第三章微生物工業(yè)菌種的選育與擴(kuò)大培養(yǎng)

1、1 1、寫出生產(chǎn)以下產(chǎn)品的主要菌種：、寫出生產(chǎn)以下產(chǎn)品的主要菌種： 啤酒、黃酒、味精、檸檬酸、食醋、酸奶啤酒、黃酒、味精、檸檬酸、食醋、酸奶2 2、發(fā)酵工藝控制中，主要應(yīng)監(jiān)控、發(fā)酵工藝控制中，主要應(yīng)監(jiān)控 、 、 、 泡沫、氧化還原電位等。泡沫、氧化還原電位等。 溫故知新溫故知新第三章第三章 微生物工業(yè)菌種的選育與擴(kuò)大培養(yǎng)微生物工業(yè)菌種的選育與擴(kuò)大培養(yǎng) o第一節(jié)第一節(jié) 微生物工業(yè)菌種微生物工業(yè)菌種 o第二節(jié)第二節(jié) 微生物工業(yè)菌種的選育與保藏微生物工業(yè)菌種的選育與保藏o第三節(jié)第三節(jié) 微生物工業(yè)種子擴(kuò)大培養(yǎng)微生物工業(yè)種子擴(kuò)大培養(yǎng) 第一節(jié)第一節(jié) 微生物工業(yè)菌種微生物工業(yè)菌種 野生菌野生菌 變異菌變異菌

2、 自然選育自然選育 代謝控制育種代謝控制育種 誘變育種誘變育種 基因重組定向育種基因重組定向育種 一、發(fā)展總趨勢(shì)一、發(fā)展總趨勢(shì) 生長(zhǎng)能力強(qiáng)、對(duì)原料要求低、原料轉(zhuǎn)化率高；生長(zhǎng)能力強(qiáng)、對(duì)原料要求低、原料轉(zhuǎn)化率高；選擇抗噬菌體能力強(qiáng)的菌株；選擇抗噬菌體能力強(qiáng)的菌株； 菌種純，不易變異退化；菌種純，不易變異退化； 菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)；菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)；發(fā)酵副產(chǎn)物少，產(chǎn)物容易分離；發(fā)酵副產(chǎn)物少，產(chǎn)物容易分離；選擇單產(chǎn)高的選擇單產(chǎn)高的營(yíng)養(yǎng)缺陷型營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株、突變株、調(diào)節(jié)突變株調(diào)節(jié)突變株或野生菌株或野生菌株 二、選擇原則二、選擇原則 生產(chǎn)蘇氨酸菌株轉(zhuǎn)變成生產(chǎn)賴氨酸：生產(chǎn)

3、蘇氨酸菌株轉(zhuǎn)變成生產(chǎn)賴氨酸：高絲氨酸缺陷型高絲氨酸缺陷型 四大類微生物四大類微生物: :細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌都可以用來(lái)生產(chǎn)細(xì)菌、酵母菌、霉菌和放線菌都可以用來(lái)生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品。工業(yè)產(chǎn)品。( (見見P8-9P8-9表表1-1)1-1) 微生物的開發(fā)潛力很大。微生物的開發(fā)潛力很大。 目前人們已知的微生物只占自然界微生物總數(shù)的不到目前人們已知的微生物只占自然界微生物總數(shù)的不到10%10%。而微生物代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計(jì)已超過(guò)而微生物代謝產(chǎn)物據(jù)統(tǒng)計(jì)已超過(guò)13001300多種，但進(jìn)行工業(yè)規(guī)模生多種，但進(jìn)行工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的還不到產(chǎn)的還不到100100種。種。 三、工業(yè)上常用微生物三、工業(yè)上常用微生物 第二節(jié)第二節(jié)

4、 菌種的選育與保藏菌種的選育與保藏 1 1、菌種來(lái)源、菌種來(lái)源 根據(jù)資料直接向有關(guān)科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏根據(jù)資料直接向有關(guān)科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門部門索取或購(gòu)買索取或購(gòu)買； 通過(guò)通過(guò)菌種選育菌種選育獲得新的微生物菌種。獲得新的微生物菌種。 一、工業(yè)菌種選育一、工業(yè)菌種選育 第二節(jié)第二節(jié) 菌種的選育與保藏菌種的選育與保藏 2 2、菌種選育定義、菌種選育定義(p11)(p11) 按照生產(chǎn)要求，根據(jù)微生物遺傳變異理論，利用按照生產(chǎn)要求，根據(jù)微生物遺傳變異理論，利用自然菌自然菌 種篩選種篩選、人工誘變育種、代謝控制育種人工誘變育種、代謝控制育種或或基因重組定向育種基因重組定向

5、育種等等方法方法得到優(yōu)良菌種得到優(yōu)良菌種的工作。的工作。 一、工業(yè)菌種選育一、工業(yè)菌種選育 菌種購(gòu)買指南視頻菌種購(gòu)買指南視頻3、方法、方法(1)自然選育自然選育定義定義從自然界土壤、水、從自然界土壤、水、空氣、動(dòng)物、植物、空氣、動(dòng)物、植物、礦物等樣品中分離篩礦物等樣品中分離篩選得到菌種的方法。選得到菌種的方法。 如：土壤如：土壤如：如：選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基如：劃線分離法、稀釋分離法等如：劃線分離法、稀釋分離法等飽浸含某種飽浸含某種指示劑指示劑的的濾紙片濾紙片變色圈（如淀變色圈（如淀粉降解菌篩選）粉降解菌篩選） 指示劑指示劑直接摻入或噴灑直接摻入或噴灑固體固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色，菌落

6、周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液（如淀粉降解菌篩選）碘液（如淀粉降解菌篩選） 固體培養(yǎng)基中固體培養(yǎng)基中摻摻入溶解性差、入溶解性差、可被特定菌可被特定菌( (如如磷細(xì)菌磷細(xì)菌篩選篩選) )利用的營(yíng)養(yǎng)成分，造成利用的營(yíng)養(yǎng)成分，造成不不透明的培養(yǎng)基背景透明的培養(yǎng)基背景。菌落。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。利用此物質(zhì)形成透明圈。利用有特別營(yíng)養(yǎng)要求（如利用有特別營(yíng)養(yǎng)要求（如營(yíng)養(yǎng)缺陷型營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株）作為工菌株）作為工具菌，如待篩選菌具有具菌，如待篩選菌具有合合成該營(yíng)養(yǎng)物成該營(yíng)養(yǎng)物能力，工具菌能力，工具菌就能圍繞該菌生長(zhǎng)。就能圍繞該菌生長(zhǎng)。待篩選的菌株能待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某

7、些能分泌產(chǎn)生某些能抑制工具菌生長(zhǎng)抑制工具菌生長(zhǎng)的物質(zhì)（如的物質(zhì)（如抗生抗生素產(chǎn)生菌素產(chǎn)生菌篩選）篩選） (2)(2)誘變育種誘變育種 采用物理、化學(xué)采用物理、化學(xué)誘變因素處理微生物誘變因素處理微生物細(xì)胞，提高基因的隨細(xì)胞，提高基因的隨機(jī)突變幾率，然后通機(jī)突變幾率，然后通過(guò)定向篩選獲得所需過(guò)定向篩選獲得所需優(yōu)良菌株。優(yōu)良菌株。 3、方法方法 (3) (3) 代謝控制育種代謝控制育種 通過(guò)改變微生物菌種的通過(guò)改變微生物菌種的代謝途徑或代謝自動(dòng)調(diào)代謝途徑或代謝自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)節(jié)系統(tǒng)（如（如增加特定基因拷增加特定基因拷貝數(shù)來(lái)提高限速酶含量）貝數(shù)來(lái)提高限速酶含量）而而使微生物發(fā)生異常代謝，使微生物發(fā)生異常代

8、謝，使所需中間代謝產(chǎn)物過(guò)使所需中間代謝產(chǎn)物過(guò)量積累。量積累。 3 3、方法、方法生物進(jìn)化過(guò)程中微生物形生物進(jìn)化過(guò)程中微生物形成完善的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制成完善的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制 代謝產(chǎn)物不會(huì)過(guò)量積累代謝產(chǎn)物不會(huì)過(guò)量積累 解除或控制微生物的代謝調(diào)節(jié)解除或控制微生物的代謝調(diào)節(jié)目的產(chǎn)物積累目的產(chǎn)物積累 (4) (4) 基因重組定向育種基因重組定向育種 通過(guò)通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜交轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、雜交和和原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合等遺傳學(xué)方法和技術(shù)定向等遺傳學(xué)方法和技術(shù)定向地地重組微生物重組微生物DNADNA，使微生物的，使微生物的功能發(fā)生定向的改變功能發(fā)生定向的改變。 3、方法、方法讓生命永存一讓生命永存一37-43微生

9、物學(xué)第六章微生物學(xué)第六章 4 4、方法、方法基因重組定向育種先進(jìn)技術(shù)能取代基因重組定向育種先進(jìn)技術(shù)能取代傳統(tǒng)育種方法嗎？傳統(tǒng)育種方法嗎？先進(jìn)育種技術(shù)需在先進(jìn)育種技術(shù)需在優(yōu)良原始菌種基礎(chǔ)優(yōu)良原始菌種基礎(chǔ)上應(yīng)用才有效。上應(yīng)用才有效?；蚧蛑亟M重組產(chǎn)品主要還是一些產(chǎn)品主要還是一些較短的多肽和小分子蛋白質(zhì)較短的多肽和小分子蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)類以外的很多發(fā)酵產(chǎn)物（如糖類、有機(jī)酸及次級(jí)蛋白質(zhì)類以外的很多發(fā)酵產(chǎn)物（如糖類、有機(jī)酸及次級(jí)代謝產(chǎn)物等）產(chǎn)生往往受到代謝產(chǎn)物等）產(chǎn)生往往受到多個(gè)基因的控制多個(gè)基因的控制，尤其是還有，尤其是還有許多發(fā)酵產(chǎn)物的代謝途徑還沒(méi)有被確證許多發(fā)酵產(chǎn)物的代謝途徑還沒(méi)有被確證。 1 1

10、、菌種衰退的概念、菌種衰退的概念 指菌種整體在多次接種傳代過(guò)程中逐漸造成指菌種整體在多次接種傳代過(guò)程中逐漸造成生產(chǎn)能生產(chǎn)能力降低力降低，表現(xiàn)為，表現(xiàn)為發(fā)酵力發(fā)酵力（如對(duì)培養(yǎng)基的利用）或（如對(duì)培養(yǎng)基的利用）或繁繁殖力殖力（如孢子的產(chǎn)生）下降或（如孢子的產(chǎn)生）下降或發(fā)酵產(chǎn)物得率降低發(fā)酵產(chǎn)物得率降低的的現(xiàn)象。現(xiàn)象。 二、工業(yè)菌種的衰退與防止二、工業(yè)菌種的衰退與防止 2 2、菌種衰退的常見現(xiàn)象、菌種衰退的常見現(xiàn)象 !菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變 !生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少 !抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等!代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主

11、寄代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降生能力下降 二、工業(yè)菌種的衰退與防止二、工業(yè)菌種的衰退與防止 3 3、菌種衰退產(chǎn)生的原因、菌種衰退產(chǎn)生的原因 保藏不恰當(dāng)保藏不恰當(dāng)傳代次數(shù)過(guò)多傳代次數(shù)過(guò)多 發(fā)生回復(fù)突變發(fā)生回復(fù)突變 培養(yǎng)條件不適合培養(yǎng)條件不適合 二、工業(yè)菌種的衰退與防止二、工業(yè)菌種的衰退與防止 4 4、防止菌種衰退的方法、防止菌種衰退的方法 作好菌種作好菌種保藏保藏工作工作盡可能使每次盡可能使每次培養(yǎng)條件適合而一致培養(yǎng)條件適合而一致盡量盡量減少傳代減少傳代次數(shù)次數(shù) 應(yīng)使用應(yīng)使用幼齡菌幼齡菌培養(yǎng)培養(yǎng) 二、工業(yè)菌種的衰退與防止二、工業(yè)菌種的衰退與防止 三、菌種的復(fù)壯三、菌種的復(fù)壯 概念概念在

12、菌種在菌種已衰退已衰退情況下情況下，通過(guò)純種分離和生產(chǎn)性，通過(guò)純種分離和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退群體中找出少數(shù)未衰退的個(gè)體，能測(cè)定等方法，從衰退群體中找出少數(shù)未衰退的個(gè)體，以以恢復(fù)原有典型性狀恢復(fù)原有典型性狀的措施。的措施。在菌種在菌種未衰退未衰退前經(jīng)常有意識(shí)地進(jìn)行純種分離和前經(jīng)常有意識(shí)地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性狀測(cè)定工作，以期從中生產(chǎn)性狀測(cè)定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正變個(gè)體選擇到自發(fā)的正變個(gè)體。 衰退菌種復(fù)壯的方法衰退菌種復(fù)壯的方法 單細(xì)胞菌株分離法單細(xì)胞菌株分離法 沸水篩選法沸水篩選法 菌液用沸水處理后進(jìn)行單細(xì)胞菌株分離，從而挑選出優(yōu)良菌體。菌液用沸水處理后進(jìn)行單細(xì)胞菌株分離，從而挑選出優(yōu)

13、良菌體。 改變培養(yǎng)條件法改變培養(yǎng)條件法 采用有利于高產(chǎn)菌株而不利于低產(chǎn)菌株的條件來(lái)選出高產(chǎn)菌株。采用有利于高產(chǎn)菌株而不利于低產(chǎn)菌株的條件來(lái)選出高產(chǎn)菌株。 通過(guò)宿主體復(fù)壯通過(guò)宿主體復(fù)壯 如如Bacillus thuringiensisBacillus thuringiensis的復(fù)壯的復(fù)壯誘變處理法誘變處理法 對(duì)發(fā)生回復(fù)突變進(jìn)行重新誘變育種。對(duì)發(fā)生回復(fù)突變進(jìn)行重新誘變育種。 三、菌種的復(fù)壯三、菌種的復(fù)壯 1 1、原理、原理 根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，人為地創(chuàng)造條件，使菌種的代根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，人為地創(chuàng)造條件，使菌種的代謝活動(dòng)處于不活潑狀態(tài)謝活動(dòng)處于不活潑狀態(tài)( (最好是休眠狀態(tài)最好是休眠

14、狀態(tài)) )。 四、工業(yè)菌種的保藏四、工業(yè)菌種的保藏 2 2、原則、原則 挑選挑選優(yōu)良純種優(yōu)良純種，最好是，最好是休眠體休眠體（如孢子、芽孢等），（如孢子、芽孢等），創(chuàng)造一個(gè)創(chuàng)造一個(gè)最有利于休眠的環(huán)境條件最有利于休眠的環(huán)境條件（如低溫、干燥、（如低溫、干燥、缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等），就可以達(dá)到菌種保藏的缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等），就可以達(dá)到菌種保藏的目的目的。同時(shí)，作為可行的方法，還要考慮方法的同時(shí)，作為可行的方法，還要考慮方法的經(jīng)經(jīng)濟(jì)濟(jì)和和簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便。 三、工業(yè)菌種的保藏三、工業(yè)菌種的保藏 u斜面低溫保藏法斜面低溫保藏法 菌種在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生長(zhǎng)旺盛后存放在菌種在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生長(zhǎng)旺盛后存放在

15、4-84-8的冰箱中，一般的冰箱中，一般半半年年要移植一次。適合保藏實(shí)驗(yàn)室要移植一次。適合保藏實(shí)驗(yàn)室常用菌種常用菌種。u低溫冰箱保藏法低溫冰箱保藏法 菌種經(jīng)液體培養(yǎng)后，加入無(wú)菌甘油，使甘油含量為菌種經(jīng)液體培養(yǎng)后，加入無(wú)菌甘油，使甘油含量為30-40%，置于，置于-80低溫冰箱中保存，低溫冰箱中保存，保存期為保存期為1-10年年。適用于保存。適用于保存各類微生物菌體各類微生物菌體。 u石蠟油封保藏法石蠟油封保藏法 醫(yī)用醫(yī)用石蠟油石蠟油滅菌冷卻后加在斜面菌種上滅菌冷卻后加在斜面菌種上, ,超過(guò)斜面頂部超過(guò)斜面頂部1cm1cm，在，在室溫下室溫下或冰箱或冰箱里可保存里可保存1-101-10年。年。幾

16、乎所有微生物幾乎所有微生物都適用。都適用。 三、工業(yè)菌種的保藏三、工業(yè)菌種的保藏3 3、方法、方法 砂土保藏法砂土保藏法 將干的孢子、芽孢與將干的孢子、芽孢與徹底滅菌徹底滅菌的砂土混合后裝入砂土管，放入裝有吸濕劑的干的砂土混合后裝入砂土管，放入裝有吸濕劑的干燥器或大試管中，加橡皮塞用蠟封嚴(yán)，置燥器或大試管中，加橡皮塞用蠟封嚴(yán)，置陰涼干燥處陰涼干燥處或或冰箱冰箱中可保藏中可保藏1-10年。適年。適合于合于孢子、芽孢孢子、芽孢等的保存。等的保存。冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法 瓶中加入菌體或孢子懸液，瓶中加入菌體或孢子懸液，-40-40低溫冰箱冷凍低溫冰箱冷凍1h1h，室溫真空干燥室溫真空干燥固封，

17、固封，可保存可保存10-10-數(shù)數(shù)1010年年。適用于保存。適用于保存各類微生物菌體各類微生物菌體。保存運(yùn)輸方便。保存運(yùn)輸方便。 液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法 菌種密封于安踣瓶中菌種密封于安踣瓶中, , 慢速凍結(jié)器中以每分慢速凍結(jié)器中以每分鐘下降鐘下降11的速度下降到的速度下降到-35-35，再迅速降溫至，再迅速降溫至- -196196，并，并在該溫度下的在該溫度下的液氮超低溫罐液氮超低溫罐中保存，中保存，保存期為保存期為3-9年年。適用于保存。適用于保存各類微生物菌體各類微生物菌體。 第三節(jié) 微生物工業(yè)種子擴(kuò)大培養(yǎng) 獲得獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠、純而壯活力旺盛的、接種數(shù)量足夠、純而壯的培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。 一、目的與任務(wù)一、目的與任務(wù) 種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的態(tài)的生產(chǎn)菌種生產(chǎn)菌種接入接入試管斜面活化試管斜面活化后，再經(jīng)過(guò)后，再經(jīng)過(guò)扁瓶或搖瓶及種扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng), ,最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種純種過(guò)程。過(guò)程。斜面斜面搖瓶搖瓶種子罐種子罐發(fā)酵罐發(fā)酵罐 二、工藝二、工藝 斜面菌種斜面菌種一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)二級(jí)種