用Quantity One進(jìn)行定量分析的方法

1、- -用Quantity One進(jìn)展定量分析的方法生物技術(shù)2021-09-06, 21:17 葉林Quantity One是Bio-Rad公司的凝膠電泳圖像獲取、處理以及定量分析軟件。功能很強(qiáng)大，到底多么強(qiáng)大在這就不說(shuō)了。用處很多，到底多么多在這也不說(shuō)了，具體功能請(qǐng)參考Quantity One使用說(shuō)明及相關(guān)教程。下面只是Quantity One用于DGGE結(jié)果定量分析的一般操作方法：有下面這么一XDGGE圖像，需要分析一下左邊第5條泳道的8個(gè)條帶對(duì)應(yīng)的DNA在樣品中占的百分比各分別是多少。第一步：建立泳道點(diǎn)擊菜單欄“Lane-Auto Frame Lanes，一般情況下Quantity One

2、會(huì)自動(dòng)識(shí)別并建立泳道。但也有很多時(shí)候不能自動(dòng)建立泳道，這就需要選擇菜單欄“Lane- Frame Lanes然后輸入要建立泳道的數(shù)目，手動(dòng)建立泳道。泳道建立后需要調(diào)整，在菜單欄“Lane-Edit Frame中有拉伸、旋轉(zhuǎn)、移動(dòng)、添加/刪除錨點(diǎn)等選項(xiàng)，通過(guò)這些選項(xiàng)可以對(duì)泳道進(jìn)展調(diào)整，調(diào)整后大致如下：第二步：消除泳道背景點(diǎn)擊菜單欄“Lane-Lane Background跳出一個(gè)對(duì)話(huà)框，“All Lanes中選擇第二個(gè)，然后點(diǎn)一下第5條泳道，“Selected Lane的下面會(huì)顯示Selected Lan:#5(#5)，然后選擇Lane On“ Rolling Disk Size中填一個(gè)1020

3、之間的數(shù)(可以多嘗試幾個(gè)，看看效果)，最后點(diǎn)“Done完成操作。第三步：建立條帶點(diǎn)擊菜單欄“Band->Detect Bands翻開(kāi)一個(gè)對(duì)話(huà)框，調(diào)整Sensitivity和Lane Width的數(shù)值，使每個(gè)條帶都被檢測(cè)到，如果條帶上面顯示的是一條紅線(xiàn)，可以在“Band-Band Attributes的Style欄中選擇Brackets，使之顯示為括號(hào)形式。條帶建立后圖像顯示如下：第四步：生成報(bào)告點(diǎn)擊菜單欄“Report-Lane Report然后點(diǎn)一下第五條泳道，在彈出的對(duì)話(huà)框的Measurements 一欄中選擇Trace Qty (個(gè)人感覺(jué)選擇這個(gè)比較適宜，也可以選擇其他的看看效果)

4、，然后點(diǎn)Report，就看到了每個(gè)條帶的Trace Qty值，這個(gè)值與DNA的濃度呈正比，根據(jù)這個(gè)值計(jì)算百分比即可。以上僅僅是Quantity One進(jìn)展定量的簡(jiǎn)單流程，非常不具體，一些具體的參數(shù)設(shè)置及軟件的其它功能請(qǐng)參考相關(guān)的使用說(shuō)明或教程。另外，不確定上面的操作是否有不當(dāng)之處，如有請(qǐng)多指教。需要特別說(shuō)明的一點(diǎn)是：對(duì)于一個(gè)從復(fù)雜的環(huán)境樣品中提取的DNA，經(jīng)過(guò)PCR-DGGE，然后用Quantity One定量，通過(guò)分析每條條帶的intensity來(lái)計(jì)算百分比，然后估計(jì)原始樣品中各個(gè)物種比方細(xì)菌的百分比，這樣的做法是非常不準(zhǔn)確的，這種數(shù)據(jù)發(fā)paper可能不會(huì)被承受，因?yàn)檎麄€(gè)過(guò)程中存在很多Bia

5、s。同理，T-RFLP也存在類(lèi)似問(wèn)題。 Quantity One施用教程大全轉(zhuǎn)貼2021-11-11 09:531 - 內(nèi)容簡(jiǎn)介 凝膠電泳是每個(gè)做份子有生命的物質(zhì)學(xué)的同窗天天都要打交道的根本技術(shù)。電泳然后的信息處理與電泳本身同樣重要。今朝有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，比較有名的比方BandScan、BandLeader、Sigma Gel等等。今日要向大家介紹的是來(lái)自Bio-Rad的1D凝膠定量軟件Quantity OneBio-Rad還有一個(gè)做2D凝膠分析的軟件PDQuest。這個(gè)軟件的最新版本可以在Bio-Rad的主頁(yè)不收費(fèi)下載。今朝的最新版本是4.52版 2 - Quanti

6、ty One的定量方法 Quantity One的分析功能顧名思義首要用來(lái)舉行凝膠或培養(yǎng)皿的熒光定量分析。它的分析功能或說(shuō)分析方式首要有4種：泳道/條帶軌跡定量法；等高線(xiàn)直接定量法；菌落計(jì)數(shù)；份子量測(cè)定 - - - 這三種方法中施用最為利便也是最為廣泛的應(yīng)該是等高線(xiàn)定量法Volumn Contour。它經(jīng)由過(guò)程半AUTO描繪電泳條帶的等高線(xiàn)邊沿來(lái)得到等高線(xiàn)區(qū)域內(nèi)部平面或物體外表的大，再將該平面或物體外表的大乘以區(qū)域內(nèi)平均光疏密程度值當(dāng)?shù)綏l帶內(nèi)部總的信號(hào)量。固然這種分析方法的蠹弊顯而易見(jiàn)：無(wú)法同等得排除不同泳道的配景亮度；等高線(xiàn)的繪制處于“半AUTO狀態(tài)，即需要人為判斷作為等高線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的電泳條帶的

7、邊沿；最致命的是在幾個(gè)電泳條帶距離十分接近的時(shí)辰幾乎無(wú)法繪制純一條帶的輪廓常出現(xiàn)持續(xù)的幾個(gè)條帶等高線(xiàn)相連而無(wú)法別離出單獨(dú)條帶的輪廓。 三種方法中個(gè)人感覺(jué)最為科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽?yīng)該是泳道/條帶軌跡定量法Trace Tracking。這種方法施用起來(lái)步調(diào)較為繁瑣，必需經(jīng)由過(guò)程泳道識(shí)別-電泳條帶識(shí)別兩個(gè)持續(xù)的步調(diào)才氣舉行定量。然而這種方式的最大長(zhǎng)處在于它可以純粹丟棄人為主觀因素舉行全AUTO定量。他的定量方式為：首先根據(jù)不同電泳條帶的光疏密程度值繪制光疏密程度曲線(xiàn)，然后計(jì)算光疏密程度曲線(xiàn)下平面或物體外表的大作為電泳條帶的定量根據(jù)。大家可能會(huì)問(wèn)他能不能排除泳道配景？謎底是必定的，它能夠最大程度的排除不同泳道

8、之間的配景差異，讓各個(gè)泳道上的不同電泳條帶在一條幾乎不異的開(kāi)場(chǎng)跑線(xiàn)上舉行相比較。這個(gè)配景排除功能是等高線(xiàn)法無(wú)法做到的等高線(xiàn)法也有根本的配景排除措施，但是和泳道/條帶軌跡定量法的配景排除不是一個(gè)等級(jí)的。等高線(xiàn)法只能排除同一泳道上的配景，而不能均等的排除不同泳道的配景。另外泳道/條帶軌跡定量法還可以聯(lián)合Gauss Model Bands對(duì)嚴(yán)密相連的電泳條帶舉行分析，而這種條帶也是等高線(xiàn)法無(wú)法分析的。我們這次重點(diǎn)學(xué)習(xí)這個(gè)方法。 第三個(gè)分析功能是菌落計(jì)數(shù)Colony Counting。這個(gè)功能其實(shí)很實(shí)用，可以分析藍(lán)白篩選的結(jié)果。但是很奇怪My puter居然無(wú)法運(yùn)行這個(gè)功能， 因此無(wú)法向大家介紹了。

9、另外Quantity One還可以經(jīng)由過(guò)程回歸曲線(xiàn)測(cè)定份子量。 下面讓我們了解一下Quantity One經(jīng)常使用的根本菜譜操作。 - - - 翻開(kāi)文件：由于Quantity One是Bio-Rad的硬件組成一套軟件，因此Quantity One可以AUTO輸入來(lái)自Bio-Rad公司的凝膠分析儀的數(shù)據(jù)。具體支持哪些硬件大家可以在“Edit-Preference-Imagers里面設(shè)置。如果您的實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有接納Bio-Rad的硬件設(shè)施也沒(méi)瓜葛。您只要將電泳圖片用ACDSee等程序轉(zhuǎn)換為T(mén)IF圖片格式就能夠被Quantity One識(shí)別了。注重Quantity One只支持8位和16位灰度的TIF文

10、件。 Quantity One彷佛有一個(gè)小bug，就是在按“Open然后并沒(méi)有立刻彈出資源管理器讓你選擇方針文件的位置。其實(shí)你只要將鼠標(biāo)在熒幕右下方點(diǎn)擊一下，資源管理器就會(huì)乖乖彈出來(lái)了. Quantity One只能分析白的顏色配景 玄色條帶的電泳圖。而我們正常環(huán)境下得到的一般都是玄色配景 白的顏色條帶的電泳圖。我們可以在“Image-Invert data中將圖片顏色舉行反轉(zhuǎn)，然后即可以用Quantity One舉行分析了. 文字注解：Quantity One提供根本的文字注解功能。您可以在您的電泳圖片上記載您的分析結(jié)果比方電泳條帶的份子量、光疏密程度值、事物的量等等。這個(gè)功能可以經(jīng)由過(guò)程“

11、Edit-Text Overlay Tools來(lái)使成為事實(shí)。在彈出的浮開(kāi)工具欄入選擇“ABC或“就能夠舉行文字輸入和畫(huà)標(biāo)志線(xiàn)的操作。 光疏密程度工具：在“View-Plot Density的下級(jí)菜譜中大家會(huì)見(jiàn)到幾個(gè)和電泳條帶光疏密程度值相干的預(yù)示選項(xiàng)。大家可以別離選擇不同的選項(xiàng)感受一下它們之間的不同。選擇方法是點(diǎn)擊響應(yīng)的下級(jí)菜譜比方“Plot Cross Section，然后將變成帶一個(gè)藍(lán)色感慨號(hào)的鼠標(biāo)移到您想懂得光疏密程度的位置，點(diǎn)擊一下就會(huì)預(yù)示該處的光疏密程度相干信息。鄙人面這幅圖片中我們可以看見(jiàn)兩條黃線(xiàn)穿插處的電泳條帶的相干信息。上方的一串曲線(xiàn)是不同泳道之間在同一平行線(xiàn)上的光疏密程度比率

12、曲線(xiàn)；左邊是黃線(xiàn)穿插處地點(diǎn)泳道的幾個(gè)電泳條帶的光疏密程度漫衍環(huán)境。 3D Viewer：在“View-3D Viewer菜譜中大家會(huì)看到一個(gè)有趣的功能叫做3D Viewer。這個(gè)玩意按照Bio-Rad的說(shuō)法可以輔助鑒別幾條嚴(yán)密相連在一路的電泳條帶的漫衍環(huán)境。大家只要選擇了這個(gè)號(hào)令后鼠標(biāo)就會(huì)一個(gè)“ 型，然后將 型移動(dòng)到您感興趣的位置，拖動(dòng)鼠標(biāo)畫(huà)出一個(gè)正方形區(qū)域，然后用鼠標(biāo)雙擊，Quantity One就會(huì)將這塊區(qū)域按照gauss漫衍規(guī)律渲染成一個(gè)三維模子，頗有意思。但個(gè)人感覺(jué)這個(gè)功能噱頭多于實(shí)用。 4 - Quantity One的根本配景排除功能 最起頭的時(shí)辰我們就說(shuō)過(guò)Quantity One

13、的等高線(xiàn)定量模式也有一種比較根本的配景排除方法。這個(gè)方法同樣也合用于泳道/條帶定量模式。此刻我們就來(lái)學(xué)習(xí)這個(gè)方法。根本配景排除的功能位于“Image-Substract backgroud.和“Image-Filter Wizard.這兩個(gè)菜譜。 - - Image-Filter Wizard：這個(gè)功能是對(duì)原始圖片做一些開(kāi)真?zhèn)€加工，主如果祛除一些圖片上的“斑點(diǎn)。這些斑點(diǎn)首要有兩種類(lèi)型：一種是深色的“胡椒面型和淡色的“食鹽型，兩種斑點(diǎn)都可以毫不猶豫地去除。從“Image-Filter Wizard.菜譜調(diào)出向?qū)Р俗V后選擇“pepper和“salt，下面兩個(gè)選項(xiàng)可以按照程序默許的選項(xiàng)，然后“OK就

14、能夠完成這第一步的降噪歷程。 Image-Substract backgroud：這個(gè)功能是真正對(duì)圖片配景舉行清理的工具區(qū)別于“Image-Filter Wizard.的降噪模式。只是這種清理是一種“全局型的清理，即它以不異的參量對(duì)每條泳道舉行配景清理。然而在清理方式上它照舊可以分成兩種不同的方式： Backgroud Box：一種是以一個(gè)局部小平面或物體外表的大為標(biāo)準(zhǔn)配景，將整X電泳圖片上所有比該區(qū)域光疏密程度值低的區(qū)域全部漂白。這種發(fā)型稱(chēng)為“Backgroud Box。操作時(shí)用鼠標(biāo)選中對(duì)話(huà)框下部左側(cè)的“Backgroud Box按鍵，然后用鼠標(biāo)在電泳圖片上選擇一塊顏色近乎配風(fēng)光，色澤比較勻

15、稱(chēng)的區(qū)域，用鼠標(biāo)拖動(dòng)畫(huà)出一個(gè)正方形。開(kāi)釋鼠標(biāo)后程序就會(huì)當(dāng)即對(duì)電泳圖片舉行降低配景的處理； Backgroud Stripe：相對(duì)于“Backgroud Box來(lái)講是一種更加智能化的處理方式。它出格合用于梯度凝膠，即凝膠濃度由上至下依次變化。由于梯度膠的光疏密程度值在一定距離內(nèi)不斷變化，因此如果接納“Backgroud Box的方法除配景就會(huì)發(fā)生偏差。Quantity One此時(shí)提供一種隨著凝膠濃度變化而變化的除配景方式就是“Backgroud Stripe。和“Backgroud Box近似，選擇右下角的“Backgroud Stripe按鍵，然后用鼠標(biāo)沿著電泳泳道拖放形成一個(gè)狹長(zhǎng)的剪影帶St

16、ripe，這個(gè)剪影帶內(nèi)部的光疏密程度值順著泳道逐漸升高或降低。Quantity One根據(jù)這個(gè)Stripe可以動(dòng)態(tài)的對(duì)整X圖片的配景舉行剪影。比方泳道肇始處光疏密程度低，那末Quantity One在此處的剪影值也降低；隨著Stripe向前延長(zhǎng)，光疏密程度值逐漸升高，Quantity One也同樣不斷加大剪影的強(qiáng)度。這樣一來(lái)就能夠排除由于梯度膠帶來(lái)的配景不相符的影響因素。 5 - Quantity One的電泳泳道分析功能-創(chuàng)立泳道 前面說(shuō)過(guò)Quantity One之所以強(qiáng)大是因?yàn)樗哂械挠镜?條帶軌跡定量法。此刻我們就來(lái)學(xué)習(xí)一下如安在電泳圖片上創(chuàng)立泳道Lane和怎樣舉行針對(duì)不同泳道的配景排除

17、。 - - 創(chuàng)立泳道：首先翻開(kāi)我們要分析的電泳圖片以卵白質(zhì)電泳為例。然后選擇“Lane-Auto Frame lanes。這時(shí)候如果您的電泳圖片比較標(biāo)準(zhǔn)的話(huà)，Quantity One就會(huì)AUTO識(shí)別出每條電泳泳道的位置，而且將各個(gè)泳道的路徑用一條紅線(xiàn)標(biāo)畫(huà)出來(lái)； 如果您對(duì)軟件AUTO標(biāo)志的泳道不甚對(duì)勁，您可以經(jīng)由過(guò)程“Lane-Edit Frame下級(jí)各個(gè)子菜譜提供的功能對(duì)泳道框架位置、大小等舉行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)方法就是經(jīng)由過(guò)程鼠標(biāo)的拖放來(lái)使成為事實(shí)，大家可以本身體驗(yàn)一下； 如果您只消分析此中幾個(gè)泳道的數(shù)據(jù)而不想其它泳道的標(biāo)志滋擾您的眼看東西假想線(xiàn)，您可以經(jīng)由過(guò)程“Lane-Single Lane-R

18、emove Lane刪除您不需要的泳道的標(biāo)志。 不是所有的電泳圖片的泳道都能夠被Quantity OneAUTO識(shí)別。在不能AUTO識(shí)別的環(huán)境下，Quantity One就會(huì)彈出對(duì)話(huà)框告訴您它不能識(shí)別泳道。這時(shí)候大家就需要手工繪制電泳泳道。方法和上邊同樣，同過(guò)“Lane-Single Lane-Creat Lane來(lái)使成為事實(shí)。只要用鼠標(biāo)在您的電泳圖片上順著待標(biāo)志的泳道的中軸線(xiàn)拖放就能夠繪制出該泳道的標(biāo)志紅線(xiàn). 6 - Quantity One的電泳泳道分析功能-排除配景 前面說(shuō)過(guò)Quantity One之所以強(qiáng)大是因?yàn)樗哂械挠镜?條帶軌跡定量法。此刻我們就來(lái)學(xué)習(xí)一下如安在電泳圖片上創(chuàng)立泳道

19、Lane和怎樣舉行針對(duì)不同泳道的配景排除。 - - 排除配景：首先請(qǐng)大家注重，這個(gè)排除配景和前面我們?cè)凇癐mage菜譜中施用的“Substruct Backgroud有所不同。后者排除配景的對(duì)象是全般電泳圖片而非將各個(gè)電泳泳道的配景別離舉行排除。此刻我們要學(xué)習(xí)的這個(gè)號(hào)令可以幫助我們別離排除各個(gè)泳道也能夠?qū)⑷坑镜烙貌划悩?biāo)準(zhǔn)舉行排除的不同的光疏密程度配景。這個(gè)功能對(duì)我們以后的分析影響甚大，大家一定好好學(xué)習(xí)。 首先我們要將我們的電泳圖片舉行前面談到的泳道識(shí)別，不管是AUTO方式照舊手工識(shí)別。然后選擇“Lane-Lane Backgroud.號(hào)令。選擇該號(hào)令后，鼠標(biāo)即變成一個(gè)綠顏色的“ ，將鼠標(biāo)移到

20、您籌算舉行配景排除的泳道比方以下圖中的第4泳道，點(diǎn)擊左鍵一下，立刻就會(huì)彈出如以下圖所示的對(duì)話(huà)框。 此中“Optical Density預(yù)示得是該泳道光疏密程度值的漫衍環(huán)境。大家會(huì)注重到這個(gè)漫衍曲線(xiàn)其實(shí)不是緊貼著縱軸，而是位于縱軸上方漫衍。造成這個(gè)“懸在空中現(xiàn)象的緣故原由就是該泳道自身存在著一定的光疏密程度“配景。這個(gè)配景的存在導(dǎo)致該泳道上各個(gè)電泳條帶之間不能處于同一水平舉行相比較；如果思量到相鄰的其它泳道更是因?yàn)椴煌渚暗拇嬖诙鵁o(wú)法相比較不同泳道上的不同電泳條帶。怎樣去除這個(gè)配景呢？我們繼續(xù)看右面的“Lane Backgroud Substruction對(duì)話(huà)框。這個(gè)對(duì)話(huà)框的上方“All Lan

21、es表示可以對(duì)所有泳道舉行一次性處理；下方的“Selected Lane表示僅針對(duì)這次選中的這個(gè)泳道舉行處理我們選中的是第4泳道。我們用鼠標(biāo)選擇“Selected Lane的“Lane On選項(xiàng)。然后鄙人面的“Rolling Disk Size里填上“5，再按“回車(chē)鍵。好！大家再來(lái)看看此刻“Optical Density中出現(xiàn)了一條緊緊沿著光疏密程度曲線(xiàn)漫衍的深赭色曲線(xiàn)。這條曲線(xiàn)將泳道的配景與電泳條帶的光疏密程度漫衍十分準(zhǔn)確的區(qū)分清楚隔來(lái)。 大家可能會(huì)好奇這搭的“Rolling Disk Size指得是啥子意思？我們可以將Quantity One提供的去除配景功能想象成是一個(gè)骨碌的小球。如果這

22、個(gè)小球的半徑越小，那末它沿著光疏密程度曲線(xiàn)骨碌時(shí)滾過(guò)的路徑就越發(fā)精致，具體反映在深赭色曲線(xiàn)的軌跡越發(fā)靠近玄帶顏色的光疏密程度漫衍曲線(xiàn)的基線(xiàn)。因此從理論上來(lái)講“Rolling Disk Size的取值越小，它的去除配景效果越好。大家可以試著選擇一個(gè)較大的值比方80，再來(lái)看看此時(shí)深赭色曲線(xiàn)的軌跡。固然也不能取過(guò)小的值。因?yàn)槿绻≈颠^(guò)小，大家可以想象這個(gè)十分微小的球就會(huì)滾入光疏密程度曲線(xiàn)內(nèi)部，造成有用陽(yáng)性信號(hào)的損失。個(gè)人感覺(jué)520是一個(gè)比較好的取值范圍. OK！我們?cè)僭凇癓ane Backgroud Substruction對(duì)話(huà)框的最下方鉤選“Show Lane Trace with Backgro

23、ud Substructed，再來(lái)看看是否泳道上所有的配景都被消弭了？各個(gè)電泳條帶是否純粹聯(lián)合到縱軸上在同一水平舉行比較了？ 我們對(duì)其它泳道也能夠依葫蘆畫(huà)瓢舉行近是的配景排除工作。如果大家覺(jué)得可以施用同樣的標(biāo)準(zhǔn)，即不異的“Rolling Disk Size舉行排除，那末我們可以在“Lane Backgroud Substruction對(duì)話(huà)框入選擇上方的“All Lanes On(same level)選項(xiàng)。然后在“Rolling Disk Size中填上一個(gè)適宜的值，點(diǎn)擊“Done按鍵確認(rèn)就能夠了。此時(shí)該電泳圖片上所有的泳道都以不異的標(biāo)準(zhǔn)舉行了配景去除。不信你可以本身將鼠標(biāo)點(diǎn)擊其它泳道比方第8

24、道或第1道，你會(huì)創(chuàng)造所有泳道的配景均已去除。 7 - Quantity One的電泳泳道分析功能-相比較泳道 剛剛我們已經(jīng)對(duì)電泳圖片上的泳道舉行了識(shí)別和配景去除。此刻我們可以利用Quantity One提供的泳道相比較功能對(duì)同一X凝膠相片上的不同泳道舉行相比較，看看每條泳道上電泳條帶的漫衍環(huán)境。 - - 泳道相比較：首先將翻開(kāi)的電泳相片舉行前面談到的泳道識(shí)別和去除配景步調(diào)。然后選擇“Lane-pare Lanes號(hào)令，鼠標(biāo)變成“藍(lán)色感慨號(hào)然后將鼠標(biāo)移動(dòng)到您但愿舉行相比較的泳道上比方以下圖的第3泳道，左鍵點(diǎn)擊，Quantity One就會(huì)立刻探出一X玄色配景的“pare Lanes對(duì)話(huà)框。在這個(gè)

25、對(duì)話(huà)框中紅色的曲線(xiàn)代表您選擇的泳道的光疏密程度漫衍曲線(xiàn)。曲線(xiàn)的波峰部門(mén)表示位于泳道上的不同電泳條帶；波峰的凹凸象征電泳條帶光疏密程度值的大??；波峰的寬窄象征電泳條帶的寬度；波峰由左至右表示各個(gè)電泳條帶順著泳道由后向前的漫衍。 大家請(qǐng)注重這個(gè)紅色曲線(xiàn)。它不僅只提供給我們關(guān)于泳道上光疏密程度的漫衍環(huán)境，更重要的是鄙人一步我們對(duì)電泳條帶舉行定量的時(shí)辰，我們將以每個(gè)波峰的曲線(xiàn)下平面或物體外表的大作為定量的標(biāo)準(zhǔn). 我們還可以用鼠標(biāo)點(diǎn)擊其它我們感興趣的泳道比方以下圖中第六、9、14泳道，這時(shí)候再轉(zhuǎn)到“pare Lanes對(duì)話(huà)框我們會(huì)創(chuàng)造Quantity One已經(jīng)幫我們用不同顏色在同一X圖片上繪制出了這4

26、條泳道的相比較圖。是不久短常PP？ 8 - Quantity One的電泳條帶分析功能-創(chuàng)立條帶 前面我們已經(jīng)識(shí)別和分析了電泳圖片的泳道，下面我們起頭研究電泳條帶的問(wèn)題。首先在這搭明確兩個(gè)名詞翻譯：“Lane指電泳泳道；“Band指電泳條帶。鄙人類(lèi)社會(huì)文化中一例施用這兩個(gè)英文名詞來(lái)表示這兩個(gè)意思。 - - 電泳條帶的識(shí)別：和前面研究Lane同樣，首先我們要對(duì)Lane上的Band舉行識(shí)別。識(shí)別方式同樣分為AUTO識(shí)別和人工識(shí)別。AUTO識(shí)別的時(shí)辰選擇“Band-Detect Bands.號(hào)令。這時(shí)候Quantity One會(huì)AUTO彈出一個(gè)“Detect Bands的對(duì)話(huà)框如以下圖。 首屆用Qu

27、antity One的朋友可能會(huì)創(chuàng)造您的Bands識(shí)別以后僅只是畫(huà)出了一條紅色的粗線(xiàn)，而在上邊的演習(xí)圖片中倒是上下括號(hào)的形式。其實(shí)大家可以在“Band-Band Attributes選項(xiàng)中設(shè)置Bands的預(yù)示形式。鄙人方的“Style選項(xiàng)卡入選擇“Brackets就會(huì)將原來(lái)的粗線(xiàn)改為括號(hào)形式了. 在上邊的對(duì)話(huà)框中，我們可以指定識(shí)別的參量。 如果要AUTO識(shí)別所有Lanes上的Bands就鉤選Lands后面的“All選項(xiàng)；如果僅只想AUTO識(shí)別某一條Lane上的Bands就鉤選“One，然后在后面的輸入框中填上您想識(shí)別的泳道； 如果僅只想識(shí)別泳道上部門(mén)光疏密程度值最強(qiáng)的Bands，可以在“Ban

28、ds后面的選項(xiàng)入選擇“Limit，然后填上響應(yīng)的數(shù)目比方10。Quantity One就會(huì)僅識(shí)別該泳道上光疏密程度最大的10條Bands； 如果您創(chuàng)造AUTO識(shí)別的Bands寬度太窄，圈定Band的紅色括號(hào)內(nèi)范圍小于玄色的光疏密程度影。此時(shí)可以施用“Lane Width號(hào)令來(lái)調(diào)整Bands識(shí)別的寬度。用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“Lane Width后面的向上箭頭就會(huì)創(chuàng)造紅色括號(hào)逐漸變寬，最后要求其范圍略為寬過(guò)其包繞的Band影跡； 如果您創(chuàng)造AUTO識(shí)別功能沒(méi)有識(shí)別您想要的Band或誤識(shí)別了您不想要的Band，您還可以施用上邊的工具欄舉行調(diào)整。將您的鼠標(biāo)指向每個(gè)圖標(biāo)，Quantity One就會(huì)懂得彈出一個(gè)*

29、的提示信息告訴您這個(gè)按鍵的功能。在此再也不繼續(xù)闡述了。 9 - Quantity One的電泳條帶分析功能-高斯建模與結(jié)果分析 此刻我們已經(jīng)完成為了泳道識(shí)別、配景去除、條帶識(shí)別的任務(wù)。接下來(lái)我們要對(duì)Bands舉行一些處理，然后就能夠舉行最終的結(jié)果分析了。 - - 高斯建模：大家學(xué)過(guò)計(jì)數(shù)學(xué)知識(shí)后都懂得高斯Gauss漫衍是個(gè)啥子意思，在此我就未幾作解釋了。Quantity One認(rèn)為一個(gè)理想狀態(tài)的Band內(nèi)部的光疏密程度漫衍應(yīng)該也服從高斯曲線(xiàn)的特性，正如前面向大家展示的3D Viewer中的圖片那樣。在我們同樣平常的電泳泳道中時(shí)常出現(xiàn)幾個(gè)相隔很近的Bands即份子量很接近的幾個(gè)卵白或核酸在泳道的某

30、個(gè)區(qū)域成串出現(xiàn)。此時(shí)我們很難經(jīng)由過(guò)程會(huì)自等高線(xiàn)的措施準(zhǔn)確的描繪出每條Band自力的輪廓。這個(gè)時(shí)辰我們就需要對(duì)這些擁擠在一路的Bands舉行高斯建模處理。Quantity One能夠依據(jù)高斯曲線(xiàn)的特性，配合有用的配景去除，將各條緊靠在一路、界限彼此融合的Bands描繪成具有自力光疏密程度漫衍的彼此疊合的曲線(xiàn)。如以下圖所示，原來(lái)彼此融合的22、23兩條Bands經(jīng)過(guò)高斯建模然后變成為了兩個(gè)具有自力漫衍曲線(xiàn)，彼此疊合的Bands。 高斯建模必需建立在有用的泳道配景去除然后。配景去除的方法可以參見(jiàn)我們前面的方法，即經(jīng)由過(guò)程“Lane-Lane Backgrouds的方式舉行去除配景。去除配景的時(shí)辰最正

31、確選擇Rolling Disk Size小一些的方案。這樣配景去除后的光疏密程度漫衍曲線(xiàn)和高斯建模后的光疏密程度漫衍曲線(xiàn)才氣比較好的吻合。另外高斯建模其實(shí)不是一個(gè)必需的步調(diào)。它僅只在出現(xiàn)多條Bands嚴(yán)密擺列在一路，以至于無(wú)法分辯它們之間的間隔的時(shí)辰才最有用。如果Bands在泳道上松散的漫衍那么可以不施用高斯建模. 那末怎樣舉行高斯建模呢？很簡(jiǎn)單！只要執(zhí)行“Band-Gauss Model Bands.號(hào)令就能夠，執(zhí)行后Quantity One回彈出一個(gè)對(duì)話(huà)框問(wèn)您要對(duì)那條泳道舉行高斯建模。請(qǐng)鉤選“One，然后再輸入需要建模的泳道代碼就能夠了比方以下圖中的第2泳道；如果選擇了“All那么對(duì)所有泳

32、道舉行高斯建模，固然建模這么多泳道會(huì)費(fèi)一點(diǎn)兒時(shí)間了。 - - 觀察結(jié)果：執(zhí)行完高斯建模以后施用“Band-Band Information號(hào)令來(lái)觀察結(jié)果。方法是將變成藍(lán)色驚嘆號(hào)的鼠標(biāo)移到剛剛已經(jīng)識(shí)別的Band的部位，一個(gè)詳細(xì)的“Band Information信息框就會(huì)立刻彈出來(lái)見(jiàn)以下圖。在這幅圖中我們必需注重的是“Trace和/或“Gauss Model Trace，因?yàn)槲覀儎倓傂量嗔税胩炀褪菫榱说玫竭@個(gè)數(shù)據(jù)。這個(gè)數(shù)據(jù)表示的就是Band光疏密程度漫衍曲線(xiàn)下平面或物體外表的大，也就是Quantity One用來(lái)表達(dá)Band內(nèi)份子總量的方式。在這個(gè)信息框中還有一些重要信息比方“Mol Wt份子量

33、；“Quantity/Units等此刻照舊空缺，咱們下以后的分析步調(diào)中將逐漸填滿(mǎn)它們。 Quantity One有一點(diǎn)兒讓人感到很半大白。它的“Trace和“Gauss Model Trace都是表示曲線(xiàn)下平面或物體外表的大的，可是施用的單元是OD*mm；而在另外的等高線(xiàn)定量方法中，同樣是表示某個(gè)區(qū)域平面或物體外表的大的單元倒是OD*mm2. 下面讓我們回過(guò)甚來(lái)看看高斯建模然后電泳圖片的分析結(jié)果到盡頭發(fā)生了啥子變化。首先是一X沒(méi)有舉行高斯建模的圖片，大家可以看到在這X圖片中的白框部門(mén)，第2泳道的第6個(gè)band的光疏密程度曲線(xiàn)*部門(mén)其實(shí)不呈高斯對(duì)稱(chēng)少了一部門(mén)不是？。這是因?yàn)樗徊块T(mén)和鄰近的Ban

34、d彼此融合在一路了。 此刻再來(lái)相比較一下經(jīng)過(guò)高斯建模后的電泳圖片分析結(jié)果。照舊在不異位置，這時(shí)候代表第2泳道第6個(gè)Band的*光疏密程度曲線(xiàn)是否呈完備的高斯對(duì)稱(chēng)了？而且后面的“Gauss Model Trace也再也不是“N.A，而變成為了“0.717 OD，相比較上邊的“Trace=0.693 OD，大家想想為啥子要大一些呢？ ！10 - Quantity One的電泳條帶分析功能-份子量預(yù)先推測(cè) 前面我們和大家學(xué)習(xí)了用Quantity One舉行電泳條帶定量的根本方法。此刻我們暫時(shí)轉(zhuǎn)移眼看東西假想線(xiàn)來(lái)探討一下另外一個(gè)功能，份子量預(yù)先推測(cè)。這個(gè)功能對(duì)卵白質(zhì)而言是份子量預(yù)先推測(cè)，對(duì)核酸而言就是

35、核酸大小的預(yù)先推測(cè)了。下面我們照舊以卵白質(zhì)為例來(lái)學(xué)習(xí)。 - - 份子量預(yù)先推測(cè)：首先大家必需懂得的是份子量的預(yù)先推測(cè)是建立在泳道和條帶都已經(jīng)創(chuàng)立好的根蒂根基上。我們只是人為的為一些泳道上的條帶加上一個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)，然后經(jīng)由過(guò)程不同泳道和條帶之間的相比較繪制回歸曲線(xiàn)，經(jīng)由過(guò)程回歸曲線(xiàn)的走歷來(lái)預(yù)先推測(cè)特別指定條帶上的份子的份子量。固然如果我們能夠在一次電泳中多跑幾條不同份子量身分的marker，肯定是能夠提高我們預(yù)先推測(cè)的準(zhǔn)確性。 下面我們談?wù)勗鯓硬僮?。在已?jīng)創(chuàng)立好泳道和條帶的圖片上，執(zhí)行“Match-Standard號(hào)令，在彈出的“Select Standards選項(xiàng)卡入選擇一個(gè)適宜的marker。如

36、果您本身已經(jīng)跑了Marker，那末請(qǐng)選擇“New Standard創(chuàng)立您本身的marker，然后在彈出的“Standard菜譜中輸入您的Marker的份子量。如以下圖在“Standard中輸入一個(gè)名稱(chēng)，然后鄙人面的表格中輸入各個(gè)Marker的份子量和名稱(chēng)。 輸入完成以后用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“Type下面的小箭頭上圖鼠標(biāo)指向的位置，然后把變成綠顏色加號(hào)的鼠標(biāo)移動(dòng)到您的Marker泳道上響應(yīng)的band。例如上圖中200KD就移動(dòng)到第15泳道的200KD的位置，以此類(lèi)推，將每個(gè)Marker都標(biāo)志上響應(yīng)的數(shù)字。標(biāo)志完成后，Maker泳道上的Bands就會(huì)變成藍(lán)色。 如果您有多條Marker泳道，您可以再多表記幾

37、條以提高軟件預(yù)先推測(cè)的準(zhǔn)確性。此刻我們執(zhí)行“Match-Standard Curve，然后用鼠標(biāo)隨便點(diǎn)擊我們想要了解的泳道，Quantity One立刻就會(huì)為我們預(yù)示出一條曲線(xiàn)，當(dāng)中還有一個(gè)小的對(duì)話(huà)框“Std.Curve Options for Proteins，在這個(gè)對(duì)話(huà)框中“Regression Model選擇“Point to Point Semi-log或“Elder-Southern這兩種回歸方式；然后鉤選當(dāng)中的“Show Numerical data of Points，這時(shí)候再看那條曲線(xiàn)上是否已經(jīng)標(biāo)注了很多數(shù)字？這些數(shù)字就是水平方向上對(duì)應(yīng)的Bands的份子量了。 11 - Qua

38、ntity One的電泳條帶分析功能-創(chuàng)立定量標(biāo)準(zhǔn) 上邊說(shuō)明說(shuō)過(guò)，在Band Information中除了“trace和“gauss model trace之外我們還有幾個(gè)工程沒(méi)有填入數(shù)據(jù)。這些其時(shí)未填入的數(shù)據(jù)其實(shí)是“Mol.wt和“Quantity/Unit這2項(xiàng)。剛剛我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了怎樣預(yù)先推測(cè)份子量，大家此刻再用“Band-Band Information號(hào)令看看您感興趣的Band，是否“Mol.wt已經(jīng)被填上數(shù)字了？此刻只剩下“Quantity/Unit，讓我們起頭學(xué)習(xí)怎樣測(cè)定具體的定量值原來(lái)測(cè)定的僅只是光疏密程度值和Band之間的事物的量的比，而沒(méi)有落實(shí)到具體的實(shí)際數(shù)字。 - - 創(chuàng)立

39、定量標(biāo)準(zhǔn)：所謂創(chuàng)立“定量標(biāo)準(zhǔn)其實(shí)近似于剛剛我們?cè)O(shè)置的份子量Marker。只不外這搭我們用Band的事物的量做為Marker，就像用5ul的DL2000跑電泳，每條Band含50ng的雙鏈DNA。具體操作如下：執(zhí)行“Analysis-Quantity Standards，在彈出的“Calibration Curve對(duì)話(huà)框入選擇“Creat New，在隨后的“Quantity Standards對(duì)話(huà)框中填寫(xiě)一系列相干信息。重要的信息包孕： 1.“Units：指作為marker的事物的量的單元，例如ng，ug，mg等等。 2.“Measure：指對(duì)Maker和待測(cè)Band的丈量方式。點(diǎn)擊“Measu

40、re按鍵后可以選擇“Trace Density、“Contour Density、“Peak Density和“Average Density。如果您前面的分析接納的是軌跡法定量的話(huà)可以選擇“Trace Density；如果您接納的是等高線(xiàn)法定量可以接納“Contour Density。 3.“Select：在“Select后面有三個(gè)選項(xiàng)，Band、Match、Lane。選中此中一個(gè)選項(xiàng)比方“band，然后將變成向上小箭頭的鼠標(biāo)指向您本身跑的Marker條帶，點(diǎn)擊左鍵，就會(huì)創(chuàng)造此時(shí)該Band已經(jīng)變成*。您可以多點(diǎn)選幾個(gè)作為Marker的Bands至少3個(gè)，越多越好，然后回到“Quantity Standards框。這時(shí)候框下部的表格變成可填寫(xiě)狀態(tài)，在“Quantity ug中填入響應(yīng)的數(shù)字，每個(gè)數(shù)字對(duì)應(yīng)您剛剛標(biāo)志的作marker的Bands。后面的“Dilution factor項(xiàng)可暫時(shí)不管；其它兩項(xiàng)“Lane和“M