蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法

1、蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)法實(shí)驗(yàn)十一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 掌握考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品蛋白含量的原理和操作步驟2. 進(jìn)一步熟練分光光度計(jì)的原理和操作方法3. 掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和使用 雙縮脲（雙縮脲（NHNH3 3CONHCONHCONHCONH3 3）: :凡具有凡具有兩個(gè)酰胺基或兩兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，這類化合物都有個(gè)直接連接的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比 . . FolinFolin酚試劑法（酚試劑法（LowryLowry法）法） FolinFolin酚試劑中的磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽, ,磷鎢酸鹽

2、被蛋白質(zhì)中的磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。蘭色深度與蛋白的量成正比。Folin-Folin-酚法的靈敏度是雙縮脲法的酚法的靈敏度是雙縮脲法的100100倍倍. . 19761976年由年由BradfordBradford建立的考馬斯亮蘭法建立的考馬斯亮蘭法: :染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在相結(jié)合。在595nm595n

3、m下測(cè)定的吸光度值下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595A595，與蛋白質(zhì)濃，與蛋白質(zhì)濃度成正比度成正比 . .靈敏度高比靈敏度高比LowryLowry法約高四倍法約高四倍 實(shí)驗(yàn)原理 1976年由Bradford建立的考馬斯亮藍(lán)法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定方法之一. 考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在游離狀態(tài)下呈棕紅色，在酸性溶液中當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變?yōu)樗{(lán)色，使染料最大吸收峰位置，由465nm變?yōu)?95nm，染料主要是與蛋白質(zhì)中堿性氨基酸和芳香氨基酸殘基結(jié)合。 在595nm測(cè)定的吸光度，與蛋白質(zhì)濃度成正比。Coomassie Dye-Based 蛋白質(zhì)定量PRO

4、TEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+ Bradford 法的突出特點(diǎn):(1)(1)靈敏度高。其最低檢測(cè)蛋白質(zhì)含量可達(dá)1mg1mg，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料相結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)- -染料復(fù)合物有更高的吸光系數(shù)。 (2)(2)測(cè)定快速，簡(jiǎn)潔，完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只要5 5分鐘左右 。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2 2分鐘即可完成, ,其顏色可以在1 1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定（且在5 5分鐘至2020分鐘之間，顏色

5、的穩(wěn)定性最好）(3).(3).干擾物質(zhì)少。缺點(diǎn):(1) 各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此不同蛋白質(zhì)時(shí)有較大的偏差 ；(2)有一些去污劑等物質(zhì)干擾此法的測(cè)定；(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線形，因而不能用比爾定律進(jìn)行計(jì)算而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。 此方法比紫外吸收法高10-20倍,凱氏定氮法比較復(fù)雜,但較準(zhǔn)確,往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì).器材與試劑可見光分光光度計(jì)試管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用牛血清清蛋白（BSA）配置考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀釋至1升。(

6、三)操作方法 (1)取6支試管，1支作空白,4支加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，1支留作未知樣品。分別加入各種試劑：試管編號(hào)試管編號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（mL)00.20.40.60.8待測(cè)樣品待測(cè)樣品（mL)10.9%Nacl （mL)10.80.60.40.2 0染液（染液（mL)444444蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度（ug/mL）020406080？ (2)加完試劑2-5分鐘后混勻,即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595 ，空白對(duì)照為1號(hào)管。 用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為橫坐標(biāo)，用吸光值A(chǔ)595為縱坐標(biāo)，作圖 ，即得一標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的為止樣品吸收值A(chǔ)5

7、95值，即可查出樣品蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 坐標(biāo)紙法 電腦軟件法 (1)標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測(cè)樣品的可能的最低與最高值，可選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級(jí)增加，并應(yīng)與被測(cè)液同樣條件下顯色測(cè)定。 (2)標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定：在比色時(shí)，讀取光密度至少讀2-3次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。 (3)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：一般常用的是光密度一濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。 用普通方格紙作圖。以橫軸為濃度，縱軸為光密度，一般濃度的全距占用了多少格，光密度的全距也應(yīng)占用相同的格數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作-坐標(biāo)紙 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度位置向上延長(zhǎng)，光密度位置向右延長(zhǎng)、交點(diǎn)

8、即為此座標(biāo)標(biāo)點(diǎn)。然后，將各座標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)聯(lián)成一條線，若符合Lambert-Beer氏定律，則系通過原點(diǎn)的直線。 若各點(diǎn)不在一直線，則可通過原點(diǎn)，盡可能使直線通過更多點(diǎn)，使不在直線上的點(diǎn)盡量均勻地分布在直線的兩邊。 繪制完畢以后，應(yīng)在座標(biāo)紙上注明實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的名稱，所使用比色計(jì)的型號(hào)和儀器編號(hào)、單色光波長(zhǎng)、日期、室溫。 一般應(yīng)作2-3次以上的平行測(cè)定，重復(fù)性良好曲線方可應(yīng)用。 繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后在相同條件下操作測(cè)定相同物質(zhì)時(shí)使用。當(dāng)更換儀器、移動(dòng)儀器位置、調(diào)換試劑及室溫有明顯改變時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線需重新繪制。 電腦作圖-Excel為例 首先，將數(shù)據(jù)整理好輸入Excel，并選取完成的數(shù)據(jù)區(qū)，并點(diǎn)擊圖表

9、向?qū)В?點(diǎn)擊圖表向?qū)Ш髸?huì)運(yùn)行圖表向?qū)缦聢D，先在圖表類型中選“XY散點(diǎn)圖”，并選了圖表類型的“散點(diǎn)圖” 點(diǎn)擊“下一步”，如果發(fā)現(xiàn)圖不理想，就要仔細(xì)察看是否數(shù)據(jù)區(qū)選擇有問題，如果有誤，可以點(diǎn)擊“系列”來更改. 完成了散點(diǎn)圖，現(xiàn)在需要根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算回歸方程，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。其實(shí)這很簡(jiǎn)單，先點(diǎn)擊圖上的標(biāo)準(zhǔn)值點(diǎn)，然后按右鍵，點(diǎn)擊“添加趨勢(shì)線”。 點(diǎn)擊趨勢(shì)線（也就是我們說的標(biāo)準(zhǔn)曲線）然后按右鍵，選趨勢(shì)線格式， 在顯示公式和顯示R平方值（直線相關(guān)系數(shù)）前點(diǎn)一下，勾上。再點(diǎn)確定。公式和相關(guān)系數(shù)都出來了 。四. .注意事項(xiàng)（1）如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5-20 min內(nèi)測(cè)定光吸收，因

10、為再這段時(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。（2）測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，但此復(fù)合物的吸附量可以忽略。 （3）測(cè)定完后可用乙醇將比色杯洗干凈。討論和分析 雙縮脲（雙縮脲（NHNH3 3CONHCONHCONHCONH3 3）: :凡具有凡具有兩個(gè)酰胺基或兩兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，這類化合物都有個(gè)直接連接的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比 . . FolinFolin酚試劑法（酚試劑法（LowryLowry法）法） FolinFolin酚試劑中的磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽, ,磷鎢酸鹽被蛋白

11、質(zhì)中的磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。蘭色深度與蛋白的量成正比。Folin-Folin-酚法的靈敏度是雙縮脲法的酚法的靈敏度是雙縮脲法的100100倍倍. . 19761976年由年由BradfordBradford建立的考馬斯亮蘭法建立的考馬斯亮蘭法: :染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在相結(jié)合。在595nm595nm下測(cè)定的吸光度值下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595A595，與蛋白質(zhì)濃，與蛋白質(zhì)濃度成正比度成正比 . .靈敏度高比