，可溶。.基于抗體基于抗體- -抗原相互作用的生化分析方法抗原相互作用的生化分析方法.對(duì)于某一種蛋白質(zhì)來說，在某一對(duì)于某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pHpH，它所，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等（即凈電荷帶的正

15、電荷與負(fù)電荷恰好相等（即凈電荷為零），這一為零），這一pHpH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。中性鹽（中性鹽（CaCa2+2+、MgMg2+2+、Cl Cl - - 、HPO4HPO42- 2-）影）影響滴定曲線形狀和等電點(diǎn)。鹽離子濃度為響滴定曲線形狀和等電點(diǎn)。鹽離子濃度為0 0時(shí)的等電點(diǎn)稱等離子點(diǎn)。時(shí)的等電點(diǎn)稱等離子點(diǎn)。溶解度法聚焦電泳法.化學(xué)組成法測(cè)定最低分子量化學(xué)組成法測(cè)定最低分子量SDS-PAGESDS-PAGE法法凝膠過濾法凝膠過濾法滲透壓法滲透壓法擴(kuò)散系數(shù)法擴(kuò)散系數(shù)法沉降系數(shù)法和沉降平衡法沉降系數(shù)法和沉降平衡法測(cè)分子量的方法測(cè)分子量的方法.例例如如肌紅蛋白肌紅蛋白含含0.3

16、35%0.335%的鐵的鐵最低相對(duì)分子量最低相對(duì)分子量FeFe分子量分子量Fe(%)Fe(%)100% = =55.80.335=16,700. 用一用一半透膜半透膜將蛋白溶液與純水隔開，當(dāng)將蛋白溶液與純水隔開，當(dāng)滲透達(dá)平滲透達(dá)平衡衡時(shí)，測(cè)定其滲透壓，計(jì)算分子量：時(shí)，測(cè)定其滲透壓，計(jì)算分子量：C C：濃度（克：濃度（克/ /升）升）R R：氣體常數(shù)（：氣體常數(shù)（0.0820.082升升/ /大氣壓大氣壓/ /克分子克分子/K/K開氏溫度）開氏溫度）T T：絕對(duì)溫度（開氏溫度）：絕對(duì)溫度（開氏溫度） ：以大氣壓表示的滲透壓：以大氣壓表示的滲透壓ccTRMr0lim.SDSPAGESDSPAGE即

17、十二烷基硫酸鈉即十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳.質(zhì)點(diǎn)大小在質(zhì)點(diǎn)大小在1-100nm1-100nm，可以進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)，可以進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng) 蛋白質(zhì)分子直徑在蛋白質(zhì)分子直徑在1-100nm1-100nm之間，在水溶液中具之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運(yùn)動(dòng)，丁達(dá)耳現(xiàn)象，不能有膠體溶液的通性（布朗運(yùn)動(dòng)，丁達(dá)耳現(xiàn)象，不能通過半透膜）。通過半透膜）。蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜非等電狀態(tài)時(shí)，同種電荷的互相排斥。非等電狀態(tài)時(shí)，同種電荷的互相排斥。.大量的中性鹽大量的中性鹽 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、Nacl

18、Nacl，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。破壞水化膜，降低介電常數(shù)，破壞水化膜，降低介電常數(shù)，PEGPEG、丙酮、乙醇等、丙酮、乙醇等pHpHpIpI時(shí)帶負(fù)電荷，與重金屬離子（時(shí)帶負(fù)電荷，與重金屬離子（HgHg2+2+、 PbPb2+2+、CuCu2+2+等）結(jié)成不溶性沉淀。等）結(jié)成不溶性沉淀。.pH小于等電時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：?jiǎn)螌幩?、苦味酸、鎢酸。酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸。. 強(qiáng)酸和強(qiáng)堿；強(qiáng)酸和強(qiáng)堿； 有機(jī)溶劑：破壞疏水作用；有機(jī)溶劑：破壞疏水作用； 去污劑：去污劑都是兩親分子，破壞疏水作用；去污劑：去污

19、劑都是兩親分子，破壞疏水作用； 還原性試劑：尿素、還原性試劑：尿素、 - -硫基乙醇；硫基乙醇； 鹽濃度：鹽析、鹽溶；鹽濃度：鹽析、鹽溶； 重金屬離子：重金屬離子：HgHg2+2+、pbpb2+2+，能與，能與-SH-SH或帶電基團(tuán)反應(yīng)?；驇щ娀鶊F(tuán)反應(yīng)。 溫度；溫度； 機(jī)械力：如攪拌和研磨中的氣泡。機(jī)械力：如攪拌和研磨中的氣泡。.制備活性蛋白質(zhì)時(shí)嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性制備活性蛋白質(zhì)時(shí)嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性 生物活性喪失生物活性喪失硫水基團(tuán)外露，分子結(jié)構(gòu)伸展松散，易被蛋白酶水解。硫水基團(tuán)外露，分子結(jié)構(gòu)伸展松散，易被蛋白酶水解。溶解度降低、沉淀，粘度增加。溶解度降低、沉淀，粘度增加。次級(jí)鍵（有時(shí)包括二硫鍵）被破壞

20、，天然構(gòu)象解體。次級(jí)鍵（有時(shí)包括二硫鍵）被破壞，天然構(gòu)象解體。但變性不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞但變性不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞不可逆變性不可逆變性可逆變性可逆變性.前處理前處理粗分級(jí)粗分級(jí)細(xì)分級(jí)細(xì)分級(jí)濃縮濃縮保存保存增加制品增加制品(preparation)(preparation)的純度或比活性。的純度或比活性。. 生物組織生物組織 無細(xì)胞提取液無細(xì)胞提取液破碎、溶破碎、溶 解、差速離心解、差速離心精制后的蛋白質(zhì)精制后的蛋白質(zhì).將組織和細(xì)胞破碎將組織和細(xì)胞破碎超聲波震蕩、與砂研磨超聲波震蕩、與砂研磨高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）動(dòng)物組織和細(xì)胞動(dòng)物組織和細(xì)胞電動(dòng)搗碎機(jī)

21、（電動(dòng)搗碎機(jī)（waring blender)waring blender)勻漿器（勻漿器（homogenizer)homogenizer)超聲波處理（超聲波處理（ultrasonication)ultrasonication)植物組織和細(xì)胞植物組織和細(xì)胞石英砂石英砂+ +提取液，研磨提取液，研磨纖維素酶處理纖維素酶處理微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞.差速離心法收集細(xì)胞的某一組分差速離心法收集細(xì)胞的某一組分如果提取膜蛋白，超聲波或去污如果提取膜蛋白，超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取取.（NH4NH4）2 2SOSO4 4分級(jí)沉淀法（鹽析）分級(jí)沉淀法（鹽析）等電點(diǎn)選

22、擇性沉淀法等電點(diǎn)選擇性沉淀法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法熱處理選擇性沉淀法熱處理選擇性沉淀法生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法一般用選擇性沉淀法一般用選擇性沉淀法.首先采用透析或首先采用透析或sephdex G-25sephdex G-25凝膠過濾除鹽。凝膠過濾除鹽。凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相親和層析、疏水層析（反相HPLCHPLC）自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤狀電泳、膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤

23、狀電泳、等電聚焦、雙向電泳等。等電聚焦、雙向電泳等。.晶體保存晶體保存 結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度晶不僅是純度 的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽結(jié)晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pHpH、接入晶種。、接入晶種。凍干粉保存凍干粉保存溶液保存溶液保存加入抗凍劑（加入抗凍劑（50%50%甘油）后甘油）后-20-20至至-

24、70-70保存。保存。.根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度分離根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度分離根據(jù)電荷差異分離根據(jù)電荷差異分離根據(jù)分子大小分離根據(jù)分子大小分離根據(jù)配體特性異性分離（親和層析）根據(jù)配體特性異性分離（親和層析）選擇性吸附分離（物理吸附）選擇性吸附分離（物理吸附）根據(jù)疏水性的差異根據(jù)疏水性的差異 .鹽析法鹽析法PEGPEG沉淀法沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法重金屬鹽選擇性沉淀法重金屬鹽選擇性沉淀法 （pHpI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷）生物堿和酸選擇性沉淀法生物堿和酸選擇性沉淀法 （pHpI，蛋白質(zhì)帶正電荷）熱處理沉淀法（銅鋅熱處理沉淀法（銅鋅SODSOD，6565、1515分鐘、穩(wěn)定分鐘、

25、穩(wěn)定. 在在pI時(shí)，分子電荷為零，蛋白質(zhì)分子間的時(shí)，分子電荷為零，蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥消失，從而蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集沉淀。靜電排斥消失，從而蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集沉淀。在等電點(diǎn)條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解在等電點(diǎn)條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度最小，粘度最大。度最小，粘度最大。.低鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度低鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度，稱鹽溶。，稱鹽溶。高鹽濃度時(shí)，使蛋白質(zhì)溶解度高鹽濃度時(shí)，使蛋白質(zhì)溶解度析出，稱鹽析。析出，稱鹽析。鹽析多用溶解度大的中性鹽，如鹽析多用溶解度大的中性鹽，如(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4、NaClNaCl、MgClMgCl2 2、NH4ClNH4Cl、KClKCl等的飽和

26、溶液等的飽和溶液.交 聯(lián) 葡 聚 糖交 聯(lián) 葡 聚 糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Gel P ，），） 瓊 脂 糖 凝 膠瓊 脂 糖 凝 膠（Sepharose，Bio-Gel A）.交聯(lián)葡聚糖（交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）的分子結(jié)構(gòu)）的分子結(jié)構(gòu).從電泳結(jié)果分：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、盤狀電泳從電泳結(jié)果分：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、盤狀電泳從裝置上分：從裝置上分： 圓盤電泳（柱狀）、水平板電泳、垂直板電泳。圓盤電泳（柱狀）、水平板電泳、垂直板電泳。從支持物分：從支持物分： 自由界面電泳、紙電泳（或薄膜電泳）、自由界面電泳、紙電泳（或薄膜電泳）、 凝膠電泳（凝膠電泳（PAGE PAGE ，瓊脂糖膠，淀粉膠等），瓊脂糖膠，淀粉膠等）普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細(xì)管電泳普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細(xì)管電泳.等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)pI.2D gel in proteomics.離子交換纖維素：離子交換纖維素：離子交換交聯(lián)葡聚糖：離子交換交聯(lián)葡聚糖：離子交換交聯(lián)瓊脂糖：離子交換交聯(lián)瓊脂糖：.交聯(lián)葡聚糖離子交換劑交聯(lián)葡聚糖離子交換劑.極性吸附材料：硅膠、氧化鋁、巖藻土（離子吸引和