生物物質(zhì)分離工程實(shí)驗(yàn) - 生命科學(xué)學(xué)院- 湖北大學(xué)

1、湖北大學(xué)生物物質(zhì)分離工程實(shí)驗(yàn)（0704300793）實(shí) 驗(yàn) 教 學(xué) 大 綱（第2版）生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心2010年8月前 言課程名稱：生物物質(zhì)分離工程實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)： 30學(xué)時(shí)適用專業(yè)：生物工程；生物技術(shù)； 課程性質(zhì)：專業(yè)基礎(chǔ)必修一、實(shí)驗(yàn)課程簡(jiǎn)介 植物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)主要包括植物的形態(tài)解剖，系統(tǒng)分類及與環(huán)境的關(guān)系實(shí)驗(yàn)內(nèi)容學(xué)習(xí)，以及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備使用操作；植物結(jié)構(gòu)層次包含有細(xì)胞.組織.器官.個(gè)體.種群.群落.系統(tǒng)類群，植物分類階元涉及界.門.綱.目.科.屬.種。技能方面主要包括解剖觀察，分類鑒定，相關(guān)儀器設(shè)備用具的操作使用實(shí)訓(xùn)。二、課程目的 生物物質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)課是生物技術(shù)、生物工程專業(yè)本科

2、教學(xué)中的一門重要專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課，通過實(shí)驗(yàn)教學(xué)可以加強(qiáng)學(xué)生對(duì)專業(yè)基礎(chǔ)知識(shí)和基本理論的理解，了解和掌握生物物質(zhì)分離純化的原理、方法及應(yīng)用，培養(yǎng)學(xué)生正確記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和現(xiàn)象、正確處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力。實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生獨(dú)立操作，仔細(xì)記錄觀察并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。三、考核方式及成績(jī)?cè)u(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 考核方式： 設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)報(bào)告和操作成績(jī)?cè)u(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)報(bào)告和操作（占50 %）+其它實(shí)驗(yàn)報(bào)告（占30%）+實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)（占20%）。四、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書及主要參考書 1、生物分離工程實(shí)驗(yàn) 劉葉青 主編 高等教育出版社 2007.8 2、酶制劑生產(chǎn)與應(yīng)用 楊昌鵬主編 中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社 2006.8 3、自編部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容五、實(shí)

3、驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目一覽表序號(hào)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱實(shí)驗(yàn)類型實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)必做/選做實(shí)驗(yàn)一雞蛋清中溶菌酶的提取及純度鑒定綜合性3必做實(shí)驗(yàn)二雞蛋黃中卵磷脂的分離純化和鑒定綜合性3必做實(shí)驗(yàn)三雙水相萃取系統(tǒng)中聚合物分子量對(duì)相圖的影響綜合性3必做實(shí)驗(yàn)四影響雙水相萃取系統(tǒng)相體積比因素綜合性3必做實(shí)驗(yàn)五雙水相萃取系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定-1綜合性3必做實(shí)驗(yàn)六雙水相萃取系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定-2綜合性3必做實(shí)驗(yàn)七離子交換樹脂的預(yù)處理及交換容量的測(cè)定綜合性3必做實(shí)驗(yàn)八有機(jī)溶液萃取法中pH對(duì)表觀分配系數(shù)的影響綜合性3必做實(shí)驗(yàn)九離子交換法提取抗生素的工藝研究-1設(shè)計(jì)性3必做實(shí)驗(yàn)十離子交換法提取抗生素的工藝研究-2設(shè)計(jì)性3必做實(shí)驗(yàn)

4、一 雞蛋清中溶菌酶的提取及純度鑒定（3課時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型： 綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諒牡扒逯苽淙芫傅脑砗头椒ǎǖ入婞c(diǎn)沉淀和鹽析法）。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，所以蛋白質(zhì)的沉降在等電點(diǎn)附近最為顯著。若控制溶液的pH在等電點(diǎn)附近，并增加鹽的離子強(qiáng)度，使蛋白質(zhì)處于沉降前的“臨界狀態(tài)”，在適當(dāng)?shù)臏囟认拢o置若干時(shí)間，蛋白質(zhì)會(huì)以結(jié)晶的形式從溶液中析出。加入晶種，能控制晶體的形狀、大小和均勻度，若結(jié)晶液濃度太低而結(jié)晶發(fā)生困難時(shí)，可適當(dāng)加入些晶種，能使結(jié)晶順利進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)要求：1、溶菌酶晶種的制備：2、實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備：組織搗碎機(jī)（或電動(dòng)攪拌機(jī)）、紗布、大燒杯、玻璃棒、冰箱、pH試紙、真空干燥器、多

5、用循環(huán)水真空泵、布氏漏斗等。3、二人一小組，獨(dú)立操作，并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)二 雞蛋黃中卵磷脂的分離純化和鑒定（3課時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型： 綜合性 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解卵磷脂的性質(zhì)。2、學(xué)習(xí)提取卵磷脂粗品的方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：機(jī)體的各種組織和細(xì)胞均含卵磷脂。在蛋黃（約10）、神經(jīng)、精液、腦髓、骨髓、腎上腺、心臟、蘑菇和酵母等組織內(nèi)含量很高。卵磷脂分子中具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)，卵磷脂具有降低表面張力的作用；卵磷脂被譽(yù)為與蛋白質(zhì)、維生素并列的“第三營(yíng)養(yǎng)素”，蛋黃卵磷脂可將膽固醇乳化為極細(xì)的顆粒，這種微細(xì)的乳化膽固醇顆?？赏高^血管壁被組織利用，而不會(huì)使血漿中的膽固醇增加，可作為藥物用于動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的綜合治療。

6、實(shí)驗(yàn)要求：1、實(shí)驗(yàn)藥品的準(zhǔn)備：（1）試劑： 新鮮蛋黃、95乙醇、10的NaOH溶液、丙酮、乙醚。2、實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備：磁力攪拌機(jī)（或玻棒）、減壓真空濃縮裝置、恒溫水浴鍋、冰箱、多用循環(huán)水真空泵、布氏漏斗、玻璃漏斗、玻璃棒、小燒杯等。3、二人一小組，獨(dú)立操作，并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)三 雙水相萃取系統(tǒng)中聚合物分子量對(duì)相圖的影響（3課時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型： 綜合性 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆沼脻狳c(diǎn)法制作雙水相系統(tǒng)相圖的方法，加深對(duì)相圖的認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：兩水相形成的條件和定量關(guān)系可用相圖來表示，相圖是研究雙相萃取的基礎(chǔ)。相圖是一條雙節(jié)線，當(dāng)成相組分的配比取在曲線下方時(shí)，系統(tǒng)為均勻的單相，混合后溶液澄清透明，稱為均相區(qū)；在曲線

7、的上方時(shí)，能自動(dòng)分成兩相，稱為兩相區(qū)；若配比取在曲線上，則混合后，溶液恰好從澄清變?yōu)榛鞚?。而聚合物分子量的大小?huì)影響相圖的位置和形狀，通過改變聚合物PEG分子量的大小，來繪制相圖。實(shí)驗(yàn)要求：1、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：（NH4）2 SO4溶液、PEG400、PEG6000、蒸餾水、漩渦振蕩器、微量滴管裝置、電子天平、微量注射器、大試管、移液管等。2、二人一小組，獨(dú)立操作，并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)四 影響雙水相萃取系統(tǒng)相體積比的因素（3課時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型：綜合性實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解雙水相系統(tǒng)形成的機(jī)理及常用的雙水相系統(tǒng)2、掌握雙水相系統(tǒng)中相比的測(cè)定方法，鞏固離心機(jī)的操作方法及注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：雙水相系統(tǒng)通常是由

8、水溶性的兩種聚合物組成或一種水溶性聚合物與一種鹽組成,與一般分離純化技術(shù)相比,雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離純化等方面受到廣泛重視，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ囊子诠I(yè)化應(yīng)用的生物分離技術(shù)。常用的雙水相系統(tǒng)有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸鹽、PEG/硫酸銨等。分成兩相后，上下相體積比稱為相比，相比增加，上相和下相相對(duì)組成的差別就增大，這將會(huì)極大地影響產(chǎn)物如酶在兩相中的分配系數(shù)，使酶富集于上相。通過改變聚合物的分子量和無機(jī)鹽的比例，來測(cè)定相體積比，探討影響相體積比的因素。實(shí)驗(yàn)要求：1、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：（NH

9、4）2 SO4固體、PEG400液體、PEG600固體、糖化酶濾液、電子天平（或臺(tái)秤）、臺(tái)式離心機(jī)等。2、二人一小組，獨(dú)立操作，并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)五、六 雙水相萃取系統(tǒng)中蛋白質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定（6課時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型： 綜合性 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握蛋白質(zhì)在雙水相系統(tǒng)中分配系數(shù)的測(cè)定方法2、 了解蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)的顯色反應(yīng)原理及應(yīng)用，進(jìn)一步鞏固可見分光光度計(jì)的操作及制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：雙水相萃取技術(shù)是分離純化蛋白質(zhì)混合物等生物大分子的有效方法。利用生物物質(zhì)在兩相中不同的分配，可以實(shí)現(xiàn)它們的分離；生物大分子在雙水相中上相和下相的濃度比被定義為分配系數(shù)（K=Ct/Cb）；分配行為受聚合物分子大小、成相

10、濃度、PH、無機(jī)鹽種類等因素影響?？捡R斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)可結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物，在595nm有最大光吸收，并且在低濃度時(shí)，吸光值與蛋白質(zhì)濃度服從比爾定律。將上述實(shí)驗(yàn)四種得到的不同相體積比，分別取上相和下相溶液，測(cè)定其中蛋白質(zhì)的含量，并計(jì)算分配系數(shù)。實(shí)驗(yàn)要求：1、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：牛血清蛋白溶液、考馬斯亮藍(lán)染色液、蒸餾水、實(shí)驗(yàn)三中分離得到的上下相、可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、移液管、試管及試管架等。2、二人一小組，獨(dú)立操作，并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)七 離子交換樹脂的預(yù)處理及交換容量的測(cè)定（3課時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型： 綜合性 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、通過實(shí)驗(yàn)加深對(duì)離子交換樹脂的重要性能之一總交換容量的認(rèn)識(shí)。2、掌握離子交換樹脂

11、的作用原理。3、學(xué)會(huì)離子交換樹脂的預(yù)處理方法。4、熟悉靜態(tài)法、動(dòng)態(tài)法測(cè)定離子交換樹脂總交換容量的操作方法以及四種離子交換樹脂總交換容量的操作方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：交換容量是離子交換樹脂質(zhì)量的重要標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的是離子交換樹脂的總交換量也叫最大或極限交換量，它是指樹脂經(jīng)過100/105干燥至恒重后，每克或水中每ml樹脂的具有的可交換離子的總數(shù)，單位為毫克當(dāng)量克（干樹脂）或ml（溫樹脂）即（meq/g或mL）。離子交換樹脂交換量最簡(jiǎn)單的測(cè)定方法是酸堿滴定法。氫型陽離子交換樹脂與堿作用時(shí)生成水，為一不可逆反應(yīng)、故可用于靜態(tài)法測(cè)定交換容量。RH+RNa+H2O 陰離子交換樹脂不能采用類似的方法測(cè)定，應(yīng)用氯

12、型樹脂，當(dāng)它與Na2SO4作用時(shí)，生成NaCl，這一反應(yīng)為可逆反應(yīng)，故宜采用動(dòng)態(tài)法測(cè)定樹脂交換容量。R（=NHCl）2Na2SO4=R（=NH）2SO42NaCl 。滴定流出液中含量來測(cè)定其總交換容量。實(shí)驗(yàn)要求：1、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：5%NaOH、5%HCl、0.1MNaCl標(biāo)準(zhǔn)溶液、1MHCl標(biāo)準(zhǔn)溶液、1MNa2SO4溶液、甲基橙指示劑、K2CrO4指標(biāo)劑、蒸餾水、強(qiáng)堿（717）和弱堿陰離子交換樹脂、強(qiáng)酸（732）和弱酸陽離子交換樹脂、0.1MAgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液、恒流泵、層析柱、滴定管、精密天平、烘箱、容量瓶、三角瓶2、二人一小組，獨(dú)立操作，并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)八 有機(jī)溶液萃取法中pH對(duì)表觀分

13、配系數(shù)的影響（3課時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型： 綜合性 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、通過實(shí)驗(yàn)，加深對(duì)表觀分配系數(shù)的理解并掌握其測(cè)定方法。2、以螺旋霉素為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，了解pH在萃取工藝中的重要性。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、螺旋霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，分子結(jié)構(gòu)中有2個(gè)堿性基團(tuán)，其pK1=7.1，pK2=8.4，呈弱堿性，在不同pH條件下，在水溶液和有機(jī)溶液中溶解度不同，故能達(dá)到不同程度的分配。表觀分配系數(shù)是指在一定溫度和壓力下，當(dāng)分配達(dá)到平衡時(shí)溶質(zhì)在萃取相和萃余相中總濃度之比，可通過實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定。對(duì)于弱電解質(zhì)，溶液的pH對(duì)表觀分配系數(shù)影響很大。一元弱堿性物質(zhì)溶液pH對(duì)表觀分配系數(shù)K的關(guān)系式見式（1-6-4）式中：K0熱力學(xué)分配系數(shù)，在一定

14、的溫度和壓力下是常數(shù)pk化合物電離平衡常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)由上式可知，隨溶液pH升高，K值增大，有利于螺旋霉素萃取到有機(jī)溶劑中。反之，K值減小，可將螺旋霉素從有機(jī)相反萃取到水相。2、利用螺旋霉素經(jīng)硫酸水解后，生成紫紅色，并在480nm波長(zhǎng)處有最大吸收值的特性，可測(cè)定其化學(xué)效價(jià)，從而計(jì)算出表現(xiàn)分配系數(shù)。實(shí)驗(yàn)要求：1、實(shí)驗(yàn)器材及試劑：精密電子天平，60ml分液漏斗，分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，pH酸度計(jì)，移液管，燒杯，量筒，試管，50ml容量瓶，稱量瓶和溫度計(jì)等。螺旋霉素成品和標(biāo)準(zhǔn)品，乙酸乙酯，乙酸丁酯，氯化銨，氨水，95%乙醇和硫酸等。2、二人一小組，獨(dú)立操作，并完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)九、十 離子交換法提取抗生

15、素的工藝研究（6課時(shí)）實(shí)驗(yàn)類型： 設(shè)計(jì)性 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解離子交換樹脂的工作原理和工藝條件的選擇。2、掌握旋光儀工作原理和操作方法3、以慶大霉素為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究pH對(duì)交換容量的影響，并作樹脂的吸附流出曲線和解吸曲線。 最后計(jì)算離子交換樹脂的工作交換容量。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1、了解和掌握慶大霉素的理化性質(zhì)。慶大霉素為中等強(qiáng)度的五元堿性抗生素，分子結(jié)構(gòu)中有5個(gè)氨基C1組分的pK值分別為6.65、7.55、8.31、9.22、9.95，在不同pH的水溶液中可以6種電化學(xué)狀態(tài)存在，當(dāng)pH4.5時(shí)，慶大霉素電離成5價(jià)正離子；當(dāng)pH12時(shí)，以游離分子狀態(tài)存在，故可采用離子交換法進(jìn)行提取。2、掌握離子交換法分離抗生素的原理。3、選擇合適的離子交換樹脂：慶大霉素的堿性性質(zhì)決定了它應(yīng)該采用陽離子交換樹脂。本實(shí)驗(yàn)選擇大孔弱酸DK110陽離子交換樹脂（丙烯酸型），樹脂的pK值為5.7左右。它對(duì)慶大霉素的交換容量大，解吸容易，洗脫峰集中。4、交換條件的選擇：料液由恒流泵打入離子交換柱，調(diào)節(jié)泵的轉(zhuǎn)速使達(dá)