目的基因的獲得

1、會(huì)計(jì)學(xué)1目的基因的獲得目的基因的獲得成。載體能夠容載的載體能夠容載的DNADNA片斷大小片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。需要的重組子的數(shù)目。 載體系列：載體系列： 容量為容量為 24 kp cosmid載體：載體： 容量為容量為 50 kb YAC： 容量為容量為 1 Mb BAC: 容量為容量為 300 kbB a m H IM b o IO HPO HH O脫 磷 酸 化重 組 D N AT 4 連 接 酶轉(zhuǎn) 化 E . c o l i基 因 組 文 庫(kù)總 D N AH i n d I I IB a m H IS a l IE c o

2、 R IP s t IS c a IT cA m pRRp B R 3 2 2( 4 . 3 6 k b )O r iH i n d I I IE c o R IP s t IS c a IA m pRO r iS a l I 用質(zhì)粒載體用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)的流程的流程該法簡(jiǎn)單、快該法簡(jiǎn)單、快速、易于操作，但速、易于操作，但僅適合一些低等真僅適合一些低等真核生物和原核生物核生物和原核生物。用用噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的流程噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的流程用用黏粒黏粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的流程載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的流程用酵母人工染色體構(gòu)建基因組文庫(kù)的流程用酵母人工染色體構(gòu)建基因組文庫(kù)

3、的流程用酵母人工染色體構(gòu)建基因組文庫(kù)的流程用酵母人工染色體構(gòu)建基因組文庫(kù)的流程克隆片段易于從載體分子上完整卸下。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選。5.重組克隆的挑選和保存。超聲波300bp，劇烈攪拌：8Kb 部分酶切完全酶切酶法分離特定大小分離特定大小DNADNA片段片段DNADNA的不完全酶切的不完全酶切目的片段低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段低熔點(diǎn)瓊脂糖回收接上人工接頭接上人工接頭粘性末端粘性末端各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買(mǎi)。各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買(mǎi)。粘性末端粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶15kb= 2 105個(gè)克隆f插入片段大小與基因組DNA大小比值N =Ln(1 P)Ln(

4、1 f) ln( 1-0.99) ln1-(2104/4.6106)Nhuman= = 6.9 105 ln(1-0.99) ln1-(2 104/3 109) 這個(gè)例子說(shuō)明用質(zhì)粒載體（插入片斷這個(gè)例子說(shuō)明用質(zhì)粒載體（插入片斷5-10kb ）就可以建立）就可以建立很好的原核生物基因文庫(kù)，只需要幾千個(gè)克隆；而真核生物則很好的原核生物基因文庫(kù)，只需要幾千個(gè)克??；而真核生物則需要更大承載能力的載體。需要更大承載能力的載體。N E.coli=1.1 103For example : 期望值為期望值為0.99，插入片斷為，插入片斷為20kb的的 E.coli (4.6106 bp) 和和 human (

5、3109 bp) 基因組的克隆數(shù)的計(jì)算基因組的克隆數(shù)的計(jì)算克隆片段克隆片段平均大小平均大?。╞p）基因組大小基因組大小/bp2106（細(xì)菌）（細(xì)菌）2107 （真菌）（真菌）2109（動(dòng)物）（動(dòng)物）理論克理論克隆數(shù)隆數(shù)實(shí)際克隆實(shí)際克隆數(shù)數(shù)理論克隆理論克隆數(shù)數(shù)實(shí)際克隆數(shù)實(shí)際克隆數(shù)理論克隆數(shù)理論克隆數(shù)實(shí)際克隆數(shù)實(shí)際克隆數(shù)5103400183140001841860000027631101010320091920009208300000138155020103100458100046031500006907744010350278500230075000345 386基因組文庫(kù)應(yīng)具有的克隆子數(shù)基因組

6、文庫(kù)應(yīng)具有的克隆子數(shù)缺點(diǎn)：因文庫(kù)菌落生長(zhǎng)的不均勻性而導(dǎo)致文庫(kù)中某些特定的序列過(guò)多或過(guò)少。存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過(guò)多，工作量大約15000種不同的mRNA分子?？梢?jiàn)，由mRNA出發(fā)的cDNA克隆，其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆簡(jiǎn)單得多。mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 3 3 5 5 5 5 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶引物引物cDNA library利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱(chēng)cDNA文庫(kù)。cDNAcDNA文庫(kù)既有種屬特異性，也有組織特異性。文庫(kù)既有種屬特異性，也有組織特異性?；蛱禺愋?、基因特異性、 器官特異性、器官特異性、

7、 代謝或發(fā)育特異性代謝或發(fā)育特異性基因重組基因重組反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNAmRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離純化Column（柱）分離mRNA用商業(yè)化的Oligo dT纖維柱。mRNAmRNA的分離純化的分離純化反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 5 5 AAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTOligo dTOligo dT引物引物mRNAmRNAcDNAcDNA3 3 5 5 5 5 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶引物引物mRNAmRNAcDNAcDNA第一鏈第一鏈3 3 3 3 5 5 5 5 引物引物cDNAcDNA第一鏈第一鏈3 3

8、5 5 引物引物或或RNaseHRNaseH堿堿cDNA第一鏈第一鏈5 cDNA第二鏈合成第二鏈合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一鏈第一鏈cDNA第二鏈第二鏈5 3 核酸酶核酸酶S1cDNA第一鏈第一鏈cDNA第二鏈第二鏈5 3 cDNA第一鏈第一鏈cDNA第二鏈第二鏈5 3 5 3 1 1自身引導(dǎo)法自身引導(dǎo)法mRNAcDNA第一鏈第一鏈3 5 引物引物mRNAcDNA第一鏈第一鏈3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA第二鏈第二鏈cDNA第一鏈第一鏈3 5 RNaseHDNA ligase去引物去引物置換合成法置換合成法p U C 1 9S IS mPH1 )

9、 S a c I2 ) T d T + d T T P1 ) P s t I2 ) T d T + d G T PEES mPH1 ) S m a I2 ) 分離大片段1 ) H i n d I I I2 ) 分離小片段退火堿解 退火 連接T d T +d C T P2 ) 分離大片段1 ) H i n d I I IK l e n o w 片段+ d N T PT 4 l i g a s eA M V - R T+ d N T PEPHT T T TG G G GC C C CT T T TT T T TG G G GC C C CC C C CA A A AA A A AT T T TA

10、A A AT T T TA A A AT T T TA A A AT T T TA A A AT T T TA A A AT T T TG G G GC C C C5 G G G GC C C CG G G GOkayama-Berg cDNA文庫(kù)構(gòu)建文庫(kù)構(gòu)建1 ) P s t I2 ) T d T + d G T PS m a I退 火G G G GG G G GG G G GP o l I K + d N T PT 4 D N Al i g a s eT T T TA A A AC C C CG G G GC C C CG G G GC C C CG G G GC C C CG G G G

11、C C C CG G G GT T T TA A A AT T T TA A A AT T T TA A A AA A A AA A A AC C C C堿 解( d T )1 2 - 1 8A M V - R T d N T PU C 1 9OkayamaBerg改進(jìn)法改進(jìn)法cDNA Library Construction KitGG GCCCpolyA LD PCR( 50 ng of total RNA )PC R-Select cDN AsubtractionEnriched full-length ds cDN ASfi I digestionSfi IASfi IBleft ar

12、mright armSfi IASfi IBPackagingprim er extension(1g of poly A RNA )+Fractionation &ligation intoTrip Iex2arm sTM51SM ART M ethodGGGPoly A+RN APolyA M odified oligo(dT)Prim erFirst-strand synthesiscoupled w ith(dC)tailing by RTGGGpolyATem plate switchingand extension by RTGG GCCCpolyAAm plify cD

13、NA by LD PCRH igh-quality ds cD NAcDN A libraryconstruction VirtualN orthern bolts5131C DN A libraryInTripIEx25151CCC3 PCR法構(gòu)建法構(gòu)建cDNA文庫(kù)文庫(kù)N=ln (1-p)ln (1- 1n)p: 文庫(kù)包含了完整文庫(kù)包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）: 某一種低豐度（不足某一種低豐度（不足14份拷貝）份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n基因組基因組DNA文庫(kù)與文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較文庫(kù)

14、的比較cDNA文庫(kù)可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。cDNA克隆還可用于真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能在cDNA文庫(kù)中，相應(yīng)于高豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來(lái)比較容易，而相應(yīng)于低豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。體內(nèi)，對(duì)某些先天性遺傳疾病進(jìn)行治療。目的基因包括蛋白（酶）基因、抗逆性相關(guān)基因、生物藥和保健品相關(guān)基因、毒物講解相關(guān)的基因等。55TTGACATTGACATATAATTATAATA/GA/G3333AACTGTAACTGTATATTAATATTAT/CT/C55-35-35序列序列-10-10序列序列識(shí)別

15、序列識(shí)別序列PribnowPribnow框框轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)161619bp19bp5 59bp9bp(一一)結(jié)構(gòu)基因組成結(jié)構(gòu)基因組成1.原核生物的基因組成原核生物的基因組成(一一)結(jié)構(gòu)基因組成結(jié)構(gòu)基因組成1.原核生物的基因組成原核生物的基因組成結(jié)構(gòu)基因的組成100bp啟動(dòng)子區(qū)SD區(qū)轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄中止區(qū)ATGORFTAA、TGA、TAGSDSD序列：序列：5AGGAGGU35AGGAGGU33UCCUCCA3UCCUCCA5 5 16S rRNA16S rRNA -independent(一一)結(jié)構(gòu)基因組成結(jié)構(gòu)基因組成2.真核生物基因組成真核生物基因組成（1）基因區(qū)）基因區(qū)mRNArDNAmDNA

16、tDNArRNAtRNARNApoLIRNApoLIIIRNApoLIIaa35構(gòu)成核糖體NmRNAproteinP1P3P2P1、P2和和P3個(gè)有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。個(gè)有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。不含不含SDSD序列，核糖體與序列，核糖體與mRNA 5mRNA 5端的帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合端的帽子結(jié)構(gòu)結(jié)合4.葉綠體的基因光合作用相關(guān)的基因，多順?lè)醋有问竭M(jìn)行轉(zhuǎn)錄，具有原核生物相似的啟動(dòng)子。色氨酸的合成分色氨酸的合成分5步完成。每個(gè)環(huán)節(jié)需要一種酶，編碼這步完成。每個(gè)環(huán)節(jié)需要一種酶，編碼這5種酶的基因緊密連鎖種酶的基因緊密連鎖在一起，被轉(zhuǎn)錄在一條多順?lè)醋釉谝黄穑晦D(zhuǎn)錄在一條多順?lè)醋觤RNA上，分別以上，分別以trpE、t

17、rpD、trpC、trpB、trpA代表，編碼了鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、鄰氨基苯代表，編碼了鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉(zhuǎn)移酶、鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油甲酸異構(gòu)酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。磷酶合成酶。 -ATG-TCATGCCCAA-ATGAGGC-Vp2 StartVp1 StartVp3 Start核苷酸序列彼此重疊的基因核苷酸序列彼此重疊的基因，即不同基因共用同一段，即不同基因共用同一段DNA的核苷酸序列，他們的核苷酸序列彼此重疊。的核苷酸序列，他們的核苷酸序列彼此重疊。研究中證明，進(jìn)化理論所推斷的“重復(fù)基因中的一部分可能

18、產(chǎn)生新功能，有助于生物對(duì)環(huán)境適應(yīng)”的論斷是正確的。 PS 外 顯 子 S PL 外 顯 子 L 外 顯 子 2 外 顯 子 3 DNA 50b 2800bp 161bp 4500bp 205bp 327bp 初 始 轉(zhuǎn) 錄 本 ： 在 唾 腺 中 轉(zhuǎn) 錄 成 熟 mRNA： 1663nt 初 始 轉(zhuǎn) 錄 本 ： 在 肝 中 轉(zhuǎn) 錄 成 熟 mRNA： 1773nt 圖 18-57 小 鼠 淀 粉 酶 (amy) 基 因 利 用 不 同 啟 動(dòng) 子 產(chǎn) 生 兩 個(gè) 不 同 的 mRNA根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，采用不同的途徑和方法分離目的基因分離的基因分離的基因promoter or terminat

19、orpromoter or terminator編碼區(qū)：只分離編碼區(qū)：只分離ORFORF操縱子：?jiǎn)?dòng)子、功能相關(guān)的編碼基因和終止子操縱子：?jiǎn)?dòng)子、功能相關(guān)的編碼基因和終止子有功能的基因：?jiǎn)?dòng)區(qū)、編碼區(qū)和終止區(qū)有功能的基因：?jiǎn)?dòng)區(qū)、編碼區(qū)和終止區(qū)直接分離法直接分離法化學(xué)合成法化學(xué)合成法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCRPCR）分離法）分離法基于基因文庫(kù)的分離法基于基因文庫(kù)的分離法海膽基因組海膽基因組DNAGC含量含量63%的的rDNARE酶切酶切離心離心方射性標(biāo)記方射性標(biāo)記 mRNA 雜交雜交分離分離rRNA基因基因GC63%rDNAGC63%rDNATm1Tm1Tm2Tm2Tm3Tm3Tm

20、2Tm2：9797S1S1酶切酶切得到得到rDNArDNA-缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：431243H2N431243（蔗糖梯度離心（蔗糖梯度離心）含含mRNA的的核糖體復(fù)合核糖體復(fù)合體體酚酚.綠仿抽綠仿抽提提RT-PCRcDNAmRNA二抗二抗Aboligo-dT柱柱層析層析黃色葡萄球菌的黃色葡萄球菌的ProteinA可以代可以代替二抗替二抗蛋白mRNA（占總mRNA的 90%），用以上方法建立cDNA文庫(kù)，得到珠蛋白基因。mRNAcDNAdcDNA( (四四) )目的基因的分離方法目的基因的分離方法2.2.化學(xué)合成法化學(xué)合成法固相磷酸三酯合成過(guò)程DNA合成儀定點(diǎn)突變合成合成帶有定點(diǎn)突變的基因片斷。合成人工

21、接頭或銜接物EcoRIAdaptorEcoRILinker需的雙引物。原核基因組部分原核基因組部分原核細(xì)胞原核細(xì)胞提取基因組提取基因組DNADNAPCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。目的基因目的基因 的引物的引物1 1反轉(zhuǎn)錄成目的基因反轉(zhuǎn)錄成目的基因cDNAcDNA第一鏈第一鏈目的目的 基因基因cDNAcDNA第二鏈第二鏈PCRPCRmRNAmRNA目的基因目的基因 的引物的引物2 2方法：根據(jù)同源序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用PCR產(chǎn)物進(jìn)行RACE擴(kuò)增或結(jié)合DNA文庫(kù)進(jìn)行分離目的基因。根據(jù)已知基因序列或同源序列分離目的基因根據(jù)已知基因序列或同源序列分離目的基

22、因5-RACE5-RACE 3-RACE3-RACE 文庫(kù)篩選均需多輪操作步驟。以從這些氨基酸序列倒過(guò)來(lái)推導(dǎo)出核酸的可能序列，合成寡核昔酸作為探針3）EST部分測(cè)序?qū)⒕浠蚴删咴粡?fù)制到膜上將菌落或噬菌斑原位復(fù)制到膜上處理之后蛋白質(zhì)暴露，與第一抗體溫育處理之后蛋白質(zhì)暴露，與第一抗體溫育漂洗未結(jié)合的抗體，加入經(jīng)標(biāo)記的第二抗體漂洗未結(jié)合的抗體，加入經(jīng)標(biāo)記的第二抗體能與第一抗體結(jié)合能與第一抗體結(jié)合抗體篩選表達(dá)文庫(kù)抗體篩選表達(dá)文庫(kù)文庫(kù)鑒定能夠表達(dá)出與特定DNA片斷（真核啟動(dòng)子中與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA元件）結(jié)合的目標(biāo)蛋白質(zhì)的克隆。目的基因所在克隆。抑制性減法雜交技術(shù)（SSH）差別雜交法cDNA 芯片（

23、將在其它章節(jié)闡述）親本雜交親本雜交篩選突變體篩選突變體提取突變體基因，構(gòu)建基因文庫(kù)提取突變體基因，構(gòu)建基因文庫(kù)以轉(zhuǎn)位子為探針篩選突變體克隆以轉(zhuǎn)位子為探針篩選突變體克隆亞克隆轉(zhuǎn)位子兩端序列亞克隆轉(zhuǎn)位子兩端序列以亞克隆為探針篩選野生型植物基因組文庫(kù)以亞克隆為探針篩選野生型植物基因組文庫(kù)分離出完整的目的基因分離出完整的目的基因 AcDsC座位C座位Acabcc-m突變對(duì)兩側(cè)分子標(biāo)記作探針，通過(guò)染色體步移技術(shù)將位于這兩個(gè)分子標(biāo)記之間的含目的基因的特定的基因組片段克隆并分離出來(lái)；最后是根據(jù)其同突變體發(fā)生遺傳互補(bǔ)的能力從此克隆中鑒定出目的基因( (四四)目的基因的分離方法目的基因的分離方法4.4.基于基因文庫(kù)的分離法基于基因文庫(kù)的分離法基因定位克隆基因定位克隆RFLPRFLP分子標(biāo)記分子標(biāo)記RFLP作圖的原理與步驟作圖的原理與步驟染色體步移染色體步移通過(guò)逐一克隆來(lái)自染色體基因通過(guò)逐一克隆來(lái)自染色體基因組