(2013-11-13)酶化學(xué)B 3

1、第10章 酶的作用機(jī)制和酶的調(diào)節(jié)一 酶的活性中心（一）、活性中心(active site)的概念 活性中心：活性中心：酶分子中直接與底物結(jié)合并催 化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的部位。 活性中心分為結(jié)合部位和催化部位 結(jié)合部位：結(jié)合部位：負(fù)責(zé)與底物的結(jié)合，決定酶的專一性（與km有關(guān)）。 催化部位：催化部位：負(fù)責(zé)催化底物鍵的斷裂形成新鍵，決定酶的催化能力效率（kcat)和催化性質(zhì)。 結(jié)合部位和催化部位也可以合二為一，活性部位可以提供調(diào)節(jié)部位，也可以為活性部位提供物質(zhì)基礎(chǔ) 酶的活性中心（二）、活性中心的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1活性部位在酶分子中只占一小部分（12）2酶活性部位是一個(gè)三維的特定空間結(jié)構(gòu)3酶的活性部位和底物有

2、時(shí)不互補(bǔ)-誘導(dǎo)契合4. 酶活性部位位于酶分子表面的一個(gè)裂縫內(nèi)，裂縫 內(nèi)往往是個(gè)疏水的微環(huán)境。5底物通過次級鍵結(jié)合到酶上， 形成ES復(fù)合物。6酶活性部位是柔性或可運(yùn)動(dòng)性， 即酶與底物結(jié)合 時(shí)構(gòu)象發(fā)生一定的變化才互補(bǔ)。頻率最高的活性中心的氨基酸殘基： Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。 酶與底物結(jié)合成ES復(fù)合物主要靠次級鍵：氫鍵、鹽鍵、范德華力和疏水相互作用。-底物可以穩(wěn)定酶！ 酶的活性中心（三）、 研究活性中心的方法 化學(xué)修飾法通常是比較在底物或競爭性抑制試劑是否存在的情況下的化學(xué)修飾1、酶的共價(jià)修飾（化學(xué)修飾）法酶的化學(xué)修飾法分類（1）、非特異性共價(jià)修飾非特異性共價(jià)修飾

3、某些酶活性中心含有的活性基團(tuán)在活性中心以外不存在或很少，這時(shí)可選擇某些非特異性試劑進(jìn)行修飾（2）、特異性共價(jià)修飾特異性共價(jià)修飾如DFP（二異丙基氟磷酸）可與活性中心中的絲氨酸反應(yīng)。如，DFP與胰凝乳蛋白酶作用（只和活性部位的絲氨酸殘基的羥基結(jié)合）2. 親和標(biāo)記 親和標(biāo)記親和標(biāo)記（Affinity labeling）：也屬于共價(jià)修飾，主要是利用酶與底物特異性結(jié)合的原理而發(fā)展起來的一種特異性化學(xué)修飾法, 是使用一個(gè)能與酶的活性中心特異結(jié)合的正常底物類似物作為活性部位基團(tuán)的標(biāo)記試劑。（TPCK）修飾a胰凝乳蛋白酶His57 何謂親和層析何謂親和層析 ？研究活性中心的方法(續(xù))4、動(dòng)力學(xué)分析法 通過研

4、究酶活性與pH關(guān)系，可以推測到與催化直接相 關(guān)的某些基團(tuán)的pK值，進(jìn)而推測這些基團(tuán)的作用5、定點(diǎn)誘變 通過改變基因來改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，制造新的蛋白質(zhì)。6、切除法3、X射線衍射分析法 通常是將酶與底物類似物或?qū)Ｒ恍砸种苿┬纬蓮?fù)合物，而后作X射線衍射分析。如溶菌酶和胰凝乳蛋白酶 pKa value* PH = 7 -COOH Asp 3.9; COO- Glu 4.1 COO- -NH3+ Lys 10.5; NH3+ Arg 12.5 NH3+ 組氨酸-6.0動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析法動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析法核糖核酸酶最適 PH = 7.8 參照最適PH值：谷氨酸、組氨酸或賴氨酸哪一個(gè)可能在活性中心 ？ 胃蛋白酶

5、的最適PH值為2，哪一類氨基酸可能在活性中心？定點(diǎn)誘變天冬酰胺后Kcat小了5000倍結(jié)論：？結(jié)論：？苯丙氨酸后 Kcat不變 Km提高了6倍 結(jié)論：？結(jié)論：？ 為驗(yàn)證羧肽酶A Tyr 248 在催化中的作用，對其基因進(jìn)行定點(diǎn)突變Tyr 248（TAT）定點(diǎn)突變?yōu)镻he（TTT）；實(shí)驗(yàn)結(jié)論是，Tyr 248 參與了與底物的結(jié)合，但不是催化所必須的，此結(jié)論必定來自如下數(shù)據(jù)： A. Kcat 突變后降低 B. Km 變大 C. Kcat/Km 升高 D. Kcat 不變 E. Kcat/Km 降低上海交通大學(xué)2007生物化學(xué) 定點(diǎn)誘變突變?yōu)楸奖彼岷笸蛔優(yōu)楸奖彼岷螅篕cat不變， Km提高了6倍

6、（2）如何確定某氨基酸殘基為酶的活性所必須 華中科技大學(xué)華中科技大學(xué)2011年年如何確定活性部位？（習(xí)題）例：碘乙酸可使核糖核酸酶的側(cè)鏈His119和His12烷基化而抑制酶活性。其中His119的修飾對酶影響最大, 但是研究中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)His永遠(yuǎn)不能同時(shí)被碘乙酸修飾, 而且, 碘乙酸的類似物碘乙酰胺不能作為酶的修飾劑。此外在pH 5.5時(shí)碘乙酸一般不作用His, 但在核糖核酸酶中, pH =5.5時(shí), 碘乙酸可作用His, 由上述現(xiàn)象可對核酸酶的活性部位得出什么結(jié)論? 分析分析：這是一個(gè)說明通過側(cè)鏈修飾如何確定活性中心的例題。（1）His119和His12可能都處于活性部位，His119可能

7、性更大或者His119是催化過程中第一啟動(dòng)者，（2）His119和His12不在同一個(gè)環(huán)境（3）由于酶環(huán)境的影響，His以質(zhì)子供體的形式存在。有可能在his119和His12之間形成質(zhì)子供體與質(zhì)子受體的關(guān)系（四）、酶的必需基團(tuán)（自學(xué)） 必需基團(tuán)：酶分子中與催化作用直接相關(guān)、不可缺少的化學(xué)基團(tuán)。 （1）、活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)： 結(jié)合基團(tuán)：與底物結(jié)合，形成酶底物復(fù)合物的部位； 催化基團(tuán)：影響底物中化學(xué)鍵的穩(wěn)定性，與底物發(fā)生 化學(xué)反應(yīng)，將底物變成產(chǎn)物。 （2）、活性中心外的必需基團(tuán)（調(diào)控基團(tuán)或維持酶活性） 構(gòu)成酶活性中心的基團(tuán)：His的咪唑基、 Ser的-OH、Cys的-SH、Glu的-羧基1. 酶

8、的必需基團(tuán)是（ ） （1）必需基團(tuán)構(gòu)成具有一定空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象（2）和底物結(jié)合幷將之轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的部位（3）抑制劑都作用于酶的活性中心（4）所有酶的活性中心都有金屬離子2.酶的活性中心是（）（1）所有的酶都有活性中心（2）所有活性中心都有輔基（3）酶的必需基團(tuán)都位于活性中心（4）變構(gòu)抑制劑直接結(jié)合的部位（5）重金屬沉淀酶的結(jié)合區(qū)域 思考題 思考題3. 用定位點(diǎn)突變方法得到缺失某一個(gè)氨基酸殘基突變體， 這個(gè)突變的酶蛋白不再具有催化活性，因此可以認(rèn)為該缺失殘基一定是酶結(jié)合底物的必需基團(tuán)。（ 判斷 ） 華南理工大學(xué)20094. 某同源蛋白中的Ala殘基被替換為Val，此類替換屬 于 保守性替換 。中山大

9、學(xué)20095在酶的結(jié)構(gòu)上十分重要，但在催化過程中極不可能和底物相互作用，它是( )a. 谷氨酸 b. 胱氨酸 c. 組氨酸 d. 酪氨酸 e. 絲氨酸江南大學(xué)2007 思考題6. 什么是酶活性中心？有一種酶，含一個(gè)半胱氨酸殘基，設(shè)計(jì)一個(gè)技術(shù)線路，驗(yàn)證該Aa是否參與酶的催化作用或?qū)Ｒ恍浴?中國農(nóng)業(yè)大學(xué)2010生物化學(xué)碘乙酸（碘乙酰胺）7. 討論酶活性中心的特點(diǎn)，指出兩種常用于研究酶活性中心 的方法(8分)（大連理工大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)2011生物化學(xué)）酶高效性的機(jī)理1、底物和酶的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)2、底物的形變與誘導(dǎo)契合3、酸堿催化4、共價(jià)催化5、活性中心金屬離子6、活性部位微環(huán)境的影響二、影響酶

10、催化效率的有關(guān)因素（二）、 酶具有高催化能力的原因1. 鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)Proximity/Orientation變分子間反應(yīng)為變分子間反應(yīng)為分子內(nèi)反應(yīng)分子內(nèi)反應(yīng)底物與酶的鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)變分子間反應(yīng)為鄰近效應(yīng)與定向效應(yīng)變分子間反應(yīng)為分子內(nèi)反應(yīng)分子內(nèi)反應(yīng)。鄰近效應(yīng)鄰近效應(yīng)：酶與底物形成中間復(fù)合物中間復(fù)合物后，變分子間反應(yīng)變分子間反應(yīng)為為分子內(nèi)反應(yīng)，分子內(nèi)反應(yīng)，使底物之間、酶的催化基團(tuán)與底物之間相互靠近，提高了反應(yīng)基團(tuán)的有效濃度。定向效應(yīng)定向效應(yīng)：由于酶的構(gòu)象作用，底物的反應(yīng)基團(tuán)之間、酶與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間正確取向的效應(yīng)。酶把底物分子從溶液中富集出來，使它們固定在活性中心附

11、近，反應(yīng)基團(tuán)相互鄰近，同時(shí)使反應(yīng)基團(tuán)的分子軌道以正確方位相互交疊，反應(yīng)易于發(fā)生。鄰近與定向（軌道定向）效應(yīng)A. 反應(yīng)物的反應(yīng)基團(tuán)和催化基團(tuán)既不靠近，也不彼此定向B. 兩個(gè)基團(tuán)靠近，但不定向，也不利于反應(yīng)C. 兩個(gè)基團(tuán)既靠近，又定向，大大有利于底物形成過渡態(tài)，加速反應(yīng)鄰近與定向（軌道定向）效應(yīng)酶中某些基團(tuán)可使底物分子的敏感鍵中某些基團(tuán)的電子云酶中某些基團(tuán)可使底物分子的敏感鍵中某些基團(tuán)的電子云密度變化，產(chǎn)生密度變化，產(chǎn)生電子張力電子張力，降低了底物的活化能，降低了底物的活化能 、酶從低活性形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚孕问?，利于催化?、底物形變，利于形成ES復(fù)合物。 、底物構(gòu)象變化，過度態(tài)結(jié)構(gòu)，大大降低活化能

12、 （二）、底物形變和誘導(dǎo)契合的催化效應(yīng)溶菌酶 底物形變：酶與底物結(jié)合后，D 糖環(huán)構(gòu)象發(fā)生變形，從正常的能量較低的椅式構(gòu)象椅式構(gòu)象變?yōu)槟芰枯^高的半椅式構(gòu)象半椅式構(gòu)象。1、定義：酶分子的一些功能基團(tuán)起瞬時(shí)質(zhì)子供體或質(zhì)子受體的作用，以穩(wěn)定過渡態(tài)，降低了活化能加速了反應(yīng)，這種機(jī)制稱為.。 Specific acid-base catalysis （H+ 或OH-) General acid-base catalysis 2、分類（三）、酸堿催化酶酶酶酶 Many protein enzymes use general acid-base catalysis as a way to increase r

13、eaction rates（催化有機(jī)反應(yīng)的最普催化有機(jī)反應(yīng)的最普遍有效的催化劑遍有效的催化劑） Acid-Base CatalysisSpecific acidbase catalysisGeneral acid-base catalysis The active site of some enzymes contain amino acid functional group, such as those shown here, can participate in acid-base catalysis pKa value* PH = 7 -COOH Asp 3.9; Glu 4.1 COO

14、- -NH3+ Lys 10.5; Arg 12.5 NH3+ 組氨酸-6.0Side chains used in general acid-base catalysis 3、影響酸堿催化反應(yīng)速度的兩個(gè)因素 酸堿強(qiáng)度酸堿強(qiáng)度(pK值）。組氨酸咪唑基的解離常數(shù)為6， 在pH6附近給出質(zhì)子和結(jié)合質(zhì)子能力相同，是最活潑 的催化基團(tuán)。 給出質(zhì)子或結(jié)合質(zhì)子的速度給出質(zhì)子或結(jié)合質(zhì)子的速度。咪唑基最快，半壽期 小于10-10 秒 酸堿催化所以，所以，His是酶中最有效最活潑的一個(gè)催化功能基團(tuán)。是酶中最有效最活潑的一個(gè)催化功能基團(tuán)。思考題 1. 在酶的廣義酸堿催化機(jī)制中，特別重要的一個(gè)氨基酸殘基是_，其側(cè)鏈

15、pK 值接近生物體的pH 值。 中山大學(xué)中山大學(xué)2007年年2. 蛋白酶的酸堿催化作用加強(qiáng)了共價(jià)鍵化基團(tuán)對肽鍵碳原子的親核進(jìn)攻能力。（是非題） 中山大學(xué)中山大學(xué)2009年年3. 名詞解釋：酸堿催化 2007 年中國海洋大學(xué)生物化學(xué)、華東師范大學(xué)華東師范大學(xué)2003年年NucleotidesH2O2或3-核苷酸核苷核苷2,3環(huán)磷酸酯環(huán)磷酸酯 Basic hydrolysis of RNA Due to the 2-hydroxyl思考題 例如：某酶的化學(xué)修飾實(shí)驗(yàn)表明，Glu和Lys殘基是這個(gè)酶活性所必需的兩個(gè)殘基。根據(jù)pH對酶活性影響研究揭示，該酶的最大催化活性的pH近中性。請你說明這個(gè)酶的活性

16、部位的Glu和Lys殘基在酶促反應(yīng)中的作用，并予以解釋 答 谷氨酸的-羧基的pKa值約為4.0，在近中性條件下，該基團(tuán)去質(zhì)子化，在酶促反應(yīng)中起著堿催化劑的作用。賴氨酸的?-氨基的pKa值約為10.0，在近中性條件下，它被質(zhì)子化，在酶促反應(yīng)中起著酸催化劑的作用。 (1). 共價(jià)催化：酶作為親核基團(tuán)或親電基團(tuán)，與底物形成一個(gè)反應(yīng)活性很高的共價(jià)中間物，此中間物易變成過渡態(tài)，反應(yīng)活化能大大降低，提高反應(yīng)速度。（四） 共價(jià)催化Covalent catalysis酶酶底物底物共價(jià)鍵共價(jià)鍵（2）.共價(jià)催化分類 親核基團(tuán)：（親核催化）親核基團(tuán)：（親核催化） Ser 的羥基，His 的咪唑基，Cys 的硫基，A

17、sp 的羧基等；這些富含電子的基團(tuán)(有孤對電子)，攻擊底物分子中電子云密度較小的親電子基團(tuán)，并供出電子，二者形成共價(jià)鍵，酶和底物形成一個(gè)不穩(wěn)定的中間物，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。 親電子基團(tuán)：（親電催化）親電子基團(tuán)：（親電催化） H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+ 某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價(jià)催化作用。 共價(jià)催化往往是親核攻擊的結(jié)果共價(jià)催化往往是親核攻擊的結(jié)果nucleophilic catalysis （親核催化） Examples of covalent bond formation between enzyme and substrate. In each case,

18、 a nucleophilic center (X:) on an enzyme attacks an electrophilic center on a substrate. 共價(jià)催化舉例-胰凝乳蛋白酶1. 親核催化中酶蛋白上最常見的提供親核基團(tuán)的殘基是（ ）A，His，Ser，Cys； B，His，Lys，Arg； C，Asp，Glu，Phe D，Asn，Gln，Trp 中國科學(xué)院中國科學(xué)院2005年年（五）、活性中心金屬離子的催化作用金屬酶和金屬-激活酶（1）通過結(jié)合底物位反應(yīng)定向；（2）通過可逆地改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)（3）通過靜電穩(wěn)定或屏蔽負(fù)電荷。 金屬離子的催化往往和

19、酸的催化相似，作用比質(zhì)子強(qiáng)，不少金屬離子有絡(luò)合作用，并且在中性 pH 溶液中，H+ 濃度很低，但金屬離子卻容易維持一定濃度。 金屬離子通過電荷的屏蔽促進(jìn)反應(yīng)。金屬離子通過水的離子化促進(jìn)親核催化。Hexokinase激酶真正的底物是 Mg2+ - ATP Carbonic Anhydrase: Zinc Activation of Water, The activated water (hydroxide ion) acts as a nucleophile親和基團(tuán) , attacking the carbon dioxide, forming bicarbonateCarbonic Anhyd

20、rase The bound zinc activates its water ligand - makes it more reactive 基元催化基元催化：由某些集團(tuán)或小分子催化的反應(yīng)，如 1、酸堿催化 2、共價(jià)催化；3、活性中心金屬離子 基元催化的分子機(jī)制基元催化的分子機(jī)制 思考題：思考題： 1. 酶的特殊基團(tuán)的催化作用是指酸堿催化、共價(jià)催化和（ ）中山大學(xué)中山大學(xué)2010年年2. 下列哪一項(xiàng)不是酶具有高催化效率的因素？ （ ） A、加熱 B、酸堿催化 C、“張力”和“形變” D、共價(jià)催化 E、鄰近定位效應(yīng)南京林業(yè)大學(xué)南京林業(yè)大學(xué)2003年年 多元催化和協(xié)同催化：多元催化多元催化和協(xié)同

21、催化：多元催化常常是幾個(gè)功能團(tuán)適當(dāng)排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活性中心處三個(gè)氨基酸殘基組成“電荷中繼網(wǎng)電荷中繼網(wǎng)”，催化肽鍵水解。電荷極化電荷極化為基元催化提供了催化基團(tuán)，如廣義的酸堿、親核基團(tuán)和親電基團(tuán)及金屬離子。（六）、多元催化與協(xié)同效應(yīng)電荷極化和多元催化(新版生化）Ser195、His57、Asp102 疏水環(huán)境疏水環(huán)境：酶的活性中心周圍的環(huán)境是一個(gè)非極性環(huán)境，即低介電環(huán)境低介電環(huán)境，在低的介電環(huán)境中排斥水分子，酶的催化基團(tuán)和底物分子的敏感鍵之間有很大的反應(yīng)力，有助于加速酶促反應(yīng)。如果酶的活性中心周圍是一個(gè)高介電環(huán)境中，活性中心就會有水分子存在，水分子對帶電離子有屏蔽作用，削弱帶電離子之

22、間的靜電作用，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。 在酶活性中心附近,往往有一電荷離子,可穩(wěn)定過渡態(tài)的離子,增加酶促反應(yīng)速度。 （七）活性中心的微環(huán)境三、 酶催化作用的實(shí)例（一）、溶菌酶（一）、溶菌酶（lysozyme) 溶菌酶存在于雞蛋清雞蛋清和動(dòng)物的眼淚動(dòng)物的眼淚中，其生物學(xué)功能是催化某些細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖水解，從而溶解細(xì)菌的細(xì)胞壁。溶菌酶是第一個(gè)用X-射線法闡明其全部結(jié)構(gòu)和功能的酶。是1922年倫敦細(xì)菌學(xué)家弗萊明(Fleming)首次發(fā)現(xiàn)的。為什么眼睛和口腔不易被細(xì)菌感染？為什么眼睛和口腔不易被細(xì)菌感染？2011年四川大學(xué)生物化學(xué)年四川大學(xué)生物化學(xué) 溶菌酶的底物溶菌酶的底物肽聚糖Lysozyme1. 底

23、物：底物：細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖， NAG和NAM交替排列形成多聚物，它們之間通過-1,4糖苷鍵相連。Penicillin2、溶菌酶結(jié)構(gòu) 溶菌酶由129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，是一個(gè)單鏈蛋白，分子內(nèi)含有四對二硫鍵?；钚灾行牡陌被釟埢荊lu35和Asp52 。從表面構(gòu)象看，酶的結(jié)構(gòu)不很緊密，大多數(shù)極性氨基酸殘基分布在分子的表面，非極性氨基酸殘基分布在分子的內(nèi)部。整個(gè)酶分子中有一狹長的裂縫一狹長的裂縫。最適底物正好與酶分子的凹穴相結(jié)合.溶菌酶水解D糖環(huán)和E糖環(huán)之間的糖苷鍵糖苷鍵。溶菌酶的最適小分子底物 酶的活性部位有一條溝，正好能容納6個(gè)多糖殘基形成的鏈。當(dāng)用含不同殘基數(shù)的寡聚NAG作實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)殘基數(shù)

24、達(dá)到6個(gè)時(shí)就可以作為有效的底物。 溶菌酶的最適小分子底物 O18水證明溶菌酶催化底物C1-O鍵裂解3. 溶菌酶催化特點(diǎn)小結(jié)（1）靠近與定向靠近與定向（2）底物形變底物形變：酶與底物結(jié)合后，D 糖環(huán)構(gòu)象發(fā)生變形，從正常的能量較低的椅式構(gòu)象變?yōu)槟芰枯^高的半椅式構(gòu)象。（3）廣義的酸堿催化廣義的酸堿催化（4）共價(jià)催化共價(jià)催化 ? 溶菌酶活性部位含有Glu35和Asp52，它們的側(cè)鏈羧基COOH的pK a 值分別為5.9和4.5。該酶最適pH（pH5.2），1. 這兩個(gè)殘基分別呈現(xiàn)什么樣的解離狀態(tài)（質(zhì)子化或否）？2. 這樣的解離狀態(tài)將使它們分別發(fā)揮什么樣的作用？（誰起酸催化作用？誰起穩(wěn)定正電荷作用？），

25、3. 根據(jù)該酶的pH-活性峰，請對這兩個(gè)殘基的解離與該酶的活性之間的關(guān)系給出恰當(dāng)?shù)慕忉尅?武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2007-2008年度第1學(xué)期期末考試武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2007-2008年度第一學(xué)期期末考試 溶菌酶活性部位含有Glu35和Asp52，它們的側(cè)鏈羧基COOH的pK a 值分別為5.9和4.5。該酶最適pH（pH5.2），溶菌酶兩種催化機(jī)理假說廣廣義義的的酸酸堿堿催催化化廣廣義義的的酸酸堿堿催催化化正正碳碳離離子子共共價(jià)價(jià)催催化化?D糖溶菌酶兩種催化機(jī)理假說(續(xù))廣義的酸堿催化廣廣義義的的酸酸堿堿催催化化溶菌酶催化機(jī)理假說(舊) Glu35的羧基起廣義酸堿催化，向底物D糖環(huán)和E糖環(huán)

26、之間的糖苷鍵上的氧原子提供一個(gè)質(zhì)子，氧原子與D糖環(huán)C1的糖苷鍵斷開，D糖環(huán)的C1 帶上正電荷成為正碳離子。Asp52上的-COO-起協(xié)調(diào)糖苷鍵斷裂和穩(wěn)定正碳離子的作用。 如溶菌酶主要活性基團(tuán)是Clu35的COOH和Asp62的COOH，在游離狀態(tài)下，Glu和Asp這兩個(gè)羧基的解離常數(shù)差異不顯著，但在酶分子內(nèi)， Clu35殘基處在非極性環(huán)境中，因此其-羧基不解離，為COOH形式，而Asp52殘基則處于極性微環(huán)境中，其COOH可解離，為COO-。由于微環(huán)境差異導(dǎo)致羧基解離狀態(tài)不同，從而使此酸可以利用相應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行酸堿催化反應(yīng)。牛胰核糖核酸酶A酶的活性中心：His12 His119 Lys41 Gen

27、eral BaseAGeneral Base General Acid2, 3-環(huán)磷酸酯中間產(chǎn)物（二）（二）、核糖核酸酶、核糖核酸酶AGeneral Acid General Base 核糖核酸酶核糖核酸酶A 核糖核酸酶是由核糖核酸酶是由124個(gè)氨基酸組成的一條多個(gè)氨基酸組成的一條多 肽鏈，肽鏈，含有四對二硫鍵，空間構(gòu)象為球狀分子。含有四對二硫鍵，空間構(gòu)象為球狀分子。 核糖核酸酶核糖核酸酶A 羧肽酶A（carboxypeptidaseA）是一個(gè)具有307氨基酸的單鏈蛋白質(zhì)，其中緊密地結(jié)合著一個(gè)鋅離子鋅離子，它對酶活性很重要。羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸殘基。（羧肽酶B：僅Arg

28、、Lys，如果C-末端第二個(gè)殘基是Pro,則酶A和酶B都不起作用.羧肽酶C能水解C-末端的Pro.）鋅離子在羧肽酶A的活性部位上與兩個(gè)組氨酸側(cè)鏈和一個(gè)谷氨酸側(cè)鏈和一個(gè)水分子相配位（三）、羧肽酶A（carboxypeptidaseA）催化中心催化中心結(jié)合中心結(jié)合中心羧肽酶羧肽酶A催化機(jī)理催化機(jī)理帶負(fù)電荷四面體帶負(fù)電荷四面體過渡態(tài)中間物過渡態(tài)中間物羧肽酶羧肽酶A催化機(jī)理催化機(jī)理(四）、絲氨酸蛋白酶 一些酶的活性中心一級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理相似，可把它們歸為一族。蛋白水解酶：蛋白水解酶：（1）絲氨酸蛋白酶家族（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等）（2）鋅蛋白酶家族（羧肽酶等）（3）

29、巰基蛋白酶家族（木瓜蛋白酶等）（4）羧基蛋白酶家族（胃蛋白酶等）沒有底物時(shí)沒有底物時(shí)結(jié)合底物時(shí)結(jié)合底物時(shí)電荷中繼網(wǎng)胰凝乳蛋白酶的催化三聯(lián)體 活性中心由Ser195、His57、Asp102 組成； 胰凝乳蛋白酶的催化三聯(lián)體 絲氨酸蛋白酶家族具有類似的Ser -His-Asp催化三聯(lián)體 電荷中繼網(wǎng)： 通過電荷中繼網(wǎng)進(jìn)行 沒有底物時(shí)： Ser195His57Asp102形成一個(gè)氫鍵體系， His57是去質(zhì)子化狀態(tài)， Asp102的COO-通過氫鍵定位并固定His57。 結(jié)合底物時(shí)： His57從Ser195接受一個(gè)質(zhì)子，增加了Ser195羥基氧原子對底物的親核攻擊性， Asp102的COO-穩(wěn)定過

30、度態(tài)中His57的正電荷形式。胰凝乳蛋白酶的活性中心結(jié)合部位結(jié)合部位：決定專一性催化部位絲氨酸蛋白酶的專一性 絲氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋內(nèi)的微環(huán)境（疏水性、電荷性質(zhì)）決定了絲氨酸蛋白酶的底物專一性趨異進(jìn)化 絲氨酸蛋白酶的趨異進(jìn)化P409P408絲氨酸蛋白酶的專一性 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 ：口袋較大，主要由疏水氨基酸殘基圍成，開口較大（由兩個(gè)Gly組成），因此需要底物有一個(gè)疏水基團(tuán)（芳香環(huán)Phe、Tyr、Trp及大的非極性側(cè)鏈）定位。裂解芳香族氨基酸羧基側(cè)的肽鍵 胰蛋白酶：胰蛋白酶：口袋較大，底部有Asp，利于 Lys.、Arg結(jié)合，裂解堿性氨基酸

31、殘基羧基側(cè)的肽鍵 彈性蛋白酶：彈性蛋白酶：口袋較淺，開口較?。ㄓ蒝al，Thr組成）只能讓Ala等小分進(jìn)入，裂解小的中性氨基酸殘基羧基側(cè)的肽鍵結(jié)合結(jié)合中心中心 4. 胰凝乳蛋白酶的催化機(jī)制P409 胰凝乳蛋白酶的催化機(jī)制P4092. 蛋白酶的酸堿催化作用加強(qiáng)了共價(jià)鍵化基團(tuán)對肽鍵碳原子的親核進(jìn)攻能力。（是非題） 中山大學(xué)中山大學(xué)2009年年 胰凝乳蛋白酶的催化機(jī)制 胰凝乳蛋白酶的催化機(jī)制Activation Of Ser residuecovalent linkage with carbonyl group of polypeptide chain andFormation of tetrahe

32、dral inter-mediate transition state Cleavage of peptide bond,釋放C端肽鏈第第1次四面體過渡態(tài)中間物次四面體過渡態(tài)中間物第1階段：?；?胰凝乳蛋白酶的催化機(jī)制Activation of water molecule by pairing with its hydrogen atom (through a basic residue)Formation of second tetrahedral intermediate transition stateRegeneration of Ser residue by a protonate

33、d basic residue第2次四面體過渡態(tài)中間物第2 階段：脫酰胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制第1階段： 酰化 Ser195-OH 中的氧攻擊肽鍵的羰基碳（共價(jià)催化），酶的His57咪唑H+與底物中的-NH形成氫鍵（酸堿催化），形成四聯(lián)體過渡態(tài)（Ser195O-、底物的羰基C、底物的-NH、His的咪唑H+ ），肽鍵斷裂氨基產(chǎn)物釋放，底物的羧基部分共價(jià)酯化到Ser195的羥基上。第2階段： 脫酰 電荷中繼網(wǎng)從水中吸收一個(gè)質(zhì)子，結(jié)果產(chǎn)生的OH-攻擊連在Ser195上底物的羰基C原子，形成四聯(lián)體過渡態(tài)，然后His57供出一個(gè)質(zhì)子給Ser195上的氧原子，底物中的酸成分從Ser195上釋放?？莶輻U

34、菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶 趨同進(jìn)化趨同進(jìn)化The overall folds of two members of different superfamilies of serine protease. The enzymes are chymotrypsin (top) and subtilisin (bottom). The residues in the catalytic triad are indicated for each)來源不同，功能特征相同，稱異源的趨同進(jìn)化。 胰凝乳蛋白酶中是：胰凝乳蛋白酶中是： Asp102-His57-Ser195 枯草桿菌蛋白酶是：枯草桿菌蛋白酶是： A

35、sp32-His64-Ser221Chymotrypsin 絲氨酸蛋白酶的趨同進(jìn)化 In summary of Serine Proteases胰凝乳蛋白酶典型的催化機(jī)制： 廣義酸堿催化 共價(jià)催化?；钚灾行挠蒘er195-His57-Asp102組成；1. Asp102的確定:identified by X-ray crystallography2. Ser195的確定:用DIFP（二異丙基氟磷酸）-化學(xué)修飾。3. His57的催化活性確定：用不可逆抑制劑TPCK-親核標(biāo)記。水解過程分?；ˋcylation）和脫酰（Deacylation）兩個(gè)階段。課后題課后題 9. 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶

36、和彈性蛋白酶作為催化劑有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶作為催化劑有哪些相似之處？有哪些不同之處？在酶的分子結(jié)構(gòu)上是哪些因哪些相似之處？有哪些不同之處？在酶的分子結(jié)構(gòu)上是哪些因素引起這些差異？素引起這些差異？ 答：相似之處：執(zhí)行相同的反應(yīng)裂解肽鍵；其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制很相似；相對分子質(zhì)量范圍在 2.5103 ， 并且具有相似的順序和三級結(jié)構(gòu)； 3 個(gè)極性殘基His57、Asp102 和 Ser195 在活性部位形成催化三聯(lián)體。 不同之處：專一性不同 它們的活性中心是由兩個(gè)天冬氨酸殘基所組成，如由胃膜分泌的胃蛋白酶、腎臟中的血管緊張素釋放酶及細(xì)胞溶酶體中的某些組織蛋白酶等。 胃蛋白酶是典型的天門冬

37、氨酰蛋白酶。一條肽鏈，相對分子質(zhì)量為35103；胃蛋白酶的活性中心含有一水分子，水分子的兩翼是Asp 215和Asp32（當(dāng)一個(gè)天冬氨酸為離子化形式，另一個(gè)為非離子化形式時(shí)酶才表 現(xiàn)其活性；天冬氨酸在酶的催化過程中起兩個(gè)作用：激活它們之間的水分子，充當(dāng)質(zhì)子 的受體和質(zhì)子的供體，形成催化二聯(lián)體催化二聯(lián)體，進(jìn)行廣義的酸堿催化）。 （五）、天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸天冬氨酸-活化水活化水思考題1. 胃蛋白酶偏酸性，這說明其有哪些官能團(tuán)？有哪些氨基酸提供這些官能團(tuán)？ 大連理工大學(xué)2012年 2. 蘇州大學(xué)2004 年生物化學(xué)考研試題 1) 舉例說明競爭性抑制原理及應(yīng)用 2) 以溶菌酶或糜蛋白酶為例說明酶作

38、用機(jī)理 思考題3. 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)相似，活性中心的絲氨酸附近的氨基酸序列也完全相同， 但作用的底物各不相同。 試根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)推測三種酶作用部位的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 廈門大學(xué)2004年4. 胰凝乳蛋白酶的活性中心中構(gòu)成一個(gè)電荷中繼網(wǎng)的三個(gè)氨基酸殘基是: ( ) A, HIS,Arg,Glu B ,Ser,Lys,Asp C, Ser,His,Asp D, Ser,Arg,Glu江蘇大學(xué)2005年思考題5. 利用DIFP對胰凝乳蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾,DIFP在溫和條件下只與酶上的一個(gè)Serl95結(jié)合,化學(xué)修飾后,酶失去活性,且此酶也不能再與最適底物類似物TPCK結(jié)合,說明

39、Serl95是（）: A. 別構(gòu)部位 B. 催化部位C. 底物結(jié)合部位 D. 與酶的催化活性無關(guān)。 天津工業(yè)大學(xué)2007年四 、 酶活性的調(diào)節(jié)控制調(diào)節(jié)酶：活性可被調(diào)節(jié)的酶，主要是2. 酶在生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)主要有別構(gòu)調(diào)節(jié)和（ ）? 中山大學(xué)2009生物化學(xué)別構(gòu)酶別構(gòu)酶共價(jià)修飾酶共價(jià)修飾酶（1）別構(gòu)效應(yīng)別構(gòu)效應(yīng)（又稱為變構(gòu)效應(yīng)）：酶分子的非催化部位與某些化合物可逆的非共價(jià)鍵結(jié)合，導(dǎo)致酶的構(gòu)象變化和活性改變。（某些物質(zhì)能以非共價(jià)鍵形式與酶活性中心以外特定部位結(jié)合,使酶蛋白分子構(gòu)象發(fā)生改變,從而改變酶的活性.）（2）別構(gòu)酶別構(gòu)酶：各種配體與酶的結(jié)合后，發(fā)生的構(gòu)象變化，導(dǎo)致后繼配體的親和力改變的酶,結(jié)構(gòu)上

40、已知的別構(gòu)酶都是寡聚酶，功能上別構(gòu)酶多是代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶關(guān)鍵酶 別構(gòu)調(diào)節(jié)不引起酶的構(gòu)型變化，不涉及共價(jià)鍵變化。P413 （一）別構(gòu)調(diào)節(jié)（3）. 別構(gòu)效應(yīng)物別構(gòu)調(diào)節(jié)物別構(gòu)調(diào)節(jié)物（別構(gòu)效應(yīng)物：Allosteric effectors）：與別構(gòu)酶分子中的別構(gòu)中心（調(diào)節(jié)中心）非共價(jià)結(jié)合后，誘導(dǎo)生或穩(wěn)定了酶分子的某種構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)酶活性中心對底物的結(jié)合。 A positive effector activates the enzyme (an activator). A negative effector inhibits the enzyme (an inhibitor). (1) 根據(jù)配體性質(zhì)分：

41、同促效應(yīng)同促效應(yīng)：當(dāng)一個(gè)效應(yīng)物與酶結(jié)合后，影響另一相同的效應(yīng)物與酶的結(jié)合。 異促效應(yīng)異促效應(yīng)：當(dāng)一個(gè)效應(yīng)物與酶結(jié)合后，影響另一不同效應(yīng)物與酶另一部分結(jié)合。(2) 協(xié)同效應(yīng)：一個(gè)效應(yīng)物分子與變構(gòu)酶的結(jié)合，對第二個(gè)效應(yīng)物分子的結(jié)合產(chǎn)生影響，為協(xié)同效應(yīng) 正協(xié)同效應(yīng)正協(xié)同效應(yīng)：指效應(yīng)物分子與變構(gòu)酶的結(jié)合后，本身構(gòu)象發(fā)生變化，有利于后續(xù)底物分子或調(diào)節(jié)物分子的結(jié)合 負(fù)協(xié)同效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)：指效應(yīng)物分子與變構(gòu)酶的結(jié)合后，本身構(gòu)象發(fā)生變化，不利于后續(xù)底物分子或調(diào)節(jié)物分子的結(jié)合2、別構(gòu)效應(yīng)的種類：P248別構(gòu)效應(yīng)的種類別構(gòu)效應(yīng)的種類3. 別構(gòu)酶的性質(zhì)(1) 已知的別構(gòu)酶一般都是寡聚酶，通過次級鍵結(jié)合。(2) 具有活

42、性中心和別構(gòu)中心（調(diào)節(jié)中心），活性中心和別 構(gòu)中心處在不同的亞基上或同一亞基的不同部位上。(3) 多數(shù)別構(gòu)酶不止一個(gè)活性中心，活性中心間有同位效應(yīng)， 底物就是調(diào)節(jié)物：有的別構(gòu)酶 不止一個(gè)別構(gòu)中心，可以接受不 同的代謝物（非底物）的調(diào)節(jié)。P418判斷：別構(gòu)酶都是寡聚酶南開大學(xué)南開大學(xué)2006年年 不遵循米式方程，動(dòng)力學(xué)曲線是S型（正協(xié)同效應(yīng)）或表觀雙曲線（負(fù)協(xié)同效應(yīng)）VS的動(dòng)力學(xué)曲線米氏酶：rectangular hyperbolic curve(直角的雙曲線直角的雙曲線) 別構(gòu)酶同促效應(yīng)的： 同促同促正正協(xié)同效應(yīng)協(xié)同效應(yīng):-S-形曲線 同促同促負(fù)負(fù)協(xié)同效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)：表觀雙曲線 不加激活劑或抑制

43、劑不加激活劑或抑制劑P418 4. 別構(gòu)酶的VS的動(dòng)力學(xué)曲線 別構(gòu)酶同促效應(yīng)的動(dòng)力學(xué) 試用動(dòng)力學(xué)曲線圖區(qū)分非調(diào)節(jié)酶,正協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)酶和負(fù)協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)酶并加以解釋(15分).S-形曲線直角的雙曲線表觀雙曲線杭州師范大學(xué)2008 年 同促正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶是同促正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶是S型曲線型曲線當(dāng)?shù)孜餄舛劝l(fā)生較小變化時(shí)，別構(gòu)酶可以極大程度地控制反應(yīng)速度。米氏酶： S0.9/S0.1=81別構(gòu)酶（n=4）：S0.9/S0.1=3表明表明反應(yīng)速度對底物濃度的變化敏感，當(dāng)?shù)孜餄舛劝l(fā)生較小變化時(shí)，如上升3倍，別構(gòu)酶的酶促反應(yīng)速度可以從0.1Vmax升至0.9Vmax 。 同促負(fù)協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶是同促負(fù)協(xié)同

44、效應(yīng)的別構(gòu)酶是表觀雙曲線表觀雙曲線表明反應(yīng)速度對底物濃度的變化不敏感同促效應(yīng)加激活劑加激活劑加抑制劑加抑制劑 別構(gòu)酶同促效應(yīng)加調(diào)節(jié)物的動(dòng)力學(xué)異促效應(yīng)異促效應(yīng)調(diào)節(jié)物的別構(gòu)效應(yīng)(異促效應(yīng)）異促效應(yīng)）當(dāng)增加正調(diào)節(jié)物正調(diào)節(jié)物濃度時(shí)，Km減小，親和力增大，協(xié)同性減?。▽Φ孜餄舛鹊姆磻?yīng)靈敏度降低）。當(dāng)增加負(fù)調(diào)節(jié)物負(fù)調(diào)節(jié)物的濃度時(shí)，Km增加，親和力減小，協(xié)同性增大（對底物濃度的反應(yīng)靈敏度增加異促效應(yīng)異促效應(yīng)Hill系數(shù)法 米氏酶：n = 1 別構(gòu)酶-正協(xié)同： n1 ，越大，正協(xié)同性越大 別構(gòu)酶-負(fù)協(xié)同： n1 ，越小，負(fù)協(xié)同性越大協(xié)同指數(shù)（CI），又稱為飽和比值（Rs) 雙倒數(shù)作圖不是直線 脫敏作用（P41

45、9)： 理化處理后，仍保持活性，但失去調(diào)節(jié)性質(zhì)。脫敏后的別構(gòu)酶表現(xiàn)為米式酶的動(dòng)力學(xué)曲線P4195、別構(gòu)酶的區(qū)分Rs = 酶與底物結(jié)合達(dá)到90%飽和度時(shí)的底物濃度 酶與底物結(jié)合達(dá)到10%飽和度時(shí)的底物濃度 米氏酶：當(dāng)反應(yīng)速率為0.9Vmax時(shí)，S=9Km當(dāng)反應(yīng)速率為0.1Vmax時(shí)，S=1/9Km Rs=81正協(xié)同：Rs81，越小，正協(xié)同性越大負(fù)協(xié)同：Rs81，越大，負(fù)協(xié)同性越大 飽和比值（saturation ratio, Rs)nnmnmsKKYYR11181)9 . 01 . 0()1 . 09 . 0(1 . 09 . 0米氏酶：Rs = 81正協(xié)同：Rs 81負(fù)協(xié)同：Rs 81 Hil

46、l系數(shù)法 米氏酶：n=1 正協(xié)同： n1 ，越大，正協(xié)同性越大 負(fù)協(xié)同： n1 ，越小，負(fù)協(xié)同性越大Hill系數(shù)法6、別構(gòu)酶調(diào)節(jié)活性的機(jī)理-別構(gòu)模型別構(gòu)模型(1)、齊變模型齊變模型 （WMC模型）模型）（協(xié)同模型）（協(xié)同模型）（對稱模型）（對稱模型） (2)、序變模型序變模型（KNF模型模型）不能解釋負(fù)協(xié)同P419別構(gòu)酶調(diào)節(jié)活性的機(jī)理齊變模型（WMC模型）亞基以對稱方式排列，整個(gè)酶分子以兩種構(gòu)象存在，松弛型（R）和緊張型（T）。R型有利于與底物結(jié)合，T型不利于與底物結(jié)合。同一酶分子中不存在構(gòu)象雜合體（RT態(tài)），它的亞基要么是R型，要么是T型。兩種構(gòu)象狀態(tài)間的轉(zhuǎn)變，對每個(gè)亞基來說都是同時(shí)的，齊步

47、發(fā)生的。 當(dāng)?shù)孜锊淮嬖跁r(shí)，絕大多數(shù)酶分子均為T型，加入底物后，T型各亞基齊步向R型轉(zhuǎn)變。不能解釋負(fù)協(xié)同 (2)、序變模型Sequential Theory (ligand-induced theory)序變模型是近年來更為普遍運(yùn)用的模型。其主要是依據(jù)這樣一種設(shè)想，即一個(gè)配體可以誘導(dǎo)它要結(jié)合的亞基的三級結(jié)構(gòu)的變化。這個(gè)亞基-配體復(fù)合體又能夠改變相鄰亞基的構(gòu)象。這一模型特別強(qiáng)調(diào)對于配體只有一種形狀是親和力最高的，但與齊變模型不同的是在具有部分飽和的一個(gè)寡聚分子中允許存在著高親和力和低親和力的亞基（右圖b）。 Mixture of T subunits and R subunits is possi

48、ble. Binding of S converts only that subunit from T to R 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ATCase）：是了解最清楚的一個(gè)別構(gòu)酶。它催化嘧啶核苷酸合成途徑中的第一個(gè)中間物N 氨甲酰天冬氨酸的合成，ATCase受其代謝途徑的終產(chǎn)物CTP 的別構(gòu)抑制。 9、別構(gòu)酶舉例P413天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ATCase）（1）、結(jié)構(gòu)： ATCase 由兩個(gè)三聚體構(gòu)成的催化亞基（C3）和三個(gè)二聚體構(gòu)成的調(diào)節(jié)亞基（r2）組成。當(dāng)催化亞基和調(diào)節(jié)亞基混合時(shí)能迅速結(jié)合。（2）、特點(diǎn)：同促效應(yīng)：異促效應(yīng)正協(xié)同：天冬氨酸抑制劑 CTP激活劑 ATP表現(xiàn)出齊變模型特征 ATCas

49、e reaction and its kineticsAllosteric effects in ATCase CTP is an inhibitor ATP is an activator Sigmoidal kinetics天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ATCase） 天冬氨酸的結(jié)合具有正協(xié)同的效應(yīng)（所以反應(yīng)速度對天冬氨酸濃度作圖得到的是S形曲線） CTP終產(chǎn)物反饋抑制：降低酶與底物的親和力，不改變Vmax CTP使得原來的S曲線更為明顯，表明天冬氨酸結(jié)合ATCase的過程中具有更大的協(xié)同性。 ATP激活：增加酶與底物的親和力，不改變Vmax，別構(gòu)激活劑ATP的存在使得S型曲線向雙曲線漂移，降低了底

50、物對酶結(jié)合的協(xié)同性課后題課后題-11 對于 ATCase 來說，琥珀酸起著 Asp（兩個(gè)底物中的一個(gè)）的競爭抑制作用。 對Asp的依賴關(guān)系見圖A（假設(shè)這些實(shí)驗(yàn)中第二種底物是過量的并可忽略）。在圖B種Asp維持在低水平（圖A種箭頭所指處）不變，并加入一系列含量遞增的琥珀酸。琥珀酸不能作為底物參與反應(yīng)。請解釋這些結(jié)果。思考題思考題1、 有時(shí)別構(gòu)酶的活性可以被低濃度的競爭性抑制劑激活， 請解釋 江南大學(xué)2008年天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ATCase）（4）、N一磷乙?；鵏一天門冬氨酸（PALA）是研究天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酸酶（ATCase）性質(zhì)的特異性試劑？（為ATCase強(qiáng)的抑制劑），P

51、ALA的結(jié)構(gòu)與ATCase兩個(gè)底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)類似，即與氨甲酸一天門冬氨酸復(fù)合物的結(jié)構(gòu)類似。PALA是結(jié)合在ATCase的活性部位。比較ATCase和ATCasePALA復(fù)合物的X一射線衍射分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PALA的結(jié)合伴隨著ATCase四級結(jié)構(gòu)的重大變化。 為什么說PALA是研究ATCase性質(zhì)的特異性試劑？ 南開大學(xué)生物化學(xué)精品課程南開大學(xué)生物化學(xué)精品課程思考題1、下列關(guān)于酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)，錯(cuò)誤的是 A受別構(gòu)調(diào)節(jié)的酶稱為別構(gòu)酶 B別構(gòu)酶多是關(guān)鍵酶（如限速酶），催化的反應(yīng)常是不可逆反應(yīng) C別構(gòu)酶催化的反應(yīng)，其反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是符合米-曼氏方程的 D別構(gòu)調(diào)節(jié)是快速調(diào)節(jié) E別構(gòu)調(diào)節(jié)不引起酶的構(gòu)型變化2、

52、別構(gòu)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)是（ABCDE ）A.別構(gòu)劑與酶分子的非催化部位結(jié)合B.使酶蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,從而改變酶的活性C. 酶分子多有調(diào)節(jié)亞基和催化亞基D. 是一種快速調(diào)節(jié) E.別構(gòu)酶常常是代謝途徑的限速酶思考題思考題3、變構(gòu)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)是：（ ） A、變構(gòu)劑與酶分子上的非催化部位結(jié)合。 B、使酶蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶活性。 C、酶分子多有調(diào)節(jié)亞基和催化亞基。 D、變構(gòu)調(diào)節(jié)都產(chǎn)生正效應(yīng)，即加快反應(yīng)速度。 蘇州大學(xué)2008生物化學(xué)思考題思考題4. 別構(gòu)酶總是寡聚酶（判斷）5抗體酶是水解抗體的酶的總稱。（判斷）江南大學(xué)2010年生物化學(xué) 6. 試從生物學(xué)進(jìn)化的角度解釋為什么生命體中存在大量的別構(gòu)酶。（6

53、分） 復(fù)旦大學(xué)2007年生物化學(xué)7，對于一個(gè)正協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)酶當(dāng)有激活劑（正調(diào)節(jié)物）存在下，其協(xié)同性（ ）A，減??；B，增加；C，不變 中國科學(xué)院中國科學(xué)院20200505年年思考題思考題8. 華南理工大學(xué)2006年 1) 下列關(guān)于別構(gòu)酶的敘述，哪一項(xiàng)時(shí)錯(cuò)誤的？下列關(guān)于別構(gòu)酶的敘述，哪一項(xiàng)時(shí)錯(cuò)誤的？( (單選單選) ) A. 所有別構(gòu)酶都是多聚體，而且亞基數(shù)目往往是偶數(shù) B. 別構(gòu)酶除了活性部位外，還含有調(diào)節(jié)部位 C. 亞基與底物結(jié)合的親和力因亞基構(gòu)象不同而變化 D. 亞基構(gòu)象改變時(shí)，要發(fā)生肽鍵斷裂的反應(yīng) E. 酶構(gòu)象改變后，酶活力可以升高也可以降低 2) 根據(jù)調(diào)節(jié)物分子不同，別構(gòu)效應(yīng)分別為_和

54、_。根據(jù)調(diào)節(jié)物使別構(gòu)酶反應(yīng)速度對S敏感性不同分為_和_。（二） 可逆的共價(jià)修飾的調(diào)控P424 1、定義 （1）共價(jià)修飾調(diào)節(jié)：酶蛋白分子中的某些基團(tuán)可以在其他酶的催化下發(fā)生可逆的共價(jià)修飾,從而導(dǎo)致酶活性的改變,稱為共價(jià)修飾. （2）共價(jià)調(diào)節(jié)酶（covalent regulatory enzyme） 是一類由其它酶對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行可逆共價(jià)修飾，使其處于活性和非活性的互變狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)酶活性。區(qū)分：共價(jià)催化Covalent catalysis 共價(jià)催化：酶作為親核基團(tuán)或親電基團(tuán)，與底物形成一個(gè)反應(yīng)活性很高的共價(jià)中間物，此中間物易變成過渡態(tài)，反應(yīng)活化能大大降低，提高反應(yīng)速度。2、可逆共價(jià)修飾的類型l（1）

55、磷酸化與脫磷酸化（最常見） 、Tyr、Ser、Thr、His；l（2）腺苷?；兔撓佘栈邮苄揎椀陌被釟埢篢yr；l（3）尿苷?；兔撃蜍挣；?Tyr；l（4）ADP-核糖基化 Arg.Gln.Cys；l（5）甲基化和脫甲基化 Glul（6）乙?；兔撘阴；?、例如例如（1）大腸桿菌谷氨酰胺合成酶的腺苷?；c脫腺苷 ?；l(fā)生在Tyr而失活 （2）糖原磷酸化酶磷酸化（絲氨酸）有活性共價(jià)修飾調(diào)節(jié)糖原磷酸化酶的調(diào)節(jié)別構(gòu)調(diào)節(jié)肌肉中caffeine 咖啡因（肝臟或肌肉中）級聯(lián)放大效應(yīng)糖原分解少少3、化學(xué)修飾與別構(gòu)調(diào)節(jié)的異同點(diǎn)比較別構(gòu)調(diào)節(jié)和化學(xué)修飾調(diào)節(jié)的異同及各自在代謝中的作用？2010年中科院生化與分

56、子真題年中科院生化與分子真題（三）、酶原及酶原的激活1、定義 （1）酶原（zymogen）：有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時(shí)， 無活性前體形式，叫做酶原。（2）酶原的激活 ：從無活性的酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿傅倪^程。（3）酶原激活的本質(zhì)：酶原的激活實(shí)質(zhì)上是酶活性 部位形成 或暴露的過程2、酶原激活特點(diǎn)：常伴有一級結(jié)構(gòu)（構(gòu)型）的改變具有不可逆性。P4213、酶原與酶原激活的生理意義：酶原及酶原的激活 （1）、保護(hù)組織器官本身免受酶的水解破壞； （2）、保證酶在特定時(shí)空發(fā)揮催化作用； （3）、酶原可視作酶的儲存形式。4、舉例：消化系統(tǒng)中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶， 胃蛋白酶），血液凝固系統(tǒng)中的酶。（復(fù)習(xí)

57、一下蛋白 酶的專一性）急性胰腺炎自激活由胰蛋白酶激活課后課后12.試解釋為什么胰凝乳蛋白不能像胰蛋白酶那樣自我激活？胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活）酶原及酶原的激活酶原及酶原的激活- -胰蛋白酶為什么可以自激活？自激活？自激活？舉例胰蛋白酶原的激活4. 胃蛋白酶的激活過程胃蛋白酶的激活過程某些酶原的激活過程某些酶原的激活過程思考題思考題1. 南開大學(xué)南開大學(xué)2001生物化學(xué) 1） 在胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)的催化過程中，活性中心Ser羥基的( ) 和His咪唑基的（ ） 作用起著重要作用。 2）酶的活性中心是酶分子中由（ ） 形成的功能區(qū)域，它的二個(gè)功能單位為（ ） 和（

58、 ）。2. 南開大學(xué)南開大學(xué)2002生物化學(xué) 欲較徹底的水解絲心蛋白，選用（ ）為宜。 A.彈性蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.胰凝乳蛋白酶 D.嗜熱菌蛋白酶3. 華東師范大學(xué)華東師范大學(xué)2005生物化學(xué) 胰凝乳蛋白酶專一水解多肽鏈中 （A）堿性氨基酸殘基N端 （B）酸性氨基酸殘基N瑞 （C） 堿性氨基酸殘基C端 （D）酸性氨基酸殘基C端 （E）芳香族氨基酸殘基C端4. 復(fù)旦大學(xué)復(fù)旦大學(xué)2004生物化學(xué) 胰凝乳蛋白酶能在、和的端切斷肽鍵。思考題思考題5. 2003年中國科學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)試題 下列哪種酶的巰基參與催化肽鍵斷裂反應(yīng) A. 羧肽酶A B.胃蛋白酶 C.木瓜蛋白酶 D.胰凝乳蛋白酶

59、6. 酶原激活的實(shí)質(zhì)是 A. 激活劑與酶結(jié)合使酶激活 B. 酶蛋白的變構(gòu)效應(yīng) C. 酶原分子一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而形成或暴露出酶的活性中心 D. 酶原分子的空間構(gòu)象發(fā)生了變化而一級結(jié)構(gòu)不變 E. 以上都不對 華南理工大學(xué)華南理工大學(xué)2006年年7. 酶剛合成時(shí)都以酶原形式存在。（判斷） 華東師范大學(xué)華東師范大學(xué)2006 六、同工酶 Isoenzyme or isozyme1、定義：能催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但存在多種四級締合形式，并因而在物理、化學(xué)和免疫學(xué)方面都有差異的一組酶。存在于生物的同一種屬或同一個(gè)體的不同組織中，甚至同一組織、同一細(xì)胞中，同工酶一般為寡聚酶，有兩種或兩種以上的亞基組成。乳酸脫

60、氫酶乳酸脫氫酶（LDH）是1959年發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)同工酶。 （1）結(jié)構(gòu)：由4個(gè)亞基組成的寡聚酶，亞基分為M型和H型。因此可以裝配成五五種四聚體：即LDH1（H4）、LDH-2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH-4（HM3）及LDH-5（M4），可用電泳方法將其分離。脊椎動(dòng)物心臟中主要是 LDH1，而骨骼肌的則是LDH5乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 心肌心肌:LDH1乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 LDH5骨骼肌骨骼肌:2、同工酶物理性質(zhì)：（1）Aa組成和順序不同（2）催化特性不同，對同一底物的Km值不 同，但活性部位相似（3）電泳行為不同