細菌內(nèi)雙組分信號傳導(dǎo)

1、細菌內(nèi)雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 一、概念 二、雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的組成 三、雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對生物學(xué)活性的調(diào)控作用 四、雙組分系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究方法 五、雙組分系統(tǒng)研究過程一、概念 1.信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 2.微生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 3.細菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 細胞或者識別與之相接觸的細胞，或者識別周圍環(huán)境中存在的各種化學(xué)和物理信號 并將其轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎麅?nèi)各種分子活性的變化，從而改變細胞的某些代謝過程，影響細胞的生長速度，甚至誘導(dǎo)細胞凋亡，這種針對外源信息所發(fā)生的細胞應(yīng)答反應(yīng)全過程稱為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)。 微生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 微生物是地球上最多變、適應(yīng)性最強的有機體，尤其是細菌，能夠在動植物無法

2、存活的環(huán)境生長。 微生物擁有復(fù)雜而精密的信號系統(tǒng)來應(yīng)對體內(nèi)外環(huán)境變化，從而適應(yīng)環(huán)境并得以生存。細菌雙組分轉(zhuǎn)導(dǎo) 1.雙組分系統(tǒng)是廣泛存在于原核和真核細胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) ，主要由組氨酸蛋白激酶（HPK）和響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（RR）兩個組分組成。 2.雙組分系統(tǒng)信號通路一般包括信號的輸入、HPK自身磷酸化、信號輸出等環(huán)節(jié)。 3.從細菌的角度，當它入侵宿主體內(nèi)時，環(huán)境中各種營養(yǎng)物質(zhì)的含量、溫度、滲透壓和PH值等都發(fā)生了改變，同時一些毒性物質(zhì)也出現(xiàn)在其生存的環(huán)境中，因此，細菌為了生存，其必然擁有一套特有的對外部環(huán)境持續(xù)監(jiān)控的信號系統(tǒng)，以檢測環(huán)境中各種生理因素的改變，并據(jù)此迅速調(diào)節(jié)自身的結(jié)構(gòu)和生理行為，達到適

3、應(yīng)新環(huán)境和生存繁殖的目的。二、雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的組成 經(jīng)典的雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)由組氨酸激酶 histidine kinase，HPK又稱為傳感器激酶 和反應(yīng)調(diào)控蛋白(response regulator，RR)組成。 雙組分系統(tǒng)只負責(zé)信號的輸入、轉(zhuǎn)導(dǎo)、輸出。信號的識別和感受是由其他分子,如細胞表面受體或運輸?shù)鞍讈硗瓿?由它們再將信號傳遞到HPK。雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成 組氨酸激酶 HPK 緊貼最外層跨膜部分，位于胞質(zhì)內(nèi)。是細菌感應(yīng)各種環(huán)境變化必需的，通常是由兩個單體組成的同源二聚體膜蛋白，每個單體含有一個可變 的傳感器結(jié)構(gòu)域 和一個保守的傳遞器結(jié)構(gòu)域 。其傳感器結(jié)

4、構(gòu)域負責(zé)檢測和編碼輸入信息。雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成 組氨酸激酶的傳遞器結(jié)構(gòu)域由N端DHp(二聚化組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移 )結(jié)構(gòu)域和C端CA(催化結(jié)合ATP)結(jié)構(gòu)域組成。DHp結(jié)構(gòu)域能形成一個穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)，其上含有一個能發(fā)生自身磷酸化組氨酸位點；CA催化結(jié)構(gòu)域由保守的N、G1、F和 G2盒組成，含有一個與ATP結(jié)合的基序。DHp和 CA結(jié)構(gòu)域連接在一起，使ATP的磷酸基團轉(zhuǎn)移到DHp上的組氨酸位點上，所有雙組分系統(tǒng)的傳遞器結(jié)構(gòu)域都是保守的。雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成 反應(yīng)調(diào)控蛋白 RR 位于胞質(zhì)內(nèi)。是雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) 中的第二個組分，含有一個或多個保守的N端接受器結(jié)構(gòu)域又稱為輸入結(jié)構(gòu)域和可變的 C

5、端效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域又稱為輸出結(jié)構(gòu)域 。反應(yīng)調(diào)控蛋白控制輸出信息 。雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成 反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白在其N端為接收器，大約具有120個保守性的氨基酸順序和磷酸化位點。C端功能區(qū)具有DNA結(jié)合或其它調(diào)節(jié)功能,對其目標基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。接收器元件和輸出功能區(qū)常由易彎曲的銜接物連接。雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成 當外界或內(nèi)部環(huán)境發(fā)生變化時 ，組氨酸激酶 的傳感器結(jié)構(gòu)域能夠感應(yīng)環(huán)境的刺激并迅速二聚化，導(dǎo)致催化 ATP依賴的特定的組氨酸殘基自我磷酸化，然后反應(yīng)調(diào)控蛋白催化組氨酸的磷酸基團轉(zhuǎn)移到它自身的天門冬氨酸殘基上 ，反應(yīng)調(diào)控蛋白的磷酸化激活效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域，從而與下游基 因的啟動子或蛋白作用，產(chǎn)生調(diào)控應(yīng)答反

6、應(yīng)。雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的組成 隨著雙組分系統(tǒng)的廣泛研究,尤其是在真菌和高等植物中的研究,發(fā)現(xiàn)雙組分系統(tǒng)遠非只有兩個組分,并且無論是信號的輸入、還是轉(zhuǎn)導(dǎo)或輸出過程,都比原核的雙組分系統(tǒng)復(fù)雜得多。因而,雙組分系統(tǒng)呈現(xiàn)出多樣化的特點。目前研究結(jié)果表明許多雙組分系統(tǒng)含有額外的組成，即調(diào)節(jié)伴侶蛋白,作用是輔助磷酸酶的催化。三、雙組份信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對生物學(xué)活性的調(diào)控作用1在滲透信號傳遞過程中的作用2在細菌趨化過程中作用在滲透信號傳遞過程中的作用Lorem ipsum dolor sit amet1雙組分系統(tǒng)在滲透信號傳遞過程中的作用 在細菌趨化過程的作用Lorem ipsum dolor sit amet2以大

7、腸桿菌為例，一個細胞有410根鞭毛，鞭毛快速旋轉(zhuǎn)使得細胞具有運動的能力。鞭毛的運動方式分為2種：（1）順時針旋轉(zhuǎn)(clockwise，CW)：當鞭毛順時針旋轉(zhuǎn)時，細胞鞭毛分開，原地做翻滾運動，來調(diào)整運動方向。這種方式成為翻滾。（圖1-A)（2）逆時針旋轉(zhuǎn)(counter-clockwise，CCW)：當鞭毛逆時針旋轉(zhuǎn)時，鞭毛擰成一束，產(chǎn)生向前的推動力。這種方式稱為泳動。（圖1-B）在復(fù)雜的環(huán)境中，細菌不斷地調(diào)整鞭毛的運動方式來趨利避害。趨化受體感知環(huán)境信號并引發(fā)刺激反應(yīng)，刺激信號通過CheA（組氨酸激酶）和CheY（反應(yīng)調(diào)節(jié)器）傳遞給鞭毛馬達。CheA和CheY是雙組分調(diào)控系統(tǒng)家族的代表性成員

8、，執(zhí)行細菌中大多數(shù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。組氨酸激酶CheA是細菌趨化性的重要元件，擁有CheA的微生物都具有趨化特性。CheA是唯一的組氨酸激酶能夠被分為5個明顯的作用區(qū)域 N-末端磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(HPT)，YB 識別反應(yīng)調(diào)節(jié)器區(qū)域，二聚體結(jié)構(gòu)域（不同于其他組氨酸激酶），催化激酶區(qū)域(CA)，CheW結(jié)合區(qū)域(R)。和所有組氨酸激酶一樣，CheA以二聚體的形式發(fā)揮作用，一個亞基的激酶區(qū)域使另一個亞基保守組氨酸磷酸化趨化反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈RR蛋白是CheY。CheY 直接和鞭毛馬達的轉(zhuǎn)換蛋白FliM相互作用，引發(fā)旋轉(zhuǎn)方式的改變。CheY一結(jié)合到CheA的YB區(qū)域，磷?；鶊F從保守的組氨酸傳遞給CheY保守的

9、天冬氨酸。CheY的磷酸化導(dǎo)致構(gòu)象的改變，從而導(dǎo)致對CheA 的吸引力下降，對馬達蛋白FliM的吸引力增加。磷酸化的CheY從CheA上釋放，與鞭毛馬達蛋白結(jié)合，最終，趨化受體感知的環(huán)境信號被傳遞給了馬達，使得微生物發(fā)生位移。組氨酸激酶CheA與甲基趨化受體MCP的細胞質(zhì)信號區(qū)域由連接因子CheW連接，形成一個MCP-CheW-CheA三元復(fù)合體CheA蛋白是雙組份調(diào)控系統(tǒng)中的傳感激酶，在ATP存在的情況下可發(fā)生自我磷酸化，將磷酸基團轉(zhuǎn)移給CheY，使CheY發(fā)生磷酸化許多鞭毛馬達旋轉(zhuǎn)方向由細胞內(nèi)CheY和CheY-P的比率來控制，鞭毛馬達的逆時針和順時針構(gòu)象是以平衡狀態(tài)存在的。CheY-P與

10、FliM和FliN（轉(zhuǎn)動復(fù)合物的成分）結(jié)合，使鞭毛傾向于進行順時針旋轉(zhuǎn)。FliM和FliN上具有34個CheY-P結(jié)合位點，結(jié)合位點被占據(jù)的越多，鞭毛順時針旋轉(zhuǎn)相應(yīng)地上升。最終調(diào)解運動方向四、雙組分系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究方法1.信號蛋白分子定位研究 免疫熒光技術(shù)（IF)、流式細胞免疫熒光技術(shù)FCM2.信號蛋白分子表達水平及磷酸化檢測 RT-PCR/Real-time PCR（mRNA水平） Western blot檢測通路關(guān)鍵信號分子的表達（蛋白水平） 磷酸化狀態(tài)，蛋白質(zhì)分子間的相互結(jié)合的技術(shù) PhosphoELISA試劑盒（雙抗體夾心） 測蛋白質(zhì)表達量或磷酸化狀態(tài)3檢測通路相互作用蛋白 免疫共沉

11、淀技術(shù)（Co-lP） 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FRET）4 關(guān)鍵信號分子基因沉默 抑制劑/siRNA/基因敲除動物5 蛋白質(zhì)與DNA相互作用 五、五、雙組分系統(tǒng)研究過程 1986年 ，Ninfa和 Magasnik在研究大腸桿菌氮調(diào)節(jié)蛋白系統(tǒng)時，首次發(fā)現(xiàn)了雙組分系統(tǒng) ，用DNA序列鑒定了其基因。 2005 年，Ulrich等對145種細菌基因組進行了測序，在此過程中他們發(fā)現(xiàn)了至少4000對雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。革蘭氏陽性革蘭氏陽性菌菌 VicRK(YycFG)系統(tǒng)1.VicRK(YycFG)最初發(fā)現(xiàn)于枯草芽孢桿菌中，稱為YycFG。隨后通過序列同源性查尋，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)存在于少數(shù)低G+C 含量的革蘭氏陽

12、性菌中，包括芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌等致病菌（ 1999-2002），高度保守。 2. VicRK(YycFG)大體上可以分成早期發(fā)現(xiàn)的以枯草芽孢桿菌為代表的YycFG一型和后來發(fā)現(xiàn)的以鏈球菌為代表的VicRK二型和鏈霉菌為代表的 MtrAB 三型。3. VicRK(YycFG)具有調(diào)控細胞壁合成與代謝、胞膜完整細胞分裂、脂類代謝、多糖合成與被膜形成以及細菌毒力等多種功能，參與細胞的生長、分裂與感染。 該系統(tǒng)異常可導(dǎo)致細菌生活力嚴重下降，甚至死亡，因而成為防治該類病原菌的重要靶標（1998-2013）。由于VicRK(YycFG)中兩組分功能與重要性不同，針對VicRK(YycFG

13、)的研究較少，更多集中在對VicRK(YycFG)抑制物的尋找。Watanabe 等從微生物的丙酮抽提物中篩查出 7種VicK(YycG) 有效抑制劑，其中一種成分對枯草芽孢桿菌、金黃葡萄球菌作用明顯（2003）; Furuta等采用針對組蛋白激酶同源二聚化的高通量遺傳篩選系統(tǒng)，獲得了一種能夠特異性抑制金黃色葡萄球菌VicK(YycG)二聚化的化學(xué)成分（2005）； 我國尹一兵等采用體外活性篩選的方法，也獲得了一個抑制VicK(YycG)蛋白激酶功能域較高活性的小分子咪唑類衍生物（2009）。意義意義1.細菌雙組分系統(tǒng)是細菌的一種普遍而又很重要的信號傳遞系統(tǒng)，也是一個基因表達的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。2.它的理論意義就在于闡明了細菌對環(huán)境變化做出反應(yīng)的基本過程，為深化細菌行為、生態(tài)、生理生化研究奠定了基礎(chǔ)。3.雙組分