細(xì)胞培養(yǎng)與生長測定

1、細(xì)胞培養(yǎng)的生長測定 細(xì)胞培養(yǎng)的生長測定是指對細(xì)胞活力細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖細(xì)胞增殖的測定 1.細(xì)胞計數(shù)法 2.臺盼藍(lán)染色法 3.MTT比色法 4.細(xì)胞生長曲線法 一、細(xì)胞計數(shù)法一、細(xì)胞計數(shù)法 細(xì)胞計數(shù)法是用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，以測定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞密度?！静牧稀?.消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液2.細(xì)胞培養(yǎng)液3.血細(xì)胞計數(shù)板和蓋玻片【操作程序】 處理貼壁生長細(xì)胞時，吸出培養(yǎng)液，加入消化液，在37條件下消化1-2min。待細(xì)胞變圓并將脫壁時，加入一定量的培養(yǎng)液，用吸管沖洗細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。對于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接制成細(xì)胞懸液。 將蓋玻片放在血細(xì)胞計數(shù)

2、板的2個小室上。用毛細(xì)吸管或裝有注射針的1ml注射器吸取少量細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液輕輕注入蓋玻片邊緣與計數(shù)板交界處。通過蓋玻片和計數(shù)板之間的毛細(xì)管虹吸作用，細(xì)胞懸液進(jìn)入小室，并充滿蓋玻片和計數(shù)板的間隙。 3.在顯微鏡100倍放大倍數(shù)下用計數(shù)器計數(shù)四角大方格中的細(xì)胞數(shù)，即每個小室的中央方格和四角的方格。將壓左邊中線和上邊中線的細(xì)胞計數(shù)在內(nèi)，不計數(shù)壓在右邊中線和下邊中線的細(xì)胞。4.計數(shù)結(jié)束后，分別用雙蒸水和70%酒精清洗細(xì)胞計數(shù)板和蓋玻片，然后用擦鏡紙擦干。結(jié)果分析結(jié)果分析 細(xì)胞密度（個/ml）=平均細(xì)胞數(shù)104 稀釋倍數(shù)。 細(xì)胞總數(shù)（個）=細(xì)胞密度細(xì)胞懸液量注意事項注意事項如果被計數(shù)的細(xì)胞不再

3、使用，在消化后不需要加入培養(yǎng)液。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化程度，以估計取細(xì)胞時間。消化時間過短時，部分細(xì)胞仍牢固貼壁，故取得的細(xì)胞較少，從而影響細(xì)胞計數(shù)。消化時間過長時，細(xì)胞受損，活性減弱。將細(xì)胞懸液充分混勻，以免計數(shù)結(jié)果出現(xiàn)偏差。向蓋玻片和計數(shù)板之間注入細(xì)胞懸液時，以蓋玻片下的間隙剛被充滿為準(zhǔn)。不滿或過滿都影響實驗結(jié)果。每個大方格中的細(xì)胞密度以20-50個為宜。如果細(xì)胞密度太大，稀釋后再次計數(shù)，以便提高細(xì)胞計數(shù)的精確度和速度。二、臺盼藍(lán)染色法二、臺盼藍(lán)染色法 在細(xì)胞的分離、傳代、凍存和復(fù)蘇等過程中，均可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。臺盼藍(lán)染色法用于檢測存活細(xì)胞數(shù)?！静牧稀?消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02

4、%EDTA混合消化液。 培養(yǎng)液或HBSS。 0.4%臺盼藍(lán)溶液，用PBS配制。 細(xì)胞計數(shù)板和蓋玻片?！静僮鞒绦颉?處理貼壁生長細(xì)胞時，吸出培養(yǎng)液，加入消化液，在37條件下消化1-2min。待細(xì)胞變圓并將脫壁時，加入一定量的培養(yǎng)液或HBBS，用吸管沖洗細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。對于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接制成細(xì)胞懸液。 取0.5ml臺盼藍(lán)溶液，0.3mlHBBS和0.2ml細(xì)胞懸液，充分混勻。然后，將混合液放置1-2min。 用毛細(xì)吸管或裝有注射針的1ml注射器吸取少量細(xì)胞懸液注入蓋玻片邊緣與計數(shù)板交界處。 至少計數(shù)500個細(xì)胞，并計數(shù)其中著色細(xì)胞。 計數(shù)結(jié)束后，分別用雙蒸水和70%酒精清洗細(xì)胞計數(shù)板和

5、蓋玻片，然后用擦鏡紙擦干?！窘Y(jié)果分析】 正常細(xì)胞不被著色。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜通透性增加，臺盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，故細(xì)胞呈藍(lán)色。1.細(xì)胞活力（%）=（細(xì)胞總數(shù)-著色細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)100%注意事項注意事項 如果含有臺盼藍(lán)的細(xì)胞懸液放置時間過長，正常細(xì)胞可攝取染料，從而影響染色結(jié)果。 臺盼藍(lán)染色法是一種粗略的檢測存活細(xì)胞的方法，不能準(zhǔn)確的反映細(xì)胞活性的差異。因此，應(yīng)使用MTT比色法或凋亡檢測法評價細(xì)胞活性或檢測早期凋亡細(xì)胞。三、三、MTT比色法比色法 法建立于20世紀(jì)80年代初，是一種通過測定細(xì)胞能量代謝水平用以間接反映細(xì)胞增殖情況的檢測方法。 其原理是MTT可作為哺乳類動物細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的

6、底物。當(dāng)有活細(xì)胞存在時，線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原成紫藍(lán)色的晶狀甲瓚(Formazan)，將結(jié)晶的甲瓚溶解釋放，再用酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度OD值，OD值的高低可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量及其活性?；罴?xì)胞多則吸光度大，反之則吸光度小，從而反映出你的細(xì)胞的存活及增殖情況。 它基于兩個假設(shè)：1、只有活細(xì)胞能夠?qū)TT還原成為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，而死細(xì)胞不能達(dá)到；2、其吸光度與活細(xì)胞數(shù)量成直線正相關(guān)?！静牧喜牧稀?、MTT溶液：稱取250mg MTT，放入小燒杯中，加50mlPBS(0.01molL， pH7.2)，在電磁力攪拌機(jī)上攪拌30min，用0.22um的微孔濾器除菌，分裝，4避

7、光保存。兩周內(nèi)有效。2、含10胎牛血清RPMl 1640培養(yǎng)液、0.25胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)3、96孔培養(yǎng)板(單層生長的細(xì)胞選用平底型培養(yǎng)板，懸浮生長的細(xì)胞選用圓底型培養(yǎng)板)、可調(diào)移液器、吸管、離心管、計數(shù)板 4、孵箱、顯微鏡、振蕩混合儀、酶聯(lián)免疫檢測儀【操作程序操作程序】1、接種細(xì)胞：用0.25胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMl604培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每 孔1001000個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul。 2、培養(yǎng)細(xì)胞；將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37、5%CO2及濕度條件下，培養(yǎng)3-5天。3、呈色：培養(yǎng)第2-5天后，每孔加入MTT溶液(

8、5mg/m1)20ul，37繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。對浮生長的細(xì)胞，需離心,(1000rpm5min)，然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液每孔加入150ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。 4、比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上調(diào)定各孔收值，記錄結(jié)果。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生線。注意事項注意事項1、 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗前，對每一種細(xì)胞都應(yīng)測定其貼壁率、倍增時間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證適時終止細(xì)胞培養(yǎng)。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成量與細(xì)

9、胞數(shù)呈的線性關(guān)系。2、 避免血清干擾。用含15胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時，高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值。因此，一般選小于l0胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。3、 設(shè)空白對照。與試驗孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白孔。其它試驗步驟保持一樣。最后比色時，以空白孔調(diào)零。 4、 加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會在8%左右。 5、 如果用96孔板，周圍一圈孔的值由于液體蒸發(fā)和溫度梯度原因，存在明顯的揮發(fā)現(xiàn)象，會誤差很大， 所以做的時候要求培養(yǎng)箱里的濕度條件控制的比較好, 要不就需要棄取周圍兩輪孔的數(shù)據(jù)。6、 MTT有

10、毒性致突變性，操作時應(yīng)注意防護(hù)?！窘Y(jié)果分析結(jié)果分析】細(xì)胞存活率=試驗組OD/對照組OD100% 已開發(fā)出新的方法（如已開發(fā)出新的方法（如CCK-8CCK-8法）替代傳統(tǒng)的法）替代傳統(tǒng)的MTTMTT法，優(yōu)點有：法，優(yōu)點有：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；2、CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度； 3、CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT法； 4、CCK-8法對細(xì)胞毒性小。 四、細(xì)胞生長曲線法四、細(xì)胞生長曲線法 原理： 一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮后貼壁，隨后度過長短不一的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期，在達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞停止生長，進(jìn)入平頂期，然

11、后退化衰老。典型的生長曲線即可分為潛伏期、指數(shù)生長期、平頂期及退化衰老四個部分，其中的三個不同生長時相（潛伏期、指數(shù)生長期和平頂期）是每個細(xì)胞系所共有的特征。 意義意義： 通過測定生長曲線，不僅可以了解培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)、測定細(xì)胞絕對生長數(shù)、判斷細(xì)胞活力，而且也可用于測定藥物等外來因素對細(xì)胞生長的影響?！静牧稀?24孔培養(yǎng)板。 細(xì)胞懸液。 消化液：0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液。 培養(yǎng)液或HBSS。1.細(xì)胞計數(shù)板和蓋玻片?！静僮鞒绦虿僮鞒绦颉?計算細(xì)胞密度2次，得出細(xì)胞密度平均值。然后，將細(xì)胞懸液等量加入培養(yǎng)板的每個孔中，培養(yǎng)時間計為0天。 每隔24小時吸去3個孔的

12、培養(yǎng)液，加入消化液，混懸細(xì)胞，計算細(xì)胞數(shù)目。每個孔計數(shù)2次，得出細(xì)胞密度平均值。1.連續(xù)7天，繪制細(xì)胞生長曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞密度。【結(jié)果分析結(jié)果分析】 細(xì)胞生長曲線反映細(xì)胞的生物學(xué)特征。每一代細(xì)胞的生長過程可大致分為潛伏期、指數(shù)生長期和停滯期。 潛伏期 細(xì)胞對分離和傳代操作所致?lián)p傷的恢復(fù)以及適應(yīng)新生長環(huán)境的過程。一般來講，原代細(xì)胞培養(yǎng)需要24-96小時，甚至更長時間才能恢復(fù)增殖。不同細(xì)胞的增殖恢復(fù)所需時間不同，傳代細(xì)胞的潛伏期一般為6-24小時。 指數(shù)生長期：細(xì)胞數(shù)量呈對數(shù)增長。指數(shù)生長期一般為3-5天。1. 停滯期：細(xì)胞最后長滿形成單層，不再增殖，生長停滯。注意事項注意事項

13、 培養(yǎng)板內(nèi)各孔細(xì)胞的消化操作過程要一致，避免得出細(xì)胞密度有明顯差異。 細(xì)胞計數(shù)前，盡量使細(xì)胞混懸均勻。細(xì)胞生長測定的應(yīng)用 細(xì)胞增殖或細(xì)胞活性測定 藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 原理原理 在低于-700C的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏?，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。 冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。 當(dāng)細(xì)胞被冷至-5時，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰； 當(dāng)被冷至-5-15 之間時，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)

14、仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。 冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不會發(fā)生結(jié)冰； 冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰； 冷凍速度非?？欤闯焖倮鋬觯?，則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)（玻璃化冷凍）。冷凍保存溫度冷凍保存溫度 冷凍保存溫度是指能長期保存細(xì)胞的超低溫度，在此溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢甚至停止，但經(jīng)過長期保存，在復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。 從實際和效益的觀點出發(fā)，液氮溫度（-196 ）是 目前最佳的冷凍保存溫度。在-196 時，細(xì)胞的生命活動幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。 如果

15、冷凍過程得當(dāng)，一般生物樣品在-196 下均可保存十年以上。 應(yīng)用-70 -80 保存細(xì)胞，短期內(nèi)對細(xì)胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細(xì)胞存活率明顯降低。1. 在冰點到-40 范圍內(nèi)保存細(xì)胞的效果不佳。復(fù)蘇速率復(fù)蘇速率復(fù)溫速率是指在細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。 一般來說，復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)的做法是，在37 水浴中，于1-2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。復(fù)溫速度過慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而造成細(xì)胞損傷。復(fù)溫時造成的細(xì)胞損傷非常快，往往在極短的時間內(nèi)發(fā)生。冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑 冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)。冷凍保護(hù)劑常常配制成一定的溶液。 冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類 滲透

16、性冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。 非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。 目前多以滲透性冷凍劑較為常用 DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對細(xì)胞的毒性作用較大，而在4 時，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細(xì)胞內(nèi)。所以，凍存時DMSO平衡多在4 下進(jìn)行，一般需要4060分鐘。 冷凍保存方法冷凍保存方法 按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。

17、非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-70-80 ，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子計算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-100 以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。 玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成。 但目前細(xì)胞凍存最常用的仍是前一種方法。但目前細(xì)胞凍存最常用的仍是前一種方法。 非玻璃化凍存方法非玻璃化凍存方法【材料】1.儀器設(shè)備：普通冰箱、低溫冰箱和-70 -80 超低溫冰箱、液氮凍存罐、

18、高速離心機(jī)、電子計算機(jī)程控降溫儀等；2.凍存管：容量為1ml或1.5ml； 3.冷凍保護(hù)液：一般是以9份小牛血清或細(xì)胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解； 4.待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞?！静僮鞒绦颉?. 待凍存細(xì)胞懸液的制備 (1) 按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計算細(xì)胞總數(shù)； (2) 將細(xì)胞懸液以8001000r/min離心5min，去上清夜； (3) 向細(xì)胞沉淀物中加入冷凍保護(hù)液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)11061107個/ml； (4) 按每管11.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋； (5) 再凍存管上做好標(biāo)記，