甲3(H3N2)亞型流感病毒相變異分子生物學(xué)基礎(chǔ)的研究

1、    甲3(H3N2)亞型流感病毒相變異分子生物學(xué)基礎(chǔ)的研究        【摘要】目的弄清甲3(H3N2)亞型流感病毒相變異的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。方法病毒粒RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，采用雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行核苷酸序列測定。結(jié)果35株甲3(H3N2)亞型流感病毒的HA1區(qū)基因長度均為984個核苷酸，它們間無發(fā)生任何核苷酸丟失或插入并發(fā)現(xiàn)HA1蛋白分子上氨基酸序列多變點(diǎn)主要在HA蛋白的頂部，尤其抗原決定簇B區(qū)和受體結(jié)合部位(RBS)，這

2、進(jìn)一步證實(shí)了，HA蛋白分子上氨基酸替換主要是人群免疫壓力所造成。同時還發(fā)現(xiàn)了半胱氨酸和脯氨酸具有高保守性及糖基化位點(diǎn)主要集中在HA1區(qū)的N和C端，尤其N端。糖基化位點(diǎn)如此分布在病毒基因進(jìn)化和流行病學(xué)上意義至今不清楚。結(jié)論H3N2亞型病毒“O”相毒株的出現(xiàn)與其蛋白分子上第226位氨基酸發(fā)生替換密切相關(guān)并推測“O”相毒株HA蛋白三維結(jié)構(gòu)與“D”相的不同。【主題詞】流感病毒核苷酸序列相變 Studies on the basis of molecular biology of the phase change of influenza A(H3N2) virusesGuo Yuanji, Dong

3、Jie, Wang Min, et al. Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing100052AbstractThe analysis of nucleotide sequences on HA1 domain of 35 strains of influenza A(H3N2) virus showed that their HA1 genes all were 984 nucleotides in length coding for a HA1 protein with 328 amino

4、 acides and there was not any occurrence of insertion or deletion of nucleotides on HA1 genes among them. The appearance of “O” phase strain of influenza A(H3N2) virus was closely related with substitution at 226 position of amino acid on HA1 protein molecule and the three-dimensional structural cha

5、nge of HA protein. The results in this paper indicaded that the positions with multiple changes on HA1 protein molecule located at the top of HA protein, especially at antigenic determinant B site or receptor binding site. These further demonstrated that the substitution of amino acid on HA1 protein

6、 molecule was casued mainly by suppress of herd immunity. This study also showed that the position of the cysteine and proline residues on the HA1 protein molecule were conservative and that the glycosylation sites located at N and C terminals, especially at N terminal of the HA1 protein The signifi

7、cance of such a distrib of glycosylation sites in the evolution of viral genes and epidemiology still remain unknown.Key words：Influenza A(H3N2) virusUtion Phase change相變是甲型流感病毒變異的一種形式1，但一般認(rèn)為甲2(H2N2)和甲3(H3N2)亞型毒株不具有“O”相特性，它們可直接通過雞胚尿囊腔分離出并能凝集雞紅細(xì)胞。1996年初，我們在流感監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)了具有“O”相特性的甲3(H3N2)亞型流感病毒株2。由于這屬首次發(fā)現(xiàn)，故

8、有必要弄清其出現(xiàn)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。甲型流感病毒基因組含8個節(jié)段，至少編碼10種蛋白，但它們是依靠其毒粒表面血凝素，(HA)蛋白抗原來識別和結(jié)合紅細(xì)胞表面含唾液酸的糖蛋白或糖脂的受體。導(dǎo)致了紅細(xì)胞的凝集。Weis等3采用x-射線分析法弄清了HA蛋白結(jié)合唾液酸區(qū)的結(jié)構(gòu)。Nobusawa等4觀察到了HA蛋白受體結(jié)合部個別氨基酸替換就能直接影響HA蛋白對紅細(xì)胞結(jié)合的能力。故我們測定了1979年以來H3N2亞型毒株HA1區(qū)基因的核苷酸序列并分析和比較其產(chǎn)物的氨基酸序列，以便弄清H3N2病毒“O”相毒株出現(xiàn)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1甲3(H3N2)亞型毒株的來源見表1。除A/Bangkok/1/

9、79(H3N2)由WHO提供外，其余均來自國家流感中心。1.2病毒增殖“D”相毒株按常規(guī)法接種9-11日齡雞胚尿囊腔進(jìn)行增殖，收尿囊液，細(xì)菌培養(yǎng)陰性，雞紅細(xì)胞凝集滴度40者；“O”相毒株，按常規(guī)接種MDCK細(xì)胞，收其細(xì)胞維持液，細(xì)菌培養(yǎng)陰性，對豚鼠紅細(xì)胞凝集滴度40者。1.3“O”、“D”相轉(zhuǎn)變將具有“O”相特性的A/京科/32/96(H3N2)和A/京科/18/96(H3N2)兩毒株經(jīng)雞胚尿囊腔適應(yīng)傳代，當(dāng)所收獲的尿囊液對胚鼠和雞紅細(xì)胞凝集能力相同時，再經(jīng)雞胚尿囊腔傳兩代即為已從“O”相轉(zhuǎn)變成“D”相。1.4病毒濃縮和純化1992年及之前分離的病毒在提取RNA之前，均按常規(guī)在雞胚增殖后，所收

10、獲的新鮮尿囊液，經(jīng)超速離心進(jìn)行濃縮，用30%60%的蔗糖梯度離心進(jìn)行純化。1.5病毒粒RNA提取1992年及之前所分離毒株提取法見參考文獻(xiàn)5。1992年之后所分離毒株RNA提取，采用德國1995年出品的RNeasy RNA Kit，方法按QIAquickTM Handbook所提供的。1.6引物用于cDNA合成和PCR擴(kuò)增的有：F7(5d-ACTATCATTGCTTTG)和R1073(5'd-CCTGCGATTGCGCCGAAT)；用于序列測定的有：25(5d-TACATTTTCTGTCAG),145(5'd-GGTAGAATATGCGACAGT),282(5'd-CA

11、GCAACTGTTACCC),490(5'd-CTGAACGTGACTATG);721(5'd-GACATACTGTTGATT),814(5'd-GACCCCATTGGCACCTGC),R362(5'd-TAAGGGTAACAGTTGCTG)和F7。35S-ATP，逆轉(zhuǎn)錄酶，PCR試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒以及Sequence system試劑盒均由美國CDC提供。表1本研究所用的甲3(H3N2)亞型流感病毒株Tab.1Influenza A(H3N2) viruses examined in the current study病毒Viruses簡稱Abbre

12、viation相PhaseA/Bangkok/1/79Bang 79-1DA/Yaan/2/87YA 87-2DA/Shanghai/11/87SH 87-11DA/Beijing/57/89BJ 89-57DA/Shanghai/1/89SH89-1DA/Sichuan/18/89SC 89-18DA/Guangdong/16/89GD 89-16DA/Guangdong/44/89GD 89-44DA/Jinan/15/90JN 90-15DA/Wuhan/7/90WH 90-7DA/Shanghai/24/90SH 90-24DA/Beijing/32/92BJ 92-32DA/Beij

13、ing/46/92BJ 92-46DA/Beijing/47/92BJ 92-47DA/Beijing/361/92BJ 92-361DA/Sichuan/3/92SC 92-3DA/Sichuan/10/92SC 92-10DA/Guangdong/1/92GD 92-1DA/Shandong/9/93SD 93-9DA/Guangdong/25/93GD 93-25DA/Johannesbury/33/94Joh 94-33DA/Guangxi/13/94GX 94-13DA/Guangdong/274/94GD 94-274DA/Beijing262/415/94BJ 94-415DA/

14、Wuhan/359/95WH 95-359DA/Shenzhen/203/95SZ 95-203DA/Shanghai/9/95SH 95-9DA/Shanxi/28/95SX 95-28DA/Fujian/57/96FJ 96-57DA/CNIC/3/96CNIC 96-3OA/CNIC/10/96CNIC 96-10OA/CNIC/32/96CNIC 96-32DA/CNIC/32/96CNIC 96-32OA/CNIC/18/96CNIC 96-18DA/CNIC/18/96CNIC 96-18O     1.7cDNA合成和聚合酶鏈反應(yīng)見文獻(xiàn)6。

15、1.8PCR產(chǎn)物純化按德國出品的，QIAguick PCR Purification Kit所提供的方法。1.9核苷酸序列測定采用雙脫氧鏈終止法7，基本步驟參考USB公司DNA sequence試劑盒。 2結(jié)果35株測定病毒，其HA1區(qū)基因長度均為984個核苷酸，它們彼此間無發(fā)生任何核苷酸插入或丟失。現(xiàn)將所測定的核苷酸序列所推導(dǎo)出的相應(yīng)氨基酸序列列于1。    135株甲3(H3N2)亞型流感病毒HA1區(qū)氨基酸序列虛線示氨基酸序列同WH95-359；黑線示糖基化位點(diǎn)Fig. 1Deduced amino acid sequence of the HA1

16、gene of influenza A(H3N2) virusesThe dot line in dicates the amino acid sequence is identical with that of WH95-359 virus. The black line means the glycosylation site1結(jié)果表明，所有測定毒株HA1區(qū)蛋白分子均含328個氨基酸，它們之間共有52個位點(diǎn)發(fā)生了替換，保守位點(diǎn)與變異點(diǎn)之間比例為32852=5.31。發(fā)生兩次或兩次以上替換的位點(diǎn)共有9個：124(抗原決定簇A區(qū))，133(RBS前壁)，156(抗原決定簇B區(qū))，186(緊挨R

17、BS)，189(抗原決定簇B區(qū))，193(緊靠RBS后壁)，197(抗原決定簇B區(qū))，226(RBS左側(cè)壁)，262(靠近抗原決定簇E區(qū))。上述位點(diǎn)除124和262外，其余7個均位于HA蛋白三維結(jié)構(gòu)頂部。清楚表明了HA1區(qū)蛋白分子上氨基酸的替換主要是由于人群免疫壓力所造成。從1還可看出，所有半胱氨酸(C)位點(diǎn)均未發(fā)生替換，表明它們相互間雙硫鍵是相同的，同時所有脯氨酸(P)位點(diǎn)也均相同。此外，糖基化位點(diǎn)，除了BJ96-32和BJ96-32于122位插入一個及BJ96-32和BJ96-18在246位丟失一個糖基化點(diǎn)外，測定的其余毒株均有共同8個糖基化位點(diǎn)，它們位于8，22，38，63，126，16

18、5，246和285。糖基化位點(diǎn)主要分布在HA1蛋白分子的兩頭，尤其集中在N端。從1結(jié)果很有意義地發(fā)現(xiàn)了第226位氨基酸，自1995年以來所分離出的毒株均為“”(異亮氨酸)，而1995年以前的毒株不是“L”(亮氨酸)就是“Q”(谷氨酰胺)。然而，在1995年所分離的“O”，“D”相毒株間見不到第226位氨基酸有差異。通過實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)兩組病毒間，僅在其246位點(diǎn)上，“O”相毒株為“N”(天冬酰胺)而“D”相毒株為D(天冬氨酸)，造成一個糖基化位點(diǎn)的丟失。除此之外，見不到實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的“O”與“D”相毒株間有其它規(guī)律性的差異。3討論本研究表明，H3N2亞型流感病毒相特性的出現(xiàn)與其蛋白分子上第226位氨基酸

19、替換有密切相關(guān)。因它是RBS袋的左側(cè)壁重要成員。一般認(rèn)為它的改變就能引起病毒粒HA蛋白與受體結(jié)合的特異性。同時根據(jù)國外過去所報道的資料9，10，無論是人，馬還是禽的H3亞型毒株，其HA1蛋白分子上第226位氨基酸不是“L”就是“Q”，從未出現(xiàn)過“I”。但1995年以來，無論“O”相還是“D”相毒株其HA1蛋白分子上第226位均為“I”，故看來，僅第226位氨基酸改變能引起病毒粒對受體特異性的改變，但還不夠完全導(dǎo)致H3N2亞型毒株相的改變，故推測在“O”與“D”相毒株間其HA蛋白三維結(jié)構(gòu)方面存在著差異。雖然通過實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的“O”、“D”毒株間在第246位上氨基酸有差異，但在其它“O”、“D”相毒株

20、間見不到有相同的差異，同時第246位是位于HA蛋白抗原決定簇的D區(qū)，離RBS甚遠(yuǎn)，故與病毒粒相變關(guān)系不密切?！癈”與“P”殘基具有保守性，這與國外報道11，12是一致的。一般認(rèn)為它們在維持HA蛋白三維結(jié)構(gòu)中起著重要的作用13。為何糖基化位點(diǎn)主要集中在HA1蛋白的N和C端，尤其N端，這種分布在病毒基因進(jìn)化中作用及在流行病學(xué)上意義至今不清楚。估計(jì)H3N2亞型病毒“O”相毒株于1995年就已出現(xiàn)，由于當(dāng)時沒預(yù)計(jì)到，許多未分離出，分離到的也已經(jīng)雞胚傳多代，已變成“D”相毒株。本文受國家自然科學(xué)基金資助(39670037)作者單位：100052北京中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所1997年10月24日收稿

21、1998年1月20日修回參考文獻(xiàn)1Andrewes S C, Pereira H G, Wildy P. Viruses of vertebrates. Fourth edition. London: Bailliere Tindall, 1978, 203-211.2郭元吉，趙惠芬，王敏，等. 流感病毒相變的發(fā)現(xiàn)及其意義. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，1996，10(2)：101-103.3Wei W, Brown J H, Cusack, et al. Structure of the influenza virus haemagglutinin complex with its recep

22、tor. Nature, 1988, 333: 426-431.4Nobusawa E, Nakajima. Amino acid substitution at 226 of the hemagglutinin molecule of influenza A(H1N1) affects receptor binding activity but not fusion activity. Virology, 1988, 167: 8-13.5Guo Y J, Desselberger D. Genome analysis of influenza C viruses isolated in 1

23、981/1982 from pigs in China. J Gen Virol, 1984, 65: 1873-1880.6Saiki R K, Gelfand D H, Stattels, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239: 487-492.7Cox N J, Kitame F, Klimov A, et al. Comparative studies of wild type and cold mutant

24、 (temperature-sensitive) influenza viruses: detection of mutation in all genes of the A/Ann Arbor/6/60(H2N2) mutant vaccine donor strain. Microbiol Pathogenesis, 1986, 1: 387-392.8Underwood P A. Receptor binding characteristics of strains of the influenza Hong Kong subtype, using a periodate sensitivity test. Archiv Virol, 1985, 84: 53-55.9Both G W, Sleigh M J. Conservation and variation in the hemagglutinin