基因工程在環(huán)境污染治理中的應用

1、Founded in 18951/56第第3講講 基因工程在環(huán)境污染治理中的應用基因工程在環(huán)境污染治理中的應用Founded in 18952/561 基因工程基因工程 基因工程是在分子水平上對生物遺傳特性進行人為干預，對基因工程是在分子水平上對生物遺傳特性進行人為干預，對生物基因進行改造，利用生物生產(chǎn)人們需要的特殊產(chǎn)品生物基因進行改造，利用生物生產(chǎn)人們需要的特殊產(chǎn)品 理論上的三大發(fā)現(xiàn)理論上的三大發(fā)現(xiàn) 上世紀上世紀40年代，發(fā)現(xiàn)生物的遺傳物質是年代，發(fā)現(xiàn)生物的遺傳物質是DNA：Avery肺炎雙球菌轉化肺炎雙球菌轉化實驗實驗 50年代，發(fā)現(xiàn)年代，發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結構的雙螺旋結構 60年代，確立

2、遺傳信息的傳遞方式：操作子學說，密碼子破譯年代，確立遺傳信息的傳遞方式：操作子學說，密碼子破譯 技術上的三大發(fā)明技術上的三大發(fā)明 工具酶：核酸內(nèi)切酶，連接酶工具酶：核酸內(nèi)切酶，連接酶 載體：質粒載體：質粒 逆轉錄酶：打破中心法則逆轉錄酶：打破中心法則 1973年，完成了年，完成了DNA的體外重組的體外重組并成功轉化并成功轉化 Founded in 18953/56分子生物學基礎分子生物學基礎 DNA即脫氧核糖核酸，攜帶決定生物遺傳，細胞分即脫氧核糖核酸，攜帶決定生物遺傳，細胞分裂、分化、生長以及蛋白質生物合成等生命信息裂、分化、生長以及蛋白質生物合成等生命信息 DNA分子的基本單位是脫氧核糖核

3、苷酸，由堿基、分子的基本單位是脫氧核糖核苷酸，由堿基、脫氧核糖和磷酸基三部分組成脫氧核糖和磷酸基三部分組成 堿基有四種：堿基有四種：A、G、C、T Founded in 18954/56 堿基攜帶遺傳信息，堿基攜帶遺傳信息，糖和磷酸基起結構作糖和磷酸基起結構作用用 DNA分子的骨架由磷分子的骨架由磷酸二酯鍵連接的多個酸二酯鍵連接的多個脫氧核糖組成脫氧核糖組成 一個脫氧核糖核苷酸一個脫氧核糖核苷酸中五碳糖的中五碳糖的3羥基，羥基，通過一個磷酸二酯鍵通過一個磷酸二酯鍵與鄰近五碳糖的與鄰近五碳糖的5磷磷酸基相連酸基相連 Founded in 18955/56DNA的結構的結構 雙螺旋結構的要點雙螺旋

4、結構的要點 兩鏈平行反向且右兩鏈平行反向且右旋旋 堿基以氫鍵互補配堿基以氫鍵互補配對，對，A=T，GC 螺旋每周含螺旋每周含10個堿個堿基對，每周垂直升基對，每周垂直升高高340nm，螺旋直，螺旋直徑徑200nm 核主鏈在螺旋外側，核主鏈在螺旋外側，堿基對平面在內(nèi)側堿基對平面在內(nèi)側且與主鏈垂直且與主鏈垂直 Founded in 18956/56 雙螺旋模型可以解釋雙螺旋模型可以解釋 細胞減數(shù)分裂與有性生殖：配子與受精卵的形成細胞減數(shù)分裂與有性生殖：配子與受精卵的形成 個體發(fā)育：受精卵的發(fā)育個體發(fā)育：受精卵的發(fā)育 遺傳與變異：堿基序列的保守性、可變性遺傳與變異：堿基序列的保守性、可變性 性狀控制

5、：蛋白質的生物合成性狀控制：蛋白質的生物合成 雙螺旋模型的補充雙螺旋模型的補充 DNA分子雙鏈可以左旋：分子雙鏈可以左旋：Z-DNA DNA分子每圈堿基數(shù)具可變性：分子每圈堿基數(shù)具可變性：A-DNA 發(fā)現(xiàn)三股發(fā)現(xiàn)三股DNA 超螺旋結構普遍存在超螺旋結構普遍存在 Founded in 18957/56堿基配對堿基配對 一條鏈中的一條鏈中的A與另一條鏈中的與另一條鏈中的T配對，配對，G與與C配對，兩配對，兩條鏈中的堿基序列總是互補的條鏈中的堿基序列總是互補的 Founded in 18958/56DNA的復制的復制 從復制起始點開始從復制起始點開始 半保留復制：兩條鏈半保留復制：兩條鏈均可作為新鏈

6、合成的均可作為新鏈合成的模板模板 半不連續(xù)復制：半不連續(xù)復制：DNA序列的方向性序列的方向性 高度的忠實性：自我高度的忠實性：自我校正校正 多種酶和蛋白因子協(xié)多種酶和蛋白因子協(xié)同有序作用同有序作用 Founded in 18959/56DNA的變性、復性與雜交的變性、復性與雜交 加熱或某些試劑可使加熱或某些試劑可使DNA堿基間的氫鍵破壞，雙鏈堿基間的氫鍵破壞，雙鏈發(fā)生分離，此過程稱為變性發(fā)生分離，此過程稱為變性 變性變性DNA在一定條件下能恢復雙螺旋結構，此過程在一定條件下能恢復雙螺旋結構，此過程成為復性成為復性 Founded in 189510/56 G+C含量高的含量高的DNA比較穩(wěn)定，

7、環(huán)狀比較穩(wěn)定，環(huán)狀DNA比線狀穩(wěn)定比線狀穩(wěn)定 Tm值：熔點，值：熔點，DNA發(fā)生半數(shù)變性時的溫度發(fā)生半數(shù)變性時的溫度 通過測定通過測定DNA的的Tm值，可以計算其值，可以計算其G+C含量含量 DNA的復性速度跟其分子大小、復雜程度、濃度、離子強度、的復性速度跟其分子大小、復雜程度、濃度、離子強度、溫度等因素有關溫度等因素有關 Founded in 189511/56DNA的雜交的雜交 復性的復性的DNA分子由不同來源的兩個單鏈分子由不同來源的兩個單鏈DNA分子形分子形成，稱為雜交成，稱為雜交 互補的堿基序列即可發(fā)生雜交，一定條件下也可發(fā)互補的堿基序列即可發(fā)生雜交，一定條件下也可發(fā)生少量的偏差（

8、錯配、缺失）生少量的偏差（錯配、缺失） 利用分子雜交可以求出特定基因的頻率、異源利用分子雜交可以求出特定基因的頻率、異源DNA的相似程度，研究基因組織、基因定位的相似程度，研究基因組織、基因定位 分子雜交廣泛應用于生物工程、核酸結構分析及功分子雜交廣泛應用于生物工程、核酸結構分析及功能探討中，也是研究分子遺傳學的重要手段能探討中，也是研究分子遺傳學的重要手段 Founded in 189512/56中心法則中心法則 除某些病毒外，大多數(shù)生物將其遺傳信息儲存在除某些病毒外，大多數(shù)生物將其遺傳信息儲存在DNA分子中，分子中，功能的實現(xiàn)必須通過蛋白質功能的實現(xiàn)必須通過蛋白質 DNA通過自我通過自我復

9、制復制將遺傳信息代代相傳，并通過將遺傳信息代代相傳，并通過RNA將其傳將其傳給蛋白質給蛋白質 利用利用DNA為模板合成為模板合成RNA的過程叫的過程叫轉錄轉錄 利用利用RNA為模板合成蛋白質的過程叫為模板合成蛋白質的過程叫翻譯翻譯 Founded in 189513/56逆轉錄逆轉錄 以以RNA為模板在逆轉錄酶（依賴于為模板在逆轉錄酶（依賴于RNA的的DNA聚合聚合酶）催化下合成酶）催化下合成DNA的過程成為逆轉錄的過程成為逆轉錄 逆轉錄和逆轉錄酶的發(fā)現(xiàn)，實現(xiàn)了以真核逆轉錄和逆轉錄酶的發(fā)現(xiàn)，實現(xiàn)了以真核mRNA為為模板，通過逆轉錄而獲得為特定蛋白質編碼的基因模板，通過逆轉錄而獲得為特定蛋白質編

10、碼的基因 利用逆轉錄酶所建立的利用逆轉錄酶所建立的cDNA文庫為基因的分離和重文庫為基因的分離和重組提供了重要手段組提供了重要手段 Founded in 189514/56基因工程概要基因工程概要 基因工程又稱基因工程又稱DNA重組技術，是在分子水平上對基重組技術，是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術，其實施的四個必要條件是：因進行操作的復雜技術，其實施的四個必要條件是：工具酶工具酶，基因基因，載體載體，受體細胞受體細胞 基因工程的特征基因工程的特征 外源核酸分子在寄主生物中能夠表達外源核酸分子在寄主生物中能夠表達 確定的確定的DNA小片段在寄主細胞中能夠大量擴增小片段在寄主細胞中能夠大量擴

11、增 基因工程包括基因的分離、重組、轉移以及基因在基因工程包括基因的分離、重組、轉移以及基因在受體細胞內(nèi)的保持、轉錄、翻譯表達等全過程受體細胞內(nèi)的保持、轉錄、翻譯表達等全過程 Founded in 189515/56基因工程的實驗步驟基因工程的實驗步驟 帶有目的基因的帶有目的基因的DNA片片段的獲取段的獲取 在體外將帶有目的基因在體外將帶有目的基因的的DNA片段連接到載體片段連接到載體上，形成重組上，形成重組DNA分子分子 重組重組DNA分子導入受體分子導入受體細胞細胞 帶有重組體的細胞擴增帶有重組體的細胞擴增 重組體的篩選重組體的篩選 Founded in 189516/56基因工程工具酶基因

12、工程工具酶 把把DNA分子切割、分子切割、DNA片段修飾和片段修飾和DNA片段連接等片段連接等所需的酶成為工具酶所需的酶成為工具酶 根據(jù)其用途可分為三大類根據(jù)其用途可分為三大類 限制性內(nèi)切酶：識別和切割限制性內(nèi)切酶：識別和切割dsDNA分子內(nèi)特殊核苷酸順序分子內(nèi)特殊核苷酸順序的酶，通過水解的酶，通過水解DNA分子骨架的磷酸二酯鍵，將完整的分子骨架的磷酸二酯鍵，將完整的DNA分子切開分子切開 連接酶：將兩段乃至數(shù)段連接酶：將兩段乃至數(shù)段DNA片段拼接起來的酶，催化磷片段拼接起來的酶，催化磷酸二酯鍵的形成酸二酯鍵的形成 修飾酶：包括修飾酶：包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、聚合酶、逆轉錄酶、T4多核苷酸

13、酶、堿多核苷酸酶、堿性磷酸酶等性磷酸酶等 Founded in 189517/56限制性內(nèi)切酶的作用限制性內(nèi)切酶的作用Founded in 189518/56T4DNA酶的連接原理酶的連接原理Founded in 189519/56基因工程載體基因工程載體 能夠獨立于宿主細胞染色體之外復制的能夠獨立于宿主細胞染色體之外復制的DNA片段即片段即是載體是載體 載體能將外源載體能將外源DNA片段帶入受體細胞，并決定外源片段帶入受體細胞，并決定外源基因的復制、擴增、傳代乃至表達基因的復制、擴增、傳代乃至表達 常見的載體有質粒和病毒常見的載體有質粒和病毒 天然質粒和病毒要加以改造，增加耐藥性基因片段，天

14、然質粒和病毒要加以改造，增加耐藥性基因片段，以利于提高基因的轉化、篩選和表達效率以利于提高基因的轉化、篩選和表達效率 Founded in 189520/56載體的必備條件載體的必備條件 能夠進入宿主細胞：個體小，不具備獨立生存的能能夠進入宿主細胞：個體小，不具備獨立生存的能力力 在宿主細胞中能夠獨立復制，即本身是一個復制子：在宿主細胞中能夠獨立復制，即本身是一個復制子：插入外源插入外源DNA片段的大小和數(shù)量不能破壞載體的復片段的大小和數(shù)量不能破壞載體的復制能力，載體要實現(xiàn)多拷貝制能力，載體要實現(xiàn)多拷貝 要有篩選標記：抗藥性要有篩選標記：抗藥性 對多種限制酶有單一或較少的切點對多種限制酶有單一

15、或較少的切點 隨著隨著DNA重組技術的改進，引入外源重組技術的改進，引入外源DNA進入宿主進入宿主的方法有改進，已經(jīng)突破了原有的大小限制；選擇的方法有改進，已經(jīng)突破了原有的大小限制；選擇標記也可以被雜交技術、免疫學技術等替代標記也可以被雜交技術、免疫學技術等替代 Founded in 189521/56載體的分類載體的分類 克隆載體：是以繁殖克隆載體：是以繁殖DNA片段為目的的載體，復制力強，拷片段為目的的載體，復制力強，拷貝數(shù)高貝數(shù)高 穿梭載體：既能在真核細胞中繁殖又能在原核細胞中繁殖，穿梭載體：既能在真核細胞中繁殖又能在原核細胞中繁殖，具有真核和原核兩種復制點，常用于真核生物具有真核和原核

16、兩種復制點，常用于真核生物DNA片段在原片段在原核生物中的繁殖，然后再轉入真核細胞宿主核生物中的繁殖，然后再轉入真核細胞宿主 表達載體：能夠在宿主中進行高效表達表達載體：能夠在宿主中進行高效表達 理想情況：拷貝數(shù)高，具有強啟動子和穩(wěn)定的理想情況：拷貝數(shù)高，具有強啟動子和穩(wěn)定的mRNA，具有，具有高的分離穩(wěn)定性和結構穩(wěn)定性，轉化頻率高，宿主范圍廣，高的分離穩(wěn)定性和結構穩(wěn)定性，轉化頻率高，宿主范圍廣，插入外源基因容量大而且可以重新完整的切除，復制與轉錄插入外源基因容量大而且可以重新完整的切除，復制與轉錄應和宿主相匹配，最好是可調控的，而且在宿主不生長或低應和宿主相匹配，最好是可調控的，而且在宿主不

17、生長或低生長速率的情況下，仍能高水平的表達目的基因生長速率的情況下，仍能高水平的表達目的基因 Founded in 189522/56常用的載體常用的載體 質粒：環(huán)狀雙鏈小型質粒：環(huán)狀雙鏈小型DNA分子，可用于細菌細胞，分子，可用于細菌細胞，也可用于動植物細胞也可用于動植物細胞 噬菌體：常用于細菌細胞噬菌體：常用于細菌細胞 病毒：常用于動物細胞病毒：常用于動物細胞 粘粒：由質粒和噬菌體結合構建成的一種大容量克粘粒：由質粒和噬菌體結合構建成的一種大容量克隆載體隆載體 Founded in 189523/56用于原核生物宿主的載體用于原核生物宿主的載體質粒質粒 質粒是能自主復制的雙鏈環(huán)狀質粒是能自

18、主復制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，在細菌中分子，在細菌中獨立于染色體存在，其復制和遺傳獨立，但依賴于獨立于染色體存在，其復制和遺傳獨立，但依賴于宿主所編碼的蛋白質和酶宿主所編碼的蛋白質和酶 pUC 19pUC 19的結構圖譜的結構圖譜 pBR 322pBR 322的結構圖譜的結構圖譜 Founded in 189524/56外源基因克隆如質粒載體的過程外源基因克隆如質粒載體的過程Founded in 189525/56用于原核生物宿主的載體用于原核生物宿主的載體噬菌體噬菌體 噬菌體內(nèi)含雙鏈環(huán)形、單鏈環(huán)形、雙鏈線形、單鏈噬菌體內(nèi)含雙鏈環(huán)形、單鏈環(huán)形、雙鏈線形、單鏈線形等多種形式、大小不一的線形等多種形

19、式、大小不一的DNA，且感染率高，且感染率高 噬菌體含有線性雙鏈噬菌體含有線性雙鏈DNA分子，兩端有互補粘性末分子，兩端有互補粘性末端，進入宿主細胞后可連接成為環(huán)狀分子；屬溫和端，進入宿主細胞后可連接成為環(huán)狀分子；屬溫和噬菌體，噬菌體，DNA可整合到宿主細胞染色體可整合到宿主細胞染色體DNA上，隨上，隨染色體復制而復制；可承載較大的外源染色體復制而復制；可承載較大的外源DNA片段；片段；宿主細胞中有大量供噬菌體包裝用的殼蛋白；有多宿主細胞中有大量供噬菌體包裝用的殼蛋白；有多個限制性內(nèi)切酶的識別序列個限制性內(nèi)切酶的識別序列 Founded in 189526/56噬菌體噬菌體Founded in

20、 189527/56用于真核生物宿主的載體用于真核生物宿主的載體人工載體人工載體 具有大腸桿菌質粒的抗具有大腸桿菌質粒的抗藥性和噬菌體的強感染藥性和噬菌體的強感染力，同時能夠攜帶真核力，同時能夠攜帶真核生物大片段生物大片段DNA的目的的目的基因基因 如柯斯質粒載體（粘質如柯斯質粒載體（粘質粒載體），既可按質粒粒載體），既可按質粒載體的性質轉化受體菌，載體的性質轉化受體菌，并在其中復制，又可以并在其中復制，又可以按照按照噬菌體性質，進噬菌體性質，進行體外包裝轉導受體細行體外包裝轉導受體細胞胞 Founded in 189528/56用于真核生物宿主的載體用于真核生物宿主的載體 大多是穿梭質粒，既

21、可在原核細胞中復制擴增，也大多是穿梭質粒，既可在原核細胞中復制擴增，也可以在真核細胞中擴增、表達可以在真核細胞中擴增、表達 酵母質粒：來自釀酒酵母酵母質粒：來自釀酒酵母 人工染色體載體：能夠承載更大的外源基因人工染色體載體：能夠承載更大的外源基因 酵母人工染色體：在酵母細胞中克隆外源酵母人工染色體：在酵母細胞中克隆外源DNA大片段克隆大片段克隆體系，外源體系，外源DNA容量為容量為1000kb 細菌人工染色體：以細菌細菌人工染色體：以細菌F因子為基礎組建的細菌克隆體因子為基礎組建的細菌克隆體系，外源系，外源DNA容量為容量為300kb Founded in 189529/56用于植物宿主的載體

22、用于植物宿主的載體 由于植物細胞的特殊性，外源基因導入植物細胞的由于植物細胞的特殊性，外源基因導入植物細胞的方法十分有限方法十分有限 Ti質粒：能夠進入植物細胞并能整合到植物染色體質粒：能夠進入植物細胞并能整合到植物染色體DNA分分子中，但其分子太長、限制性酶切位點多，易導致宿主產(chǎn)子中，但其分子太長、限制性酶切位點多，易導致宿主產(chǎn)生不分化的不良植株生不分化的不良植株 植物植物DNA病毒：宿主范圍窄，可插入片段短，易丟失，插病毒：宿主范圍窄，可插入片段短，易丟失，插入外源入外源DNA后感染力下降，使用很少后感染力下降，使用很少 植物轉座子：在生物體基因組中可從一個基因座位轉移到植物轉座子：在生物

23、體基因組中可從一個基因座位轉移到另一個基因座位，有望成為新的植物載體另一個基因座位，有望成為新的植物載體 Founded in 189530/56用于動物宿主的載體用于動物宿主的載體 哺乳動物細胞用于外源哺乳動物細胞用于外源DNA表達采用的載體很有限，表達采用的載體很有限，主要是猿猴空泡病毒主要是猿猴空泡病毒40（SV40） 含雙鏈環(huán)狀含雙鏈環(huán)狀DNA，只能插入，只能插入2.5kb的外源基因的外源基因 感染宿主主要為猴細胞，容易產(chǎn)生有危險的野生型感染宿主主要為猴細胞，容易產(chǎn)生有危險的野生型 RNA病毒、痘病毒、人腺病毒、乳頭瘤病毒等也可病毒、痘病毒、人腺病毒、乳頭瘤病毒等也可用于動物宿主的病毒

24、載體用于動物宿主的病毒載體 Founded in 189531/56原核生物目的基因的獲得原核生物目的基因的獲得 基因庫的構建：將基因庫的構建：將總總DNA酶解獲得包酶解獲得包含所有基因的含所有基因的DNA片段集，將每一個片段集，將每一個片段與載體連接并片段與載體連接并分別導入受體細胞，分別導入受體細胞，可得到所有的包含可得到所有的包含該生物體全套基因該生物體全套基因的庫的庫 Founded in 189532/56 基因文庫的篩選基因文庫的篩選 通過免疫反應篩選通過免疫反應篩選 通過通過DNA分子雜交篩選分子雜交篩選 Founded in 189533/56真核生物目的基因的獲得真核生物目的

25、基因的獲得 cDNA文庫文庫的建立：的建立：細胞全部細胞全部mRNA逆逆轉錄成轉錄成cDNA并被并被克隆的總克隆的總和和 基因組基因組DNADNA文庫及文庫及cDNAcDNA文庫組建圖文庫組建圖 Founded in 189534/56 DNA的化學合成：把新的脫氧核糖核苷酸加到的化學合成：把新的脫氧核糖核苷酸加到DNA雙鏈的雙鏈的5端，與細胞中端，與細胞中DNA分子合成的方向相反；分子合成的方向相反；目前常用的是磷酰胺法目前常用的是磷酰胺法 PCR法：體外通過酶促反應快速擴增特異法：體外通過酶促反應快速擴增特異DNA片段片段 有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列互補的有與被分離的目的基因兩條

26、鏈各一端序列互補的DNA引物引物 具有熱穩(wěn)定性的酶具有熱穩(wěn)定性的酶 dNTP作為底物作為底物 有作為模板的目的有作為模板的目的DNA序列序列 Founded in 189535/56目的基因的轉移目的基因的轉移 重組重組DNA進入受體的過程叫轉化，得到重組進入受體的過程叫轉化，得到重組DNA的的細胞叫受體細胞細胞叫受體細胞 選擇合適的受體細胞：轉化效率高、穩(wěn)定傳代、易選擇合適的受體細胞：轉化效率高、穩(wěn)定傳代、易篩選、外源基因可高效表達和穩(wěn)定積累；原核生物篩選、外源基因可高效表達和穩(wěn)定積累；原核生物如大腸桿菌，真核細胞如酵母菌和枯草芽孢桿菌如大腸桿菌，真核細胞如酵母菌和枯草芽孢桿菌 選擇合適的載

27、體：具有強啟動子、便于連接、適合選擇合適的載體：具有強啟動子、便于連接、適合受體細胞受體細胞 選擇合適的導入方法：氯化鈣導入法、電穿孔法、選擇合適的導入方法：氯化鈣導入法、電穿孔法、噬菌體導入法、其他方法噬菌體導入法、其他方法 Founded in 189536/56重組體的篩選重組體的篩選 傳統(tǒng)生物學方法傳統(tǒng)生物學方法 遺傳學方法：抗性篩選遺傳學方法：抗性篩選插入失活檢測，直接篩選；營插入失活檢測，直接篩選；營養(yǎng)缺陷互補篩選養(yǎng)缺陷互補篩選藍白篩選藍白篩選 免疫學方法：有目的蛋白的抗體免疫學方法：有目的蛋白的抗體 利用噬菌斑篩選利用噬菌斑篩選 核酸雜交法：利用放射性同位素標記的核酸雜交法：利用

28、放射性同位素標記的DNA或或RNA作探針進行核酸雜交，進行重組體的篩選與鑒定作探針進行核酸雜交，進行重組體的篩選與鑒定 原位雜交原位雜交 點雜交點雜交 Southern雜交（印跡技術）雜交（印跡技術） Founded in 189537/56利用抗生素抗性基因篩選重組體利用抗生素抗性基因篩選重組體Founded in 189538/56原位菌落雜交篩選原位菌落雜交篩選Founded in 189539/56Southern雜交原理雜交原理Founded in 189540/56DNA序列分析序列分析 Maxam-Gilbert化學降解法化學降解法 用特異的化學試劑修飾用特異的化學試劑修飾DNA

29、分子中的不同堿基，然后用哌分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷多核苷酸鏈，通過凝膠電泳分離不同長度的寡核苷啶切斷多核苷酸鏈，通過凝膠電泳分離不同長度的寡核苷酸，對照四組不同反應所產(chǎn)生的電泳帶的位置，讀出序列酸，對照四組不同反應所產(chǎn)生的電泳帶的位置，讀出序列 一輪反應只能測定約一輪反應只能測定約250bp的序列的序列 Sanger雙脫氧法（酶法）雙脫氧法（酶法） 加入雙脫氧核苷酸后，加入雙脫氧核苷酸后，DNA鏈的合成終止，將隨機終止的鏈的合成終止，將隨機終止的和全合成的和全合成的DNA鏈進行電泳分離，可確定堿基的分布鏈進行電泳分離，可確定堿基的分布 確定確定A、G、C、T四種堿基的全部序列四種堿基的

30、全部序列 光學檢測，適用于自動測序光學檢測，適用于自動測序 Founded in 189541/56Maxam-Gilbert法測序原理及法測序原理及G反應反應Founded in 189542/56雙脫氧核苷酸的結構及其終止雙脫氧核苷酸的結構及其終止DNA合成合成Founded in 189543/56Sanger雙脫氧測序法雙脫氧測序法Founded in 189544/562 基因工程在環(huán)境污染治理中的應用基因工程在環(huán)境污染治理中的應用 合成有機化合物難于生物降解或降解緩慢合成有機化合物難于生物降解或降解緩慢 基因工程通過改變細胞內(nèi)的關鍵酶或酶系統(tǒng)，可以基因工程通過改變細胞內(nèi)的關鍵酶或酶

31、系統(tǒng)，可以 提高微生物的降解速率提高微生物的降解速率 拓寬底物的專一性范圍拓寬底物的專一性范圍 維持低濃度下的代謝活性維持低濃度下的代謝活性 形成降解有毒污染物的新型催化活性形成降解有毒污染物的新型催化活性 改善微生物的生物學特性改善微生物的生物學特性 Founded in 189545/56形成降解有毒污染物的新型催化活性形成降解有毒污染物的新型催化活性Founded in 189546/56改善微生物的生物學特性改善微生物的生物學特性Founded in 189547/56微生物基因改造的主要目標及手段微生物基因改造的主要目標及手段 設計復合代謝途徑設計復合代謝途徑 代謝工程，利用分子生物

32、學原理系統(tǒng)分析細胞代謝網(wǎng)絡，并代謝工程，利用分子生物學原理系統(tǒng)分析細胞代謝網(wǎng)絡，并通過通過DNA重組技術合理設計細胞代謝途徑及進行遺傳修飾，重組技術合理設計細胞代謝途徑及進行遺傳修飾，進而完成細胞特性改造進而完成細胞特性改造 利用對不同底物具有降解活性的酶的組合構建新的復合代謝利用對不同底物具有降解活性的酶的組合構建新的復合代謝途徑，已應用于鹵代芳烴、烷基苯乙酸等的降解途徑，已應用于鹵代芳烴、烷基苯乙酸等的降解 通過引入編碼新酶的活性基因，或對現(xiàn)有的基因物質進行改通過引入編碼新酶的活性基因，或對現(xiàn)有的基因物質進行改造、重組，構建新的微生物，可用于氯代芳烴混合物的降解造、重組，構建新的微生物，可

33、用于氯代芳烴混合物的降解 某假單胞菌可利用某假單胞菌可利用TNT（2,4,6-三硝基甲苯）為唯一氮源，三硝基甲苯）為唯一氮源，但不能進一步降解其代謝產(chǎn)物甲苯、氨基甲苯和硝基甲苯；但不能進一步降解其代謝產(chǎn)物甲苯、氨基甲苯和硝基甲苯；將具有甲苯完整降解途徑的質粒導入微生物，并對其進一步將具有甲苯完整降解途徑的質粒導入微生物，并對其進一步修飾消除其硝酸鹽還原反應，使得修飾消除其硝酸鹽還原反應，使得TNT可以完全降解可以完全降解 Founded in 189548/56 拓寬氧化酶的專一性拓寬氧化酶的專一性 將兩種雙氧合酶不同將兩種雙氧合酶不同組分的編碼基因混合，組分的編碼基因混合，構建復合酶體系，使

34、構建復合酶體系，使其實現(xiàn)對聯(lián)苯和甲苯其實現(xiàn)對聯(lián)苯和甲苯的同時降解的同時降解 雜合多組分雙氧合酶雜合多組分雙氧合酶還可實現(xiàn)對三氯乙烯還可實現(xiàn)對三氯乙烯的降解的降解 綜合不同來源的聯(lián)苯綜合不同來源的聯(lián)苯雙氧合酶的優(yōu)勢，可雙氧合酶的優(yōu)勢，可以實現(xiàn)對多氯聯(lián)苯的以實現(xiàn)對多氯聯(lián)苯的廣譜、高效降解廣譜、高效降解 甲苯甲苯- -聯(lián)苯雙氧復合酶的復合組成聯(lián)苯雙氧復合酶的復合組成 Founded in 189549/56基因工程微生物的應用基因工程微生物的應用增強無機磷的去除增強無機磷的去除 磷是水體富營養(yǎng)化的重要因素，活性污泥法只能去磷是水體富營養(yǎng)化的重要因素，活性污泥法只能去除城市廢水中除城市廢水中20-40

35、%的無機磷的無機磷 大腸桿菌中控制磷積累和聚磷酸鹽形成的磷酸鹽專大腸桿菌中控制磷積累和聚磷酸鹽形成的磷酸鹽專一輸運系統(tǒng)和一輸運系統(tǒng)和polyP激酶由激酶由pst操縱子編碼操縱子編碼 通過對通過對polyP激酶編碼基因激酶編碼基因ppk和用于再生和用于再生ATP的乙的乙酸激酶編碼基因酸激酶編碼基因ack A進行基因擴增，可以有效提高進行基因擴增，可以有效提高菌體對無機磷的去除能力菌體對無機磷的去除能力 Founded in 189550/56Founded in 189551/56基因工程微生物的應用基因工程微生物的應用苯及烷基取代苯的降解苯及烷基取代苯的降解 甲苯降解酶具有廣泛的底物范圍，但無法利用苯甲苯降解酶具有廣泛的底物范圍，但無法利用苯 克隆編碼甲苯還原酶的基因克隆編碼甲苯還原酶的基因todC1C2BA，并將重組質粒導入，并將重組質粒導入P. putida mt-2中，可以徹底降解苯中，可以徹底降解苯/甲苯甲苯/二甲苯二甲苯 甲苯的降解途徑甲苯的降解途徑 Founded in 189552/56基因工程微生物的應用基因工程微生物的應用苯酚類污染物的降解苯酚類污染物的降解 4-壬基苯酚的中間代謝物壬基苯酚的中間代謝物4-乙酰苯酚會發(fā)生積累，在乙酰苯酚會發(fā)生積累，在酵母酵母Candida aquaetextoris中引入苯酚羥化酶