核酸分子雜交

1、核酸分子雜交一、概念：一、概念：1 1、分子雜交、分子雜交（hybridization) :有一定同源性的兩條核酸單鏈有一定同源性的兩條核酸單鏈，在適宜的溫度和離子濃度等條件下，通過(guò)堿基互補(bǔ)退火形成，在適宜的溫度和離子濃度等條件下，通過(guò)堿基互補(bǔ)退火形成穩(wěn)定的雙鏈分子的過(guò)程穩(wěn)定的雙鏈分子的過(guò)程 。2、 （bloting）：將：將DNADNA、RNARNA或蛋白質(zhì)固定到固體支持物上的過(guò)或蛋白質(zhì)固定到固體支持物上的過(guò)程。程。3、探針（、探針（probe）：核酸探針是指用放射性核素、生物素或）：核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，

2、能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知已知DNA或或RNA片段。片段。4、種類：、種類：固相雜交（固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的）是將變性的DNA固固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。交，故也稱為膜上印跡雜交。 液相雜交（液相雜交（solution hbridization）指使變性的待測(cè)核酸單鏈）指使變性的待測(cè)核酸單鏈與已知的核酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合與已知的核酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。物。DNA與與DNA

3、雜交雜交DNA與與RNA雜交雜交RNA與與RNA雜交雜交5、幾種常見(jiàn)的雜交：、幾種常見(jiàn)的雜交： 分子雜交是通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上分子雜交是通過(guò)各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的示出目的DNA或或RNA分子所處的位置。根據(jù)被測(cè)定的對(duì)象分子所處的位置。根據(jù)被測(cè)定的對(duì)象，分子雜交基本可分為以下幾大類：，分子雜交基本可分為以下幾大類：(1) Southern雜交：雜交：DNA片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中片段經(jīng)電泳分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針

4、雜交。被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。被檢對(duì)象為檢對(duì)象為DNA，探針為，探針為DNA或或RNA。(2) Northern雜交：雜交：RNA片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到片段經(jīng)電泳后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上或尼龍膜，然后用探針雜交。被檢對(duì)象為硝酸纖維素濾膜上或尼龍膜，然后用探針雜交。被檢對(duì)象為RNA,探針為探針為DNA或或RNA。二、二、Southern雜交雜交1、步驟：、步驟： Southern雜交可用來(lái)檢測(cè)經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的雜交可用來(lái)檢測(cè)經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列，它包括下列步驟片段中是否存在與探針同源的序列，它包括下列步驟:(1)

5、 酶切酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段凝膠電泳分離各酶切片段,然后使然后使DNA原位原位變性。變性。(2) 將將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍硝酸纖維素濾膜或尼龍膜膜)上。上。(3) 預(yù)雜交濾膜預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。(4) 讓探針與同源讓探針與同源DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異片段雜交，然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。性結(jié)合的探針。(5) 通過(guò)顯影檢查目的通過(guò)顯影檢查目的DNA所在的位置。所在的位置。 Southern雜交能否檢出雜交信號(hào)取決于很多因素，包括雜交能否檢出雜交信號(hào)取決于很多因素，包括目的目的DNA

6、在總在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的濾膜上的DNA量以及探針與目的量以及探針與目的DNA間的配對(duì)情況等。在最佳間的配對(duì)情況等。在最佳條件下，放射自顯影曝光數(shù)天后條件下，放射自顯影曝光數(shù)天后, Southern雜交能很靈敏地檢雜交能很靈敏地檢測(cè)出低于測(cè)出低于0.1pg與與32 P標(biāo)記的高比活性探針的標(biāo)記的高比活性探針的(109 cpm/g)互互補(bǔ)補(bǔ)DNA。如果將。如果將10g基因組基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長(zhǎng)度為轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸的探針雜交，曝光過(guò)夜，則可檢測(cè)出哺乳動(dòng)物幾百個(gè)核苷酸的探針雜交，曝光過(guò)夜，則可檢

7、測(cè)出哺乳動(dòng)物基因組中基因組中1kb大小的單拷貝序列。大小的單拷貝序列。2、固體支持物的種類：、固體支持物的種類： 帶正電荷的尼龍膜、硝酸纖維膜、帶正電荷的尼龍膜、硝酸纖維膜、PVDF膜膜 尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，價(jià)格最便宜；維素膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，價(jià)格最便宜；PVDF膜介于二者之間。膜介于二者之間。 尼龍膜結(jié)合尼龍膜結(jié)合DNA和和RNA能力可達(dá)能力可達(dá)480600g/cm2，可結(jié)，可結(jié)合短至合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和

8、和RNA能能力可達(dá)力可達(dá)80100g/cm2，對(duì)于，對(duì)于200bp的核酸片段結(jié)合不強(qiáng)；的核酸片段結(jié)合不強(qiáng)；PVDF膜結(jié)合膜結(jié)合DNA和和RNA能力可達(dá)能力可達(dá)125300g/cm2。 尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。合于蛋白印跡。 就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng)；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng)；硝酸纖維素

9、膜較脆，易破碎；PVDF膜較強(qiáng)。膜較強(qiáng)。 就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針?lè)肿涌山?jīng)堿變性被洗脫下來(lái)；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使探針?lè)肿涌山?jīng)堿變性被洗脫下來(lái)；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；用；PVDF膜可以重復(fù)使用。膜可以重復(fù)使用。3、轉(zhuǎn)膜的方式：、轉(zhuǎn)膜的方式：將將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有3種種:(1)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移。本方法由毛細(xì)管轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明，故又稱為發(fā)明，故又稱為Southern轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移(或印跡或印跡)。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單

10、,不需不需要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng)要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng),轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱。轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱。(2)電泳轉(zhuǎn)移。將電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后變性后,可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是不需要脫嘌呤上。該法的優(yōu)點(diǎn)是不需要脫嘌呤/水解作用，可直接轉(zhuǎn)移較大水解作用，可直接轉(zhuǎn)移較大的的DNA片段。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大，溫度難以控制。通常只有片段。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大，溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無(wú)效時(shí)，才采用電泳轉(zhuǎn)移。當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無(wú)效時(shí)，才采用電泳轉(zhuǎn)移。(3) 真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品

11、化儀器,它們一般是將硝它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上，再將凝膠置酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上，再將凝膠置于濾膜上，緩沖液從上面的一個(gè)貯液槽中流下，洗脫出凝膠中于濾膜上，緩沖液從上面的一個(gè)貯液槽中流下，洗脫出凝膠中的的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速，在使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速，在30分鐘內(nèi)就分鐘內(nèi)就能從正常厚度能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度和正常瓊脂糖濃度(1%)的凝膠中定量的凝膠中定量地轉(zhuǎn)移出來(lái)。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號(hào)比地轉(zhuǎn)移出來(lái)。轉(zhuǎn)移后得到的雜交信號(hào)比Southern轉(zhuǎn)移強(qiáng)轉(zhuǎn)移強(qiáng)2-3倍。缺點(diǎn)是如不小心，會(huì)使凝膠碎裂，并

12、且在洗膜不嚴(yán)格時(shí)，其倍。缺點(diǎn)是如不小心，會(huì)使凝膠碎裂，并且在洗膜不嚴(yán)格時(shí)，其背景比毛細(xì)轉(zhuǎn)移要高。背景比毛細(xì)轉(zhuǎn)移要高。4、毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜用的溶液：、毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜用的溶液：（1）高鹽溶液：）高鹽溶液：1.5M NaCl（2）0.4N NaOH如果如果DNA分子大，可以用分子大，可以用0.25N HCL處理或用紫外線處理，將處理或用紫外線處理，將DNA分子適當(dāng)打斷，以提高轉(zhuǎn)移的效果，注意處理的時(shí)間適度！分子適當(dāng)打斷，以提高轉(zhuǎn)移的效果，注意處理的時(shí)間適度！5、轉(zhuǎn)膜后、轉(zhuǎn)膜后DNA的固定方式：的固定方式：轉(zhuǎn)膜后，膜用轉(zhuǎn)膜后，膜用2SSC漂洗，然后固定：漂洗，然后固定：（1）80干烤干烤0.5-2小

13、時(shí)；小時(shí)；（2）254nm波長(zhǎng)的紫外線照射尼龍膜帶波長(zhǎng)的紫外線照射尼龍膜帶RNA的一面。的一面。后一種方法較為繁瑣后一種方法較為繁瑣,但卻優(yōu)先使用但卻優(yōu)先使用,因?yàn)槟承┡?hào)的帶正電荷因?yàn)槟承┡?hào)的帶正電荷的尼龍膜經(jīng)此處理后的尼龍膜經(jīng)此處理后,雜交信號(hào)可以增強(qiáng)。然而為獲得最佳效果雜交信號(hào)可以增強(qiáng)。然而為獲得最佳效果,務(wù)必確保尼龍膜不被過(guò)度照射，適度照射可促進(jìn)務(wù)必確保尼龍膜不被過(guò)度照射，適度照射可促進(jìn)DNA上小部分堿上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯(lián)結(jié)構(gòu),而過(guò)度照射而過(guò)度照射卻使卻使DNA上一部分胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)合于尼龍膜表面上一部分胸腺嘧啶共價(jià)結(jié)

14、合于尼龍膜表面,導(dǎo)致雜交信導(dǎo)致雜交信號(hào)減弱。號(hào)減弱。三、三、Northern雜交雜交 Northern雜交與雜交與Southern雜交很相似。主要區(qū)別是被檢雜交很相似。主要區(qū)別是被檢測(cè)對(duì)象為測(cè)對(duì)象為RNA,其電泳在變性條件下進(jìn)行其電泳在變性條件下進(jìn)行,以去除以去除RNA中的中的二級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu),保證保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有完全按分子大小分離。變性電泳主要有2種種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與膠用與Southern轉(zhuǎn)移相同的方法將轉(zhuǎn)移相同的方法將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上濾膜上,然后與探針

15、雜交。然后與探針雜交。 注意：注意：（1）RNA對(duì)堿性敏感，不能用對(duì)堿性敏感，不能用NaOH溶液作為轉(zhuǎn)膜夜。溶液作為轉(zhuǎn)膜夜。如果瓊脂糖濃度高于如果瓊脂糖濃度高于1%，或凝膠厚度大于，或凝膠厚度大于0.5cm，或待分，或待分析的析的RNA大于大于2.5kb,需用需用0.05mol/L NaOH浸泡凝膠浸泡凝膠20分鐘分鐘,部分水解部分水解RNA并提高轉(zhuǎn)移效率。浸泡后用經(jīng)并提高轉(zhuǎn)移效率。浸泡后用經(jīng)DEPC處理的水淋處理的水淋洗凝膠洗凝膠,并用并用20SSC浸泡凝膠浸泡凝膠45分鐘。然后再轉(zhuǎn)移到濾膜上分鐘。然后再轉(zhuǎn)移到濾膜上。（2）含甲醛的凝膠在）含甲醛的凝膠在RNA轉(zhuǎn)移前需用經(jīng)轉(zhuǎn)移前需用經(jīng)DEPC

16、處理的水處理的水淋洗數(shù)次淋洗數(shù)次,以除去甲醛。以除去甲醛。（3）尼龍膜的不足之處是背景較高）尼龍膜的不足之處是背景較高,用用RNA探針時(shí)尤探針時(shí)尤為嚴(yán)重。將濾膜長(zhǎng)時(shí)間置于高濃度的堿性溶液中為嚴(yán)重。將濾膜長(zhǎng)時(shí)間置于高濃度的堿性溶液中,會(huì)導(dǎo)致會(huì)導(dǎo)致雜交背景明顯升高雜交背景明顯升高,可通過(guò)提高預(yù)雜交和雜交步驟中有可通過(guò)提高預(yù)雜交和雜交步驟中有關(guān)阻斷試劑的量來(lái)予以解決。關(guān)阻斷試劑的量來(lái)予以解決。四、菌落原位雜交四、菌落原位雜交對(duì)分散在若干個(gè)瓊脂平板上的少數(shù)菌落（對(duì)分散在若干個(gè)瓊脂平板上的少數(shù)菌落（100-200）進(jìn)）進(jìn)行克隆篩選時(shí)，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個(gè)瓊行克隆篩選時(shí)，可采用本方法。將這些

17、菌落歸并到一個(gè)瓊脂主平板以及已置于第二個(gè)瓊脂平板表面的一張尼龍膜上脂主平板以及已置于第二個(gè)瓊脂平板表面的一張尼龍膜上。經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，對(duì)菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯。經(jīng)培養(yǎng)一段時(shí)間后，對(duì)菌落進(jìn)行原位裂解。主平板應(yīng)貯存于存于4直至得到篩選結(jié)果。直至得到篩選結(jié)果。五、斑點(diǎn)雜交五、斑點(diǎn)雜交 斑點(diǎn)雜交是指將斑點(diǎn)雜交是指將DNA或或RNA樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜上素濾膜上,然后與核酸探針?lè)肿与s交，以顯示樣品中是否存在特然后與核酸探針?lè)肿与s交，以顯示樣品中是否存在特異的異的DNA或或RNA。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋。同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋,還可以還可以得到半定量的結(jié)果。所以它

18、是一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的分析得到半定量的結(jié)果。所以它是一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的分析DNA或或RNA的方法的方法,在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到在基因分析和基因診斷中經(jīng)常用到,是研是研究基因表達(dá)的有力工具。但由于目的序列未與非目的序究基因表達(dá)的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離列分離,不能了解目的序列的長(zhǎng)度。尤其當(dāng)本底干擾較高時(shí)不能了解目的序列的長(zhǎng)度。尤其當(dāng)本底干擾較高時(shí),難難以區(qū)分目的序列信號(hào)和干擾信號(hào)。以區(qū)分目的序列信號(hào)和干擾信號(hào)。六、影響雜交的因素六、影響雜交的因素 1、溫度、溫度 雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫

19、度低于溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 1015，堿基順序高度同源，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個(gè)同源性在個(gè)同源性在50%左右或更低些的左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。雜交溫度。 通常有三種

20、溫度可供試驗(yàn)，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對(duì)雜交的影響見(jiàn)下表。最適復(fù)非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對(duì)雜交的影響見(jiàn)下表。最適復(fù)性溫度（性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：）：Tor =Tm 25苛刻復(fù)性溫度：苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm (10或或15)非苛刻復(fù)性溫度：非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm (30或或35)在在2SSC反應(yīng)液中，可以根據(jù)下列公式計(jì)算最適復(fù)性溫反應(yīng)液中，可以根據(jù)下列公式計(jì)算最適復(fù)性溫度：度：TOr =0.51 (G+C%)+47。D

21、NAG+C % 雜交反應(yīng)溫度（雜交反應(yīng)溫度（） TorTsTns3062.3 73.352.33564.9 74.954.94067.4 77.457.44570.0 80.060.05072.5 82.562.55575.1 85.165.1DNADNA雜交溫度的選擇范圍（雜交溫度的選擇范圍（2SSC） 如果綜合考慮：如果綜合考慮：Effective Tm81.5+16.6(logMNa+)+0.41(%G+C) 0.72(%formamide)根據(jù)所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來(lái)說(shuō)，雜交相根據(jù)所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來(lái)說(shuō)，雜交相為水溶液時(shí)為水溶液時(shí),則在則在65雜交，而在雜交

22、，而在50%甲酰胺溶液中時(shí)甲酰胺溶液中時(shí),則在則在42下雜交。下雜交。2、 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度增加離子強(qiáng)度增加，Tm值增加值增加，一般用一般用0.9-0.75 mol/L 的的NaCl3、 DNA的濃度的濃度最低檢測(cè)水平為單拷貝為：最低檢測(cè)水平為單拷貝為：0.5pg4、探針的濃度：、探針的濃度： 總的來(lái)說(shuō)，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外總的來(lái)說(shuō)，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用

23、量分別為記探針的用量分別為510ng/ml和和251000ng/ml 探針質(zhì)量衡量的指標(biāo)：比活性即探針質(zhì)量衡量的指標(biāo)：比活性即 cpm/g 如果比活性為如果比活性為108cpm/g ，用的濃度為，用的濃度為10g/ml， 比活性為比活性為109cpm/g ，用的濃度為，用的濃度為2g/ml。5 5、探針的長(zhǎng)度和同源性、探針的長(zhǎng)度和同源性 ： 為了保證雜交的特意性，一般需要用為了保證雜交的特意性，一般需要用500pb左右的左右的長(zhǎng)度的探針。但是，探針過(guò)量的條件下，雜交率主要依賴于探長(zhǎng)度的探針。但是，探針過(guò)量的條件下，雜交率主要依賴于探針長(zhǎng)度（復(fù)雜度）和探針濃度。在濃度一定時(shí)，雜交率主要影針長(zhǎng)度（

24、復(fù)雜度）和探針濃度。在濃度一定時(shí)，雜交率主要影響因素是探針的長(zhǎng)度，長(zhǎng)的探針雜交時(shí)間很長(zhǎng)，而短探針容易響因素是探針的長(zhǎng)度，長(zhǎng)的探針雜交時(shí)間很長(zhǎng)，而短探針容易退火，因此標(biāo)記好的探針長(zhǎng)度為退火，因此標(biāo)記好的探針長(zhǎng)度為100 nt左右，太短將探針與左右，太短將探針與目的序列的結(jié)合。目的序列的結(jié)合。探針與被檢測(cè)的探針與被檢測(cè)的DNA之間的同源性也影響之間的同源性也影響Tm： 1% mismatch of two DNA lowers the Tm 1.4 如果雜交溫度為如果雜交溫度為67.5，要求，要求DNA間的同源性為間的同源性為87.5%，在，在65、5xSSC的條件下，要求探針與被檢測(cè)的的條件下，

25、要求探針與被檢測(cè)的DNA之間之間的同源性為多少？的同源性為多少？ 假設(shè)：（假設(shè)：（GC）45 Tm81.5+16.6(log0.825)+0.41(45%)=98.6 同源性同源性100(98.665.0)/1.4=83.1%6、雜交液的成分、雜交液的成分 ：反應(yīng)液中每增加反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，的甲酰胺濃度，tm值可降低值可降低0.72。6M尿素，降低尿素，降低Tm約約30惰性多聚體可用來(lái)促進(jìn)惰性多聚體可用來(lái)促進(jìn)250個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對(duì)單鏈個(gè)堿基以上的探針的雜交率。對(duì)單鏈探針可增加探針可增加3倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的

26、探針可增加高達(dá)的探針可增加高達(dá)100倍。倍。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長(zhǎng)雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長(zhǎng)雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為多聚胺，平均分子量為500000。另一種常見(jiàn)的促進(jìn)劑是聚乙。另一種常見(jiàn)的促進(jìn)劑是聚乙二醇（二醇（PEG），），PEG分子量小（分子量?。?0008000）、粘度低、價(jià)）、粘度低、價(jià)格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%10%硫酸葡聚糖效果較好，若用硫酸葡聚糖效果較好，若用5%10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu)化條

27、件。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu)化條件。 選用不同的封閉試劑：如選用不同的封閉試劑：如Denhardts試劑、肝素或一種試劑、肝素或一種由由5%脫脂奶粉組成的脫脂奶粉組成的BLOTTO或或block reagent , 這些試劑這些試劑中需加入斷裂的鮭魚(yú)精子中需加入斷裂的鮭魚(yú)精子DNA或酵母或酵母DNA，并和，并和SDS一起使一起使用。與用。與Denhardts試劑相比試劑相比, BLOTTO價(jià)格便宜價(jià)格便宜,使用方便使用方便,同同樣可獲得滿意的結(jié)果，但它不能用于樣可獲得滿意的結(jié)果，但它不能用于RNA雜交。一般而言雜交。一般而言,尼尼龍膜用龍膜用Denhardts試劑比用試劑比用BLOTTO能得

28、到更高的信噪比。能得到更高的信噪比。7、雜交的時(shí)間、雜交的時(shí)間在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益，會(huì)引起非特異結(jié)合間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無(wú)益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行16h左右。左右。8、雜交液的體積：一般來(lái)說(shuō)使用較小體積的雜交液比較好，因、雜交液的體積：一般來(lái)說(shuō)使用較小體積的雜交液比較好，因?yàn)樵谛◇w積溶液中，核酸重新配對(duì)的速度快、探針用量少，從為在小體積溶液中，核酸重新配對(duì)的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的而使濾膜上的DNA

29、在反應(yīng)中起主要作用。但在雜交中必須在反應(yīng)中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。一般雜交液的用量為保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。一般雜交液的用量為1ml/10cm2 七、洗膜時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)七、洗膜時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng) 1、洗膜的溫度和洗膜的溫度和SSC的濃度：的濃度： Stringency: a term used in hybridization experiments to denote the degree of homology between the probe and the filter bound nucleic acid, the higher the str

30、ingency, the higher percent homology between the probe and the filter bound nucleic acid.（1）Non-stringent wash: 2xSSC, 65Effective Tm 81.5 + 16.6( log0.33 )0.41( 45% )92.2 homology 100 （9265）/1.4 80.7%（2）Stringent wash: 0.1xSSC，65Effective Tm 81.5 + 16.6( log0.0165 )0.41( 45% )70.4 homology 100 （70.

31、465）/1.4 96.1%2、洗膜的時(shí)間與次數(shù)：、洗膜的時(shí)間與次數(shù)：一般用一般用2XSSC洗洗12次，然后用嚴(yán)格的洗液洗次，然后用嚴(yán)格的洗液洗2次，每次次，每次30分鐘。分鐘。八、脫探針的方法及注意事項(xiàng)八、脫探針的方法及注意事項(xiàng) ：尼龍膜可以重復(fù)利用，因此雜交后不能干燥，一定保持濕潤(rùn)。尼龍膜可以重復(fù)利用，因此雜交后不能干燥，一定保持濕潤(rùn)。處理方法：處理方法：0.1X SCC/0.1%SDS、100 510分鐘分鐘 DNA的膜還可以用的膜還可以用0.2N NaOH處理處理九、標(biāo)記的方法九、標(biāo)記的方法 3、末端標(biāo)記、末端標(biāo)記（2 2）交換反應(yīng)標(biāo)記法）交換反應(yīng)標(biāo)記法十、標(biāo)記的種類十、標(biāo)記的種類理想

32、的標(biāo)記物理想的標(biāo)記物： 具有高度的靈敏性具有高度的靈敏性與探針結(jié)合后，不影響雜交及探針的主要理化特性與探針結(jié)合后，不影響雜交及探針的主要理化特性檢測(cè)方法高靈敏性、高特異性，假陽(yáng)性率低，環(huán)境污染檢測(cè)方法高靈敏性、高特異性，假陽(yáng)性率低，環(huán)境污染少，價(jià)格低廉；少，價(jià)格低廉；若用酶促方法標(biāo)記，應(yīng)對(duì)若用酶促方法標(biāo)記，應(yīng)對(duì)Km影響不大影響不大1、同位素、同位素-32PdNTP、-32SdNTP用用-32P-ATP用于末端標(biāo)記用于末端標(biāo)記放射性同位素（放射性同位素（radiosotlope）是不穩(wěn)定的，它會(huì)）是不穩(wěn)定的，它會(huì)“變變”。放射性同位。放射性同位 素的原子核很不穩(wěn)定，會(huì)不間斷地、自發(fā)地放素的原子核

33、很不穩(wěn)定，會(huì)不間斷地、自發(fā)地放射出射線，直至變成另一種穩(wěn)定同位射出射線，直至變成另一種穩(wěn)定同位 素，這就是所謂素，這就是所謂“核衰核衰變變”。 放射性同位素衰變的快慢，通常用放射性同位素衰變的快慢，通常用“半衰半衰 期期”來(lái)表示。來(lái)表示。半衰期（半衰期（half-life）即一定數(shù)量放射性同位素原子數(shù)目減少）即一定數(shù)量放射性同位素原子數(shù)目減少到其初始值一到其初始值一 半時(shí)所需要的時(shí)間。半時(shí)所需要的時(shí)間。 同位素的特性：同位素的特性：檢測(cè)特異性強(qiáng)；檢測(cè)特異性強(qiáng)；靈敏度高；靈敏度高；對(duì)酶促反應(yīng)無(wú)任何影響，也不影響堿基配對(duì)的特異性和對(duì)酶促反應(yīng)無(wú)任何影響，也不影響堿基配對(duì)的特異性和穩(wěn)定性；穩(wěn)定性；易造

34、成放射性污染；易造成放射性污染；半衰期短的同位素應(yīng)用受到限制，隨用隨標(biāo)記，立即半衰期短的同位素應(yīng)用受到限制，隨用隨標(biāo)記，立即使用，不能長(zhǎng)時(shí)間存放。使用，不能長(zhǎng)時(shí)間存放。同位素同位素符號(hào)符號(hào)半衰期半衰期射線能量（射線能量（MeV）氫氫-33H12.3年年0.018碳碳-1414C5720年年0.156磷磷3232P14.3天天1.71硫硫3535S87.1天天0.167碘碘131131I8.05天天0.605常用同位素的特征常用同位素的特征2 2、非放射性標(biāo)記、非放射性標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)：無(wú)環(huán)境污染，可較長(zhǎng)時(shí)間貯存優(yōu)點(diǎn)：無(wú)環(huán)境污染，可較長(zhǎng)時(shí)間貯存方法：方法：1.1.酶標(biāo)記法酶標(biāo)記法 2.2.化學(xué)標(biāo)記法化學(xué)

35、標(biāo)記法要求：標(biāo)記物應(yīng)具有耐熱、對(duì)組織細(xì)胞無(wú)特異親和性、分子要求：標(biāo)記物應(yīng)具有耐熱、對(duì)組織細(xì)胞無(wú)特異親和性、分子量小，對(duì)探針雜交無(wú)影響或影響甚小，不影響量小，對(duì)探針雜交無(wú)影響或影響甚小，不影響DNA三維空間三維空間構(gòu)象的形成。構(gòu)象的形成。 常用的標(biāo)記物：生物素（常用的標(biāo)記物：生物素（biotin）、地高辛（）、地高辛（digoxigenin）、光生物素（）、光生物素（photobiotin）、補(bǔ)骨脂素、）、補(bǔ)骨脂素、2-乙酰氨基芴（乙酰氨基芴（2-acetylomino fluorene）地高辛（地高辛（Digoxigenin 簡(jiǎn)寫簡(jiǎn)寫Digo-）又稱異羥基洋地黃毒甙）又稱異羥基洋地黃毒甙配基，

36、這種類固醇半抗原僅限于洋地黃類植物，其抗體與其配基，這種類固醇半抗原僅限于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物如人體中的性激素等無(wú)交叉反應(yīng)，地高辛它任何固醇類似物如人體中的性激素等無(wú)交叉反應(yīng)，地高辛配基標(biāo)記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（配基標(biāo)記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成）上形成digoxigenin 11-dUTP地高辛標(biāo)記技術(shù)源于一種從洋地黃類植物（毛地黃和毛花毛地黃地高辛標(biāo)記技術(shù)源于一種從洋地黃類植物（毛地黃和毛花毛地黃）中提取的類固醇（）中提取的類固醇（Steroid）物質(zhì)）物質(zhì) Digoxigenin （DIG），在醫(yī)學(xué)上可用于治療各種急性和慢性心功能不全以及室上），在醫(yī)學(xué)上可用于治療各種急性和慢性心功能不全以及室上性心動(dòng)過(guò)速、心房顫動(dòng)和撲動(dòng)等疾病。由于洋地黃植物的花和性心動(dòng)過(guò)速、心房顫動(dòng)和撲動(dòng)等疾病。由于洋地黃植物的花和葉片葉片Digoxigenin在自然界中的唯一來(lái)源，因此抗在自然界中的唯一來(lái)源，因此抗DIG的抗體的抗體不會(huì)與其他的生物物質(zhì)結(jié)合，從而可以滿足特異性標(biāo)記的需不會(huì)與其他的生物物質(zhì)結(jié)合，從而可以滿足特異性標(biāo)記的需要。這一點(diǎn)，正是要