嚙齒類小鼠γ-干擾素原核表達(dá)、純化及功能鑒定-2019年文檔

1、嚙齒類小鼠丫 -干擾素原核表達(dá)、純化及功能鑒定Prokaryotic expression and purification of murine interferon-gammaLIU Xiao-hui, CHEN Zhuo-jia, DU Jun(Department of Microbiology and Biopharmaceutics inSchool of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University ， Guangzhou510080， China) Objective:To clone murine interferon-gamma

2、 gene, do effective prokaryotic expression and purify recombinantmurine IFN- 丫 for further study.Methods:To amplify mIFN-丫 cDNA from ConA-activated murine splenocytes byRT-PCR and clone into pET30a(+) vector Then the targetprotein His6-mIFN- 丫 was induced by IPTG and purified withNi2+-NTA agarose. T

3、he biologic activity was identified by western blotting.Results:The prokaryotic expressionsystem of mIFN- 丫 was constructed . And the fusion protein mIFN-y was dissoluble and bioactive.Conclusion:Thetechnology of mIFN- y production is successfully optimized.It lays a foundation of further research o

4、f IFN-丫 .s IFN- 丫； Prokaryotic expression ； Purification英國國立醫(yī)學(xué)研究所的Isancs 和 Lindenman 在研究病毒的干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種可溶性物質(zhì)，進(jìn)一步研究表明這一物質(zhì)能夠抑制多種病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖，于是將其命名為干擾素( interferons ， IFN) 1 。干擾素是一類由低分子可溶性蛋白組成的重要細(xì)胞因子，自 1957年 Isancs 首次發(fā)現(xiàn)雞干擾素以來，先后已有人、鼠、犬以及豬等動物的干擾素基因被成功克隆。IFN- 丫具有很強(qiáng)的抗病毒活性、免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活性。IFN- 丫可通過多種途徑來發(fā)揮抗腫瘤作用，既通

5、過延長細(xì)胞周期以延緩腫瘤細(xì)胞的生長和繁殖；又可通過抑制癌基因的表達(dá)來阻止或減慢腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程；還可誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor- a, TNF-a )上調(diào)癌細(xì)胞對 TNF 受體、MH(E 類 抗原等的表達(dá)，使其易被殺傷性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic Tlymphocyte, CTL) 識別而被殺傷2 。當(dāng)病原體侵入機(jī)體組織后，淋巴細(xì)胞在感染部位聚集并釋放干擾素等細(xì)胞因子。IFN- 丫主要通過JAK-STAT途徑來發(fā)揮作用 的。IFN- 丫與幾乎分布于所有正常細(xì)胞表面的高親合力的受體 IFN- yR (IFNGFR結(jié)合并使受體發(fā)生二聚化后，受體的胞內(nèi)近膜 區(qū)可

6、與胞漿內(nèi)非受體TPK-JAK激酶(janus kinase)結(jié)合并發(fā)生磷 酸化，進(jìn)而與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducersand activators of transcription , STAT-1)相結(jié)合。在 JAK催 化下， STAT-1 結(jié)合成活化的STAT-1 二聚體轉(zhuǎn)移入核，他們通過與 IFN- 丫 活化位/點(diǎn)(gamma-interferon activation sites , GAS)結(jié)合而誘導(dǎo)免疫活性蛋白表達(dá)，如CD54呷口剁安2, 3 二加氧酶 3 ( idoleamine 2,3-dioxygenase, IDO )等。據(jù)資料顯示，我國在嚙齒

7、類 y-干擾素的克隆、制作方面還 趕不上其他國家。盡管國外已經(jīng)制備有基因重組嚙齒類y-干擾素，但是由于其開發(fā)成本高、前期投入大，用于腫瘤藥物的基礎(chǔ)研究， 價(jià)格相當(dāng)昂貴，這也嚴(yán)重地限制了我國相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。因此本研究進(jìn)行嚙齒類丫-干擾素的制備對腫瘤藥物的相關(guān)研究將具有重要的實(shí)際意義4 。1 材料與方法1.1 材料5周C57BL/6雄鼠，由中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。pET30a(+),購自Novagen公司。大腸桿菌JM109和BL21由本實(shí) 驗(yàn)室保存。限制性核酸內(nèi)切酶 BamH I和Hindm、Taq DNA聚 合酶、T4 DNA連接酶、AMV®轉(zhuǎn)錄酶均購自 TaKaR赤司；IPT

8、G 購自華美生物工程公司；凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)mega Bio-tek 公司；鎳離子螯合層析柱購自Pharmacia 公司。一抗兔抗IDO來自本實(shí)驗(yàn)室保存5 ; B-actin多克隆抗體購自 杰特偉公司；羊抗兔 HRP勾自博士德生物XX公司；蛋白定量試 劑為 Bio-Rad 公司的 Bio-Rad Protein Assay 試劑盒；RPMI1640、DMEM&養(yǎng)基粉末購自 Gibco公司；新生牛血清(NPS購 自PPA公司；小鼠mIFN-丫標(biāo)準(zhǔn)品購自品美生物工程 XX公司； 其余試劑為國產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI Gene Bank

9、發(fā)表的序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù) XX公司合成。其序列為， 上游引物：5' -CAGAGCTTTCAGCAGCAGCTCCTTTTC- BamHI 位點(diǎn))；下游引物：5' -TCGGATCCCACGGCACAGTCATT3AAAG- Hind 出位點(diǎn))。1.2.2 目的基因的獲取健康 6周齡的雄性C57BL/6小鼠，無 菌條件下取脾，放入盛有 5 ml不含血清RPMI1640的培養(yǎng)皿中， 不銹鋼網(wǎng)(200 目)磨碎過濾，使之成為單細(xì)胞懸液。離心，棄上清，加入含有10 %新生牛血清RPMI164Q調(diào)整濃度為5X106 個(gè)/ml , ConA(8 以 g/ml)誘導(dǎo)

10、24 h(37 C , 5% CO2> 用 Trizol 二步法進(jìn)行RT-PCFT增。PCRS應(yīng)程序?yàn)椋?4c預(yù)變性5 min;94 變性30 s， 52退火30 s ， 72延伸1 min ，循環(huán)擴(kuò)增 30次 , 最后72延伸10 min 。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.2.3 pET30a(+)/mIFN- 丫 原核表達(dá)載體 的構(gòu)建與鑒定PCFT物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，BamH I和 Hindm雙酶切，凝膠回收試劑盒純化回收。質(zhì)粒小提試劑盒小 提質(zhì)粒pET30a(+);質(zhì)粒pET30a(+)經(jīng)BamHI和Hind出雙酶切， 凝膠回收試劑盒純化回收。T4 DNA連

11、接酶連接純化的PCRT物和pET30a(+),將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌JM109,卡那霉素抗性篩選，PC吸酶切鑒定陽性重組質(zhì)粒pET30a（+）/mIFN- T。將 pET30（+）/mIFN- T 轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿 菌BL21,從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取單菌落，在 3 ml LB中37c震 蕩培養(yǎng) 1216 h ，菌液- 80凍存。1.2.4 His6-mIFN- 丫蛋白的融合表達(dá)取凍存菌接種于45ml的LB （卡那霉素50 ng/ml ） , 37c培養(yǎng)過夜，按 1 ： 50轉(zhuǎn)接 于LB （含卡那霉素50 ng/ml）中，37c培養(yǎng)至OD直為0.60.8 , 加入終濃度為0.5 mmol

12、/L的IPTG 37c震蕩培養(yǎng)3 h,并設(shè)IPTG 未誘導(dǎo)對照組。離心收集1.5 ml菌液，進(jìn)行SDS-PAG辰達(dá)分析。1.2.5 工程菌裂解后融合蛋白的可溶性鑒定取蛋白表達(dá)陽性的凍存菌種于 45 ml的LB （卡那霉素50 ng/ml ） , 37 C培 養(yǎng)過夜，按1 ： 50轉(zhuǎn)接于LB （含卡那霉素50 ng/ml ）中，37 C 培養(yǎng)至。琬為0.60.8，加入終濃度為 0.5 mmol/L的IPTG 25C 震蕩培養(yǎng)7 h ，離心收集1.5 ml 菌液，冰上適量溶菌酶裂解緩沖液裂解菌體，超聲裂菌（輸出頻率為25 Hz, 4C, 30 sX10）。4 ,15 000 r/min 離心 15

13、 min ，分別取適量上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAG盅泳，分析目的蛋白的分布，其余凍存于-80C冰箱。1.2.6 融合蛋白His6-mIFN- 丫的純化架好銀離子親和層析柱，先以Washing buffer 流洗 （流速為 2 ml/min） 達(dá)平衡后，換成 Native Binding buffer 使其管柱結(jié)合上新的鎳離子。再以Washing buffer 流洗達(dá)平衡后，注入保存的蛋白上清液，以Binding buffer 流洗 （流速為1 ml/min ） 約 250 ml。 再以 Washingbuffer 流洗 （ 流速為 2 ml/min） 約 300 ml。 最后以 Elution

14、 buffer洗脫，連續(xù)收集洗脫液，每次收集14 ml 。分別取少量Bindingbuffer 洗脫液，末次Washing buffer 洗脫液及Elution buffer洗脫液進(jìn)行SDS-PAG分析。1.2.7 純化蛋白的超濾將收集到的Elution buffer 洗脫液放入截流孔徑5 KD的超濾管中，超濾20 min, 2 800 g/min , 4。 用PBS和5%的甘油清洗，繼續(xù)超濾 20 min, 2 800 g/min 。收 集超濾后的蛋白，分裝于1.5 mlEP 管中，凍存于- 80冰箱中。1.2.8 Western Blotting 鑒定融合蛋白 His6-mIFN- 丫 的

15、生 物學(xué)活性以小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7乍為待測樣本，檢測IFN- 丫 誘導(dǎo)前后細(xì)胞內(nèi)IDO表達(dá)的情況。取標(biāo)準(zhǔn)小鼠IFN- 丫作為陽性 對照，均誘導(dǎo)24 h 。光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。WesternBlotting 參照分子克隆方法進(jìn)行。電壓80100 V 進(jìn)行10%SDS-PAGE泳，電轉(zhuǎn) 100 V, 70 min。2 結(jié)果2.1 目的基因的獲取應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物，采用RT-PCFT增mIFN-丫，1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見426 bp 左右有一條特異條帶，與預(yù)期片段大小相符；見圖1。2.2 pET30a(+)/mIFN-丫原核表達(dá)載體的鑒定克隆至pET30a(+)載體的

16、重組質(zhì)粒以 BamH I和Hindm雙 酶切后，分別切出426 bp 和 5 422 bp 左右 2 個(gè)片段，見圖2。與預(yù)想結(jié)果一致，證明構(gòu)建重組質(zhì)粒成功。His6-mIFN- 丫的表達(dá)和純化 pET30a(+)/mIFN- 丫轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21,隨機(jī)挑選單克隆菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)經(jīng) IPTG誘 導(dǎo)后，SDS-PAG分析，可看到目的蛋白在 2、5和6號菌落中得 到融合表達(dá)。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白的 Mr約18 kDa,與其理論 值基本接近，表明 pET30a(+)/mIFN- 丫可以在大腸桿菌中 BL21 融合表達(dá)，見圖3。超聲裂解菌后分別取適量上清和沉淀做SDS-PAG E發(fā)現(xiàn)目的蛋白多集

17、中在上清液，大部分是以可溶形式表達(dá)，見圖4。陽性菌株經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)及IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用銀離子親和層析 柱純化收集到的可溶性蛋白，SDS-PAG分析，可看到29號收集液在 18 kDa 左右均有一條清晰的條帶，并且59 號收集液中幾乎沒有雜帶?？梢娎勉y離子親和層析柱對His6-mIFN- 丫蛋白液的純化效果極好，見圖5。2.3 His6-mIFN- 丫生物活性鑒定分別將純化的重組蛋白 His6-mIFN- 丫和標(biāo)準(zhǔn)品mIFN-丫刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7， 24 h 后可見受刺激的細(xì)胞發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)變化，見圖6。 Western Blotting分析可見經(jīng)His6-mIFN- 丫和標(biāo)準(zhǔn)

18、品 mIFN-丫誘導(dǎo)后，RAW264.碇達(dá)IDO的 活性明顯升高，見圖7。圖1PCN物電泳圖M: DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2000;1 : PCR物Fig.1 Electrophoresis map for PCR productsM： DNA Marker DL 2000;1 ： PCR amplification圖 2 重組質(zhì)粒的酶切電泳圖1: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物mIFN-丫片段;2:經(jīng)雙酶切的重組質(zhì)粒；3：未經(jīng)處理的重組質(zhì)粒;M： DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2000Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid1

19、: PCR amplification mIFN- y ；2 : BamH I + Hind 田 pET30/mIFN-丫 ;3: pET30/mIFN- 丫 ;M, DNA Marker DL 2000圖3IPTG誘導(dǎo)蛋白的 SDS-PAGEM中分子量蛋白 marker； 1:未加IPTG誘導(dǎo)菌液總蛋白；26: IPTG誘導(dǎo)菌液總蛋白Fig.3SDS-PAGE of induced products with IPTGM： protein molecular weight marker; 1： UninducedpET30a(+)/mIFN- 丫 ；26: induced pET30a(+)

20、/mIFN- 丫圖4超聲裂解菌SDS-PAG西泳M中分子量蛋白marker； 1:裂解菌后的上清液；2：裂解 菌后的沉淀物Fig.4 SDS-PAGE of split productsM： Protein molecular weight marker； 1 ： Superior liquid of split products；2： Deposit of split products圖5純化嚙齒類Y-干擾素的SDS-PAGI®M 中分子量蛋白 marker； 1: Binding buffer洗脫液；2：末次 Washing buffer 洗脫液，39： Elution buff

21、er 洗脫液Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purification of recombinant murine IFN- 丫 （m IFN- 丫）M： moderate protein molecular weight markers ； 1： Binding buffer eluent ；2： ultimate Washing buffer eluent 3-9 ， Elution buffer eluent圖6mIFN-Y刺激RAW264.7后的形態(tài)學(xué)變化1:未加 mIFN-丫刺激的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)；2:標(biāo)準(zhǔn)品 mIFN-丫刺激后的RAW264.N田

22、胞形態(tài)；3: His6-mIFN- 丫刺激后 的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)Fig.6 microscope observation of RAW264.7 induced by mIFN-丫1: morphology of RAW264.7without IFN- y ; 2: morphology of RAW264.7induced by mIFN-丫 standard ； 3: morphology of RAW264.7 with His6-mIFN- 丫圖7IDO在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)情況1: His6 -mIFN- 丫刺激后RAW264.7細(xì)胞溶胞產(chǎn)物；2:標(biāo) 準(zhǔn)品mIFN-丫刺激后RAW264.顏胞溶月6產(chǎn)物