CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基技術(shù)手冊

1、北京清大大一生物技術(shù)有限公司CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基技術(shù)手冊1 CHO細(xì)胞CHO細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞(ChineseHamsterOvary,CHO),1957年美國科羅拉多大學(xué)Dr.TheodoreT.Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細(xì)胞，是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞系。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是CHO-K1細(xì)胞，為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，細(xì)胞染色體分布頻率是2n=22,系亞二倍體細(xì)胞。ATCC保存CHO-K1細(xì)胞株，編號為CCL-61,被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達(dá)。由于該細(xì)胞存在遺傳缺陷，無脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?r半醛，培養(yǎng)過程中需在培養(yǎng)基中添加L-脯氨酸才能生

2、長。并且由于該細(xì)胞已經(jīng)霍亂毒素適應(yīng)，形態(tài)學(xué)有所改變。最初細(xì)胞為貼壁型細(xì)胞,經(jīng)多次傳代篩選后，也可懸浮生長ATCC'rrirw-CCL5】Ms2mATCC提供的CHO-K1細(xì)胞照片CHO細(xì)胞容易發(fā)生基因突變，也較易進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，是良好的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)宿主細(xì)胞，代表性細(xì)胞有二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase)營養(yǎng)缺陷型突變細(xì)胞株(CHO/dhfr-)、轉(zhuǎn)染谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase,GS基因的GS-CHO細(xì)胞二氫葉酸還原酶是真核細(xì)胞核甘酸生物合成過程中起著重要作用的一種酶，是常用的遺傳選擇標(biāo)記之一，它可催化二氫葉酸還原成四氫葉酸。對于

3、dhfr突變體細(xì)胞而言，由于不能夠合成四氫葉酸，阻斷了正常核酸代謝途徑，因此不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長，但若在培養(yǎng)基中加入次黃嗯吟(hypoxanthine)和胸音(thymidine),則突變體細(xì)胞可以借助核普酸的補(bǔ)救合成途徑維持生長。利用dhfr基因進(jìn)行篩選時(shí)，首先將重組DNA分子導(dǎo)入dhfr-表型的受體細(xì)胞，然后撤除原培養(yǎng)基中的的次黃嗯吟和胸背，即可獲得dhfr+并能表達(dá)外源基因的克隆細(xì)胞系。因此在挑選表達(dá)外源基因的陽性克隆細(xì)胞時(shí)需選用不含次黃嗯吟和胸背的培養(yǎng)基。另外，氨甲喋吟(MTX)選擇壓力可使CHO/dhfr一細(xì)胞的外源基因的拷貝數(shù)擴(kuò)增并得到較高水平的表達(dá)。CHO-GS細(xì)胞是用含單抗蛋

4、白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因標(biāo)記的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞CHO,再通過L-氨基亞碉蛋氨酸(methioninesulphoximine,MSX)等化合物選擇加壓促使GS基因和目的蛋白基因擴(kuò)增，篩選獲得重組細(xì)胞株，可在不含谷氨酰胺培養(yǎng)基中生長、增殖，可避免或減少細(xì)胞代謝過程中谷氨酰胺降解積累的氨對細(xì)胞的損傷、抑制作c»L*O»*De-.CHO-ahFr>ATCC提供的CHO/dhfr-細(xì)胞照片2 CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢與特點(diǎn)由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)與在原核生物中的表達(dá)存在較大差異，因而外源基因在哺乳

5、動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)所需的元件也不同于在原核生物細(xì)胞中的表達(dá)所需的元件。外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)包括基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯及翻譯后蛋白質(zhì)的加工等過程，如蛋白質(zhì)的糖基化、磷酸化、寡聚體的形成以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵的形成等比較復(fù)雜，要表達(dá)具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)如膜蛋白、抗體和具有特異性催化功能的酶需要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。哺乳動(dòng)物基因表達(dá)宿主細(xì)胞選擇的基本原則是來源豐富、轉(zhuǎn)化效率高、表達(dá)效果好，CHO細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)除具有上述的特點(diǎn)要求外，還有以下優(yōu)勢：1）外源基因被整合到宿主染色體上后，在沒有選擇壓力的情況下能穩(wěn)定保持；2）適合多種蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)，并且很少分泌自身的內(nèi)源

6、蛋白，便于下游產(chǎn)物分離純化；3）對培養(yǎng)基的要求較低，可在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；4）細(xì)胞可進(jìn)行貼壁培養(yǎng)也可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，且具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力；5）可進(jìn)行高密度大量培養(yǎng)，進(jìn)行較大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)其培養(yǎng)量可放大到20000L以上，是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)受體細(xì)胞之一。另有研究者嘗試將類胰島素生長因子IGF基因和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞獲得能自身分泌必需蛋白的超級CHO”，無需在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素，細(xì)胞可在無血清培養(yǎng)基（SFM）中生長良好。3 CHO細(xì)胞在生物制藥中的應(yīng)用目前已有多種外源基因如人組織性纖溶酶原激活劑（tPA）、人促紅細(xì)胞生成素（EPO）、乙肝表面抗原（HBsAg

7、）、干擾素丫（IFNy）、干擾素0（IFN0）、白細(xì)胞介素2（IL2）、凝血因子皿等在CHO細(xì)胞中得到表達(dá)。在美國已注冊的大約73種蛋白藥物生產(chǎn)中，應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的有35種，CHO細(xì)胞培養(yǎng)的就占27種，其中包括10種單克隆抗體。下表是以CHO細(xì)胞培養(yǎng)為基質(zhì)生產(chǎn)的重組制品。PvaduLt可產(chǎn)Uanuficiuir«rdippf7i,djfDXjAuEGFAl恥卜也屜二|期.£8aecqy三劉忸u-glLEasd的sPlTpSi5匕33日Geizj'eMQ6川如gymsVd-bti蟲花Mifxpnly*Mrd含有Gbtitb找，Orii；.lyi-CTLMfuis

8、；：5h國中3AVt'¥$加地2006h-dLidygiim_4二nJ牝eMinoa口出*閉限M火，W321kHlnPhjrrracfejliial碎Lut'BriLuIh百在*g*3仙山門口屆MiXSeronofayjstn,Ajut*VTGFintt叩曲UMttcdaalaAh明：3nrGs他口上心MvjfeFerVI1(fiU-iLuxdjHsmptaA20C3XHvrL'll'yE用心2009Rapt'<jAnl-CD？B-Ac&lFWtGQ5：ri338Ganntooh云)0F也山fn,H：FMr>G篁Fc：209

9、3Retrf,力田gi中Ftel御：K(njl=ieSftrariD2闌HyrraRhmjmai*他后AbRU20C2即MR印E的losaMm掰厚門黜站RP1LJAmaRn邕D1"卡南5ei>:：平】嘉南w七wmoG&ye占盯"mlai端5i式加rpiWtepIwerss.nMywfirdMdriEdai處胱IEKD01krucHim4小卜舒2砧MikasbJicsrtEiullefxtGsiKnSrai忖第Eno值TMFuFEssrdrfuEinRnGLmdhidartintsAT-gEmV?yaUi1幅BenellFaderIXHerfzpiiaEsy&a

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11、itasi1987Seleoealistaiapprowdb-Dl£>gic5nC-hlnsseHams&rO/arwoellIn.4無血清細(xì)胞培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的出現(xiàn)是培養(yǎng)基發(fā)展歷程上的一個(gè)里程碑，其一般是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入成分完全明確的或部分明確的血清替代成分，使培養(yǎng)基能滿足動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的要求，又可有效的克服因使用血清所引發(fā)的問題。進(jìn)入20世紀(jì)80年代后，新的無血清培養(yǎng)基不斷問世，人們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細(xì)胞生長的成分，如纖連蛋白(fibronectin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin,TRF)、胰島素(Insulin)和表皮生長因子

12、(epidermalgrowthfactor,EGF)等，不少細(xì)胞即能在無血清供應(yīng)的情況下生長，尤其是CHO、雜交瘤、骨髓瘤細(xì)胞以及BHK21細(xì)胞等。某些細(xì)胞在無血清的條件下，其生長和抗體的產(chǎn)量甚至較有血清培養(yǎng)時(shí)高出數(shù)倍。目前，無血清培養(yǎng)基的研究有兩個(gè)方向：一是培養(yǎng)基中不含有任何動(dòng)物來源的添加組分；二是培養(yǎng)基中不含有不明確的添加組分。依此可以將當(dāng)前應(yīng)用較多的無血清培養(yǎng)基歸納為以下四種：(1)無血清培養(yǎng)基，為一般意義上無血清培養(yǎng)基，用各類可替代血清功能的生物材料配制細(xì)胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白(BSA)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等生物大分子物質(zhì)，以及從血清中提取的去除蛋白質(zhì)的混合脂類以及水解蛋白等。其特點(diǎn)

13、是培養(yǎng)基中的蛋白含量較高，添加物質(zhì)的化學(xué)成分不明確，其中含有大量的動(dòng)物來源蛋白。(2)無動(dòng)物來源培養(yǎng)基，許多商業(yè)公司開發(fā)的無動(dòng)物來源培養(yǎng)基是基于生產(chǎn)重組藥物的安全考慮，培養(yǎng)基中的添加組分無動(dòng)物來源，需要的蛋白來源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細(xì)胞生長及增殖的需要。(3)無動(dòng)物蛋白培養(yǎng)基，培養(yǎng)基完全不用動(dòng)物來源的蛋白，但仍有部分添加物是來源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養(yǎng)基組分相對穩(wěn)定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對培養(yǎng)的細(xì)胞是高度特異性的。(4)化學(xué)組分限定培養(yǎng)基，此類培養(yǎng)基是目前最安全、最為理想的培養(yǎng)基，首先可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，其中所添加

14、的少量動(dòng)物來源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組份。其特點(diǎn)是培養(yǎng)基的性質(zhì)明確，有利于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的代謝研究，同時(shí)分離純化也比較方便。研究者對CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的開發(fā)比較深入，目前有多種用于CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)的培養(yǎng)基面世，形成了很多固定的商業(yè)配方，這些配方有的是專利保護(hù)的，有的是商業(yè)秘密。國外有部分優(yōu)秀的無血清培養(yǎng)基，但價(jià)格昂貴。CHO細(xì)胞存在多種克隆細(xì)胞系，僅ATCC保存的CHO細(xì)胞就多達(dá)38種，再加上各公司或研究單位構(gòu)建的細(xì)胞，其克隆細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)不止這些。對于CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)而言，由于構(gòu)建的各種高性能CHO細(xì)胞系不同，不同克隆細(xì)胞的營養(yǎng)要求也都非常的不同，對營養(yǎng)要求往往是個(gè)性化的。另

15、外，CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程的不同培養(yǎng)階段、重組CHO細(xì)胞構(gòu)建的各個(gè)階段，細(xì)胞代謝所需的營養(yǎng)或限制因素也是不同的，即同一細(xì)胞系在整個(gè)培養(yǎng)過程也需要使用不同的培養(yǎng)基，需要與之相對應(yīng)的個(gè)性化培養(yǎng)基(CustomedCellCultureMedium)。5CHO細(xì)胞無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基(SAF-CHO-G-004)其實(shí)個(gè)性化培養(yǎng)基并不新鮮，在國外生物制藥企業(yè)普遍采用個(gè)性化培養(yǎng)基，世界著名的生物制藥公司(如Amgen、Genetech)往往和培養(yǎng)基企業(yè)合作，通過細(xì)胞培養(yǎng)基的客戶定制方式，研制最適合自身細(xì)胞特點(diǎn)的個(gè)性化細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，用于提高細(xì)胞產(chǎn)率和生產(chǎn)效率。另有數(shù)據(jù)顯示，國際上的細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)

16、企業(yè)，個(gè)性化、定制培養(yǎng)基占其培養(yǎng)基業(yè)務(wù)的90%以上，目錄培養(yǎng)基不足10%。北京清大天一生物技術(shù)有限公司依托于在細(xì)胞培養(yǎng)基研發(fā)和動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)，潛心研究，開發(fā)研制了多種個(gè)性化培養(yǎng)基，通過在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用已取得可喜的成果，如CHO細(xì)胞無血清無動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基(SAF-CHO-G-004)就是其中之一。5.1 CHO細(xì)胞無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基(SAF-CHO-G-004)的特點(diǎn)SAF-CHO-G-004(代碼：SAF108)是北京清大天一生物技術(shù)有限公司開發(fā)的新一代CHO細(xì)胞無血清無動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基，能支持多種CHO細(xì)胞的生長維持，可廣泛應(yīng)用于CHO細(xì)胞的無血清懸

17、浮培養(yǎng)及抗體、重組蛋白的生產(chǎn)過程。細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗(yàn)嚴(yán)格執(zhí)行GMP管理和ISO9001管理體系，符合生物制藥原輔料要求，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。1）SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基系無血清無動(dòng)物組分培養(yǎng)基，不含有血清替代物、動(dòng)物來源蛋白等動(dòng)物來源組分，化學(xué)成分明確，保證了細(xì)胞培養(yǎng)中原輔料的使用安全性;2)SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基能支持多種CHO細(xì)胞的生長、維持，具有較為廣泛的適用性;3)適用于實(shí)驗(yàn)研究和大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用;4)5)有多種包裝規(guī)格可供選擇，滿足不同用戶的使用需求。根據(jù)用戶的不同使用，可定制SAF-CHO-G-004培養(yǎng)基，以滿足CHO/dhfr-、GS-CHO等不同系統(tǒng)

18、的應(yīng)用需求;5.2 CHO細(xì)胞無血清無動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)效果使用SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)已馴化過的CHO細(xì)胞，圖1是CHO細(xì)胞接種密度為2X105cells/ml時(shí)的細(xì)胞生長曲線，可以看到，經(jīng)過34天的培養(yǎng)過程，細(xì)胞密度可提高到細(xì)胞4-5X106cells/ml，細(xì)胞活率超過90%,細(xì)胞擴(kuò)增了二十多倍。圖2是細(xì)胞批培養(yǎng)的葡萄糖和乳酸代謝情況。圖3和圖4分別表示培養(yǎng)了96小時(shí)（4天）的CHO臺盼藍(lán)染色和細(xì)胞顯微照片，細(xì)胞形態(tài)飽滿、健康。1MAIf-界=柄Ilk圖1.CHO細(xì)胞生長曲線圖2.CHO細(xì)胞批培養(yǎng)葡萄糖和乳酸代謝情況圖3培養(yǎng)96hr的臺盼藍(lán)染色的CHO細(xì)胞圖4培養(yǎng)第9

19、6hr的CHO懸浮細(xì)胞5.3 CHO細(xì)胞無血清無動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基使用說明5.3.1 成分無機(jī)鹽氯化鈣、五水硫酸銅、七水合硫酸亞鐵、氯化鉀、六水合氯化鎂、五水硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、七水合硫酸鋅等氨基酸L-鹽酸精氨酸、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-鹽酸組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-鹽酸賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨酸、L-天門冬酰胺、L-天門冬氨酸、L-鹽酸半胱氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸等維生素維生素Bi、維生素B2、維生素B12、維生素C、維生素H、鹽酸叱哆醇、鹽酸叱哆醛、肌醇、葉酸等其它無水葡萄糖、HEP

20、ES、丙酮酸鈉、亞油酸、硫辛酸、胰島素、亞硒酸鈉、植物蛋白等SAF-CHO-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基每升標(biāo)示量27.80g,含L-谷氨酰胺、次黃嗯吟和胸背，可根據(jù)客戶使用需求定制不含谷氨酰胺或次黃喋吟、胸背的無血清培養(yǎng)基，具體的成分、標(biāo)示量等詳見對應(yīng)產(chǎn)品的說明書。5.3.2 貯存2C8c冷藏，干燥、密封、避光貯藏。【貯存期限】：暫定一年。5.3.3 配制方法（以1L包裝為例）1. 1）將一袋粉末培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器，加注射用水（水溫20c-30C）到950毫升，輕微攪拌溶解；2. 2）加入1.9克碳酸氫鈉；3. 3）輕微攪拌溶解，加注射用水至1升；4

21、. 4）如有必要，用1mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)pH至所需值;5. 5）用0.2濾膜正壓過濾除菌；6. 6）溶液應(yīng)在2-8C下避光保存。5.3.4 SAF-CHO-G-004培養(yǎng)基不同NaHCO3加量的pH、滲透壓參考對照表與好-(0-6004培養(yǎng)是每升濟(jì)£03；11最的口出審表壓裁考對焦表721686.6O.646J265.85654450400T-獨(dú)350玉H二MEI300250200150100500口L6LSZ32.73,13.51&4.34.7碳酸星細(xì)勺()5.4CHO細(xì)胞無血清馴化在含血清培養(yǎng)基中生長的CHO細(xì)胞可經(jīng)過一定的細(xì)胞馴化過程，適應(yīng)SAF-CHO

22、-G-004細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞的無血清培養(yǎng)。已經(jīng)適應(yīng)無血清培養(yǎng)的CHO細(xì)胞可直接在SAF-CHO-G-004中實(shí)現(xiàn)無血清培養(yǎng)培養(yǎng)，建議前二代的細(xì)胞密度不低于4X105cells/ml。細(xì)胞的無血清馴化過程如下：1 .取處于對數(shù)生長期的貼壁CHO細(xì)胞，活率大于95%,開始進(jìn)行無血清馴化。2 .細(xì)胞馴化可以在方瓶（T-flask）、搖瓶（shake-flask）或轉(zhuǎn)瓶（spinner-bottle）中進(jìn)行。3 .將無血清細(xì)胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基的按1:1(V/V)的比例進(jìn)行混合，接種密度為24Xl05cells/ml的細(xì)胞，在37C、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。4 .根據(jù)細(xì)胞生長和活率情況，在降血清的每一階段可穩(wěn)定傳代13代，接種密度維持在2-4X105cells/ml。5 .逐