生物酶法制備生物柴油

1、生物酶法制備生物柴油摘要：石油資源日益匱乏，生物柴油已經(jīng)成為國際新能源研究的熱點(diǎn)。生產(chǎn)方法以及生產(chǎn)原料成為生物柴油發(fā)展的兩大瓶頸。生物柴油主要是以動(dòng)植物油為原料，通過酯交換反應(yīng)而制備的長(zhǎng)鏈脂肪酸酯類物質(zhì)。目前生物柴油的生產(chǎn)工藝主要有化學(xué)法和生物酶法?；瘜W(xué)法是當(dāng)前的主流工藝，但存在能耗高、工藝復(fù)雜、醇消耗量大、環(huán)境污染等缺點(diǎn)。生物酶法具有對(duì)原料中脂肪酸和水含量要求低、工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、選擇性高、醇用量小、副產(chǎn)物少、生成的甘油容易回收且無需進(jìn)行廢液處理等優(yōu)點(diǎn)，因而被認(rèn)為是取代化學(xué)法生產(chǎn)生物柴油的綠色工藝。生物酶法包括游離脂肪酶催化法、離子液體脂肪酶催化法、固定化脂肪酶催化法和細(xì)胞內(nèi)脂肪酶催化

2、法等。全細(xì)胞酶法彌補(bǔ)了脂肪酶的生產(chǎn)成本高、使用壽命短、易失活等不足，節(jié)省了設(shè)備和運(yùn)行維護(hù)費(fèi)用，成為了未來生物柴油制備的發(fā)展方向。收集餐飲廢油和工業(yè)廢油脂，發(fā)展高油作物和工程微藻，以此為原料生產(chǎn)生物柴油能夠顯著降低原料成本。改進(jìn)傳統(tǒng)生物柴油生產(chǎn)工藝，加快脂肪酶酯化工藝的研發(fā)，開發(fā)原料適應(yīng)性廣、酯化效率高、連續(xù)化、自動(dòng)化程度高的環(huán)保經(jīng)濟(jì)新工藝，是目前生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心。關(guān)鍵詞：生物柴油；生物酶法；全細(xì)胞酶法1、生物柴油及其利用現(xiàn)狀生物柴油(Biodiesel)是指以植物、動(dòng)物油脂等可再生生物資源生產(chǎn)的可用于壓燃式發(fā)動(dòng)機(jī)的清潔替代燃油。生物的柴油的制備過程是通過酯交換反應(yīng)進(jìn)行的，酯交換法是指通過

3、酯基轉(zhuǎn)移作用將高粘度的植物油或動(dòng)物油脂轉(zhuǎn)化成低粘度的脂肪酸酯，該過程需要一定的催化劑才能進(jìn)行。生物柴油作為可再生清潔能源，具有優(yōu)良的環(huán)保特性，無芳爛，含硫低，含氧高，可達(dá)11%,十六烷值高，燃燒性能好，潤(rùn)滑性好，閃點(diǎn)高，運(yùn)輸和使用安全等優(yōu)點(diǎn)。因此，利用生物柴油作為新能源替代傳統(tǒng)柴油，在環(huán)保和能源領(lǐng)域都有著非常深遠(yuǎn)的意義。隨著石油資源的日益匱乏，原油價(jià)格的不斷攀升，生物柴油的優(yōu)勢(shì)尤為凸顯，被國際可再生能源界譽(yù)為最具發(fā)展前景的替代油品，生物柴油的研究也已經(jīng)成為國際新能源研究的熱點(diǎn)。圖1所示為2003年至2008年全球生物柴油生產(chǎn)能力及實(shí)際產(chǎn)量。20032008年生物柴油生產(chǎn)能力及產(chǎn)量d.生產(chǎn)能力7

4、萬噸圖除產(chǎn)量/萬咤20072008圖12003年至2008年全球生物柴油生產(chǎn)能力及實(shí)際產(chǎn)量歐盟無疑是全球生物柴油生產(chǎn)的領(lǐng)跑者，2007年歐盟的生物柴油產(chǎn)量為570萬噸，年增長(zhǎng)率為16%;2008年為780萬噸，年增長(zhǎng)率為35%;2009年則超過了900萬噸，年增長(zhǎng)率為16.6%。2009年歐盟生物柴油產(chǎn)量居前4位的國家分別是德國、法國、西班牙和意大利。美國是世界上最大的石油消耗國，也是世界上最早研究生物柴油的國家之一，其生物柴油產(chǎn)量在2005年翻了2翻,2006年又翻了2翻,2007年翻了1翻，達(dá)到140萬噸/年。美國能源署正在大力推廣使用生物柴油，要求到2010年，美國的生物柴油產(chǎn)量將達(dá)到1

5、200萬噸。中國是僅次于美國的全球第二大石油消費(fèi)國，對(duì)海外石油的依賴程度越來越大。面對(duì)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展、環(huán)境保護(hù)和能源消耗的巨大壓力，我國“十五”計(jì)劃發(fā)展綱要把發(fā)展生物液體燃料確定為國家產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向。我國生物柴油行業(yè)到2007年底年產(chǎn)能超過300萬噸，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有產(chǎn)能1萬噸及以上的生物柴油企業(yè)有26家。預(yù)計(jì)到2020年，我國柴油消費(fèi)量將約2006年的1.8倍，按生物柴油的替代比例2%計(jì)算，生物柴油的年需求量將達(dá)到420萬噸，可見，我國生物柴油市場(chǎng)前景非常廣闊，大力發(fā)展生物柴油對(duì)我國經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。2、生物柴油原料生物柴油的生產(chǎn)中，原料成本占總成本的70%左右，是決定生物柴油價(jià)格

6、的主要因素，已成為生物柴油生產(chǎn)企業(yè)的利潤(rùn)制約點(diǎn)。生產(chǎn)生物柴油需要油脂和低級(jí)醇兩種原料，油脂主要來源于動(dòng)物和植物。動(dòng)物脂肪如豬油、牛油、雞油及魚油已用于生物柴油制備的研究，但生物柴油生產(chǎn)所用的油脂主要來自植物，許多食用及非食用植物油如大豆油、菜籽油、葵花籽油、棕楣油、橄欖油、棉籽油、亞麻籽油、篦麻油、麻風(fēng)樹油和桐油已用于生物柴油生產(chǎn)。為了減少對(duì)食用植物油的依賴，廢棄烹調(diào)油、微生物油和微藻油也已用于制造生物柴油。由于國情不同，各國生產(chǎn)生物柴油使用的油脂原料也有差別，美國主要用轉(zhuǎn)基因大豆油生產(chǎn)生物柴油，歐盟和加拿大生物柴油生產(chǎn)的主要原料是菜籽油，巴西主要用葵花籽油和棕植I油制造生物柴油，東南亞國家馬

7、來西亞和印度尼西亞生產(chǎn)生物柴油則主要用棕楣油為原料，中國用廢棄烹調(diào)油或非食用植物油如麻風(fēng)樹油作為生物柴油的原料則更現(xiàn)實(shí)。用于生物柴油生產(chǎn)的低級(jí)醇包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、2-丁醇和異丁醇，醇的分子量越大，密度越大，沸點(diǎn)也越高，通常脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的速率隨醇的碳鏈長(zhǎng)度而增加。上述低級(jí)醇中甲醇和乙醇的產(chǎn)量最大，價(jià)格也最便宜，所以工業(yè)上生物柴油生產(chǎn)主要用甲醇和乙醇作為酯?；氖荏w。但相較于其它脂醇，甲醇和乙醇對(duì)脂肪酶的毒性更強(qiáng)。由于價(jià)格便宜，大多數(shù)國家用甲醇生產(chǎn)生物柴油，但巴西乙醇的價(jià)格低于甲醇，所以巴西生產(chǎn)生物柴油時(shí)用乙醇為原料。由于甲醇生產(chǎn)以天然氣為主要原料，而乙醇則通過微生物發(fā)

8、酵生產(chǎn)，所以巴西以乙醇為原料生產(chǎn)的生物柴油是真正意義上的“綠色可再生”燃料。3、生物柴油生產(chǎn)技術(shù)生物柴油發(fā)展至今，國內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)其合成方法做了大量的研究和探索，使其生產(chǎn)技術(shù)基本成熟。目前工業(yè)生產(chǎn)生物柴油主要應(yīng)用酯交換法，在工業(yè)中規(guī)模化應(yīng)用的酯交換方法是液體堿催化法（NaOH、KOH等）和液體酸催化法（鹽酸、硫酸、磷酸等），但是這兩種方法都存在較大缺陷：對(duì)反應(yīng)原料要求高、副產(chǎn)物多、產(chǎn)物后處理工藝復(fù)雜、設(shè)備腐蝕嚴(yán)重以及污水排放量大等缺點(diǎn)。因此，許多研究者在不斷探索中得出了一些更環(huán)保、更經(jīng)濟(jì)、更有效的生物柴油生產(chǎn)技術(shù)，主要包括超臨界法、化學(xué)固體催化法、生物酶催化法、離子液體催化法、膜反應(yīng)法、超聲波

9、輔助法、微波輔助法等。本文就生物酶催化法進(jìn)行了概述。表1對(duì)幾種生物柴油的制備方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)。表1幾種生物柴油的制備方法總結(jié)制備方法堿催化法酸催化法固體酸或堿催化法超臨界法膜反應(yīng)法超聲波輔助法微波輔助法離子液體法生物酶法優(yōu)點(diǎn)催化效率高，腐蝕作用比酸小，反應(yīng)速度比酸快，成本較低適用于游離脂肪酸和水含量高的油脂，酯產(chǎn)率高反應(yīng)活性高，選擇性好，易分離，可循環(huán)使用，腐蝕性小，轉(zhuǎn)化率高污染小，反應(yīng)速率快，反應(yīng)時(shí)間短,后處理簡(jiǎn)單，無需原料預(yù)處理反應(yīng)反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物收率高加速反應(yīng)，提高了催化活力和生物柴油產(chǎn)率操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)率高，產(chǎn)品易純化腐蝕小，后處理容易，可重復(fù)使用,過程清潔工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫

10、和，選擇性高,醇用量小，副產(chǎn)物少缺點(diǎn)對(duì)反應(yīng)物純度以及水濃度非常敏感，甲醇用量大反應(yīng)速度慢，腐蝕性強(qiáng)，產(chǎn)物不易分離制備繁瑣，成本高，使用周期短條件苛刻，設(shè)備成本高原料混合不充分生產(chǎn)能力偏小反應(yīng)器制造水平低，反應(yīng)機(jī)理研究滯后甲醇用量大，生產(chǎn)成本高脂肪酶價(jià)格昂貴，使用壽命短，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)4、生物酶法合成生物柴油生物酶法是一類重要的生物柴油生產(chǎn)新方法，近年來越來越受到人們的重視，國內(nèi)外研究人員在這方面做了大量的工作。本文主要闡述了細(xì)胞內(nèi)脂肪酶和細(xì)胞外脂肪酶技術(shù)在生產(chǎn)生物柴油上的進(jìn)展，并對(duì)其中存在的一些問題提供了相應(yīng)的解決措施，對(duì)生物酶法生產(chǎn)生物柴油技術(shù)發(fā)展提出了建議。生物酶法合成生物柴油技術(shù)是指用脂肪酶

11、催化油脂原料與低碳醇間的進(jìn)行的酯交換反應(yīng)，制備相應(yīng)的脂肪酸單酯。此法具有對(duì)原料中脂肪酸和水含量要求低、工藝簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、選擇性高、醇用量小、副產(chǎn)物少、生成的甘油容易回收且無需進(jìn)行廢液處理等優(yōu)點(diǎn)，且此過程還能進(jìn)一步合成其他一些高價(jià)值的產(chǎn)品，包括可生物降解的潤(rùn)滑劑以及用于燃料和潤(rùn)滑劑的添加劑。生物酶法合成生物柴油的工藝流程如圖2圖2生物酶法合成生物柴油的工藝流程4.1 脂肪酶簡(jiǎn)介脂肪酶（?；视退饷?，E.C.3.1.1.3）是一種廣泛分布于動(dòng)物、植物和微生物中的酶，能夠進(jìn)行可逆的甘油酯鍵水解，也能夠進(jìn)行甘油酯合成。在一定的條件下，脂肪酶也能夠催化許多酯化反應(yīng)。微生物來源的脂肪酶種類較多、生

12、產(chǎn)方便和酶活較高，在生物柴油生產(chǎn)中應(yīng)用較多。微生物脂肪酶主要分為細(xì)菌類脂肪酶和真菌類脂肪酶。細(xì)菌類脂肪酶主要有單假胞菌脂肪酶；霉菌類脂肪酶主要有根霉脂肪酶、毛霉菌脂肪酶、鐮刀霉脂肪酶、青霉菌脂肪酶、假絲酵母脂肪酶、隱球酵母脂肪酶等。不同的脂肪酶在催化生產(chǎn)生物柴油的反應(yīng)過程中表現(xiàn)出的反應(yīng)活性和催化特性不同。無論在小規(guī)模的還是工業(yè)規(guī)模的酯合成中，作為催化劑，脂肪酶已經(jīng)得到成功應(yīng)用。4.2 細(xì)胞外脂肪酶催化合成生物柴油細(xì)胞外脂肪酶催化法主要包括游離脂肪酶催化法和固定化脂肪酶催化法。4.2.1 游離脂肪酶催化法游離脂肪酶催化法是脂肪酶游離在溶劑介質(zhì)中，催化合成生物柴油的方法，溶劑主要分為傳統(tǒng)溶劑（水、

13、有機(jī)溶劑）和新型離子液體。4.2.1.1 傳統(tǒng)溶劑脂肪酶催化法脂肪酶催化酯交換反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油，最初是脂肪酶游離在水或有機(jī)溶劑介質(zhì)中進(jìn)行的。Kamini等利用脂肪酶在以水為介質(zhì)的反應(yīng)液中催化米糠油醇解，反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液中甲酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了80.2%。P.v.Lara,E.YPark研究了有機(jī)溶劑系統(tǒng)中，脂肪酶催化吸附在活性白土中的植物油來制備生物柴油，用從Candidacylindracea中提取的酶，在正己烷溶劑中，催化植物油制備生物柴油，開始反應(yīng)的4h中，得到了超過78%勺短鏈脂肪酸甲酯。游離脂肪酶雖然對(duì)酯交換反應(yīng)具有催化活性高和選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，但其價(jià)格昂貴，限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用

14、。游離脂肪酶分離困難，難以循環(huán)使用，重復(fù)利用性不好。游離脂肪酶在有機(jī)溶劑中不易分散，導(dǎo)致其催化效率較低。解決這些問題的方法：對(duì)脂肪酶進(jìn)行修飾、印記和交聯(lián)處理，能夠提高酶的活性和對(duì)應(yīng)體選擇性；對(duì)酶進(jìn)行固定化處理，能夠提高酶的穩(wěn)定性，便于回收利用，將酶固定在恰當(dāng)載體上，還可提高酶催化效率；以全細(xì)胞生物催化劑的形式來利用脂肪酶，可以實(shí)現(xiàn)酶的長(zhǎng)期使用，有望降低工藝成本。4.2.1.2 新型離子液體溶劑脂肪酶催化法離子液體是在室溫或室溫附近下完全由離子組成的液體物質(zhì)，具有無臭、無味、不易燃燒、易分離、易回收、可循環(huán)使用、良好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。在催化反應(yīng)中用離子液體取代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑，可提高反應(yīng)

15、速率，簡(jiǎn)化產(chǎn)物分離，同時(shí)也避免了傳統(tǒng)有機(jī)溶劑使用造成嚴(yán)重的環(huán)境污染以及設(shè)備腐蝕等問題，是真正意義上可設(shè)計(jì)的環(huán)境友好型綠色溶劑和液體催化劑，近年來，廣受人們的關(guān)注。JAINN等研究發(fā)現(xiàn)，離子液體在生物催化反應(yīng)中能為酶提供穩(wěn)定適宜的環(huán)境，酶在離子液體中能夠維持自身的催化活性，并且酶催化反應(yīng)在這種非水性環(huán)境下能夠較好的進(jìn)行。西北大學(xué)的王貴軍研究了脂肪酶在BMIMPF6離子液體中催化桐油制備生物柴油，得出了優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件：醇油比為3:1，加酶量為油重的15%反應(yīng)溫度為45C,反應(yīng)時(shí)間為24h,實(shí)際酯轉(zhuǎn)化率為76.3%。并且對(duì)比了有機(jī)溶劑體系發(fā)現(xiàn)，以BMIMPF6為溶劑的反應(yīng)體系中，脂肪酶經(jīng)過6次重復(fù)使

16、用，酯轉(zhuǎn)化率仍維持在50犯上，而在正己烷有機(jī)溶劑的體系中，脂肪酶催化的酯轉(zhuǎn)化率已降到40%；下。表明了脂肪酶在BMIMPF6離子液體中具有更好的穩(wěn)定性。離子液體作為一種新型的環(huán)境友好溶劑，在生物催化反應(yīng)中能更好的保持脂肪酶的穩(wěn)定性和催化活性，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)溶劑的不足，在生物柴油的制備中具有良好的應(yīng)用前景。4.2.2 固定化脂肪酶催化法固定化脂肪酶在保持其高效、專一及溫和催化反應(yīng)特性同時(shí)，還具有穩(wěn)定性高、容易回收、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡(jiǎn)便等一系列優(yōu)點(diǎn)，降低了酶法合成生物柴油的成本，可有效促進(jìn)酶法合成生物柴油在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。表2對(duì)幾種常用的固定化酶的制備方法進(jìn)行了總結(jié)。表2幾種

17、常用的固定化酶的方法方法概念吸附法物理吸附法：酶被載體吸附而固定的方法離子吸附法：將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法優(yōu)點(diǎn)酶活力部位及其空間構(gòu)象不易被破壞處理?xiàng)l件溫和，酶活力部位的氨基酸殘基不易被破壞交聯(lián)法共價(jià)結(jié)合法用雙功能試劑或多功能試劑進(jìn)行酶分子之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功能試劑或多功能試劑之間形成共彳鍵，得到三向德交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在一定的分子內(nèi)交聯(lián)酶蛋白分子上功能團(tuán)和固相支持物表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成化學(xué)共價(jià)鍵連接，以固定酶的方法酶之間連接牢固，具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性包埋法將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑的作用進(jìn)

18、行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化酶與載體間連接牢固，不易發(fā)生酶脫落，有良好的穩(wěn)性及重復(fù)使用性一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的空間構(gòu)象，酶活回收率較高，可以應(yīng)用于許多酶的固定化缺點(diǎn)酶附著在載體上，易于脫落載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖?種類或pH的影響，在離子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，酶往往會(huì)從載體上脫落難以控制反應(yīng)條件，反應(yīng)劇烈時(shí)引起酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并導(dǎo)致活性中心受到破壞，交聯(lián)劑價(jià)格昂貴反應(yīng)條件比較苛刻，常常會(huì)引起酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶的活性中心受損不適用于高分子量底物的傳質(zhì)，不適用于柱反應(yīng)系統(tǒng)，且常有擴(kuò)散限制等問題國內(nèi)外科研工作者通過選擇不

19、同固定化脂肪酶制備生物柴油，進(jìn)行了大量的研究。MamoruIso等研究發(fā)現(xiàn)，在相同的條件下，采用固定化Pseudomonasfluorescens脂肪酶催化甘油三酯與乙酉!反應(yīng)制備生物柴油，10h后反應(yīng)基本完成，而采用游離脂肪酶作催化劑，反應(yīng)25h后，反應(yīng)物產(chǎn)率只有90%。周麗亞等利用固定化脂肪酶Novozym435（崔化廢餐飲油與乙酸甲酯反應(yīng)制備生物柴油，得出最佳工藝條件：廢餐飲油2.0g,固定化脂肪酶Novozym43引量為油重的8.0%,乙酸甲酯與廢餐飲油摩爾比為10:1,反應(yīng)溫度為60C,反應(yīng)時(shí)間為18h,有機(jī)堿三羥甲基氨基甲烷用量為油重的40.0%,有機(jī)溶劑叔丁醇用量為0.5mL0在

20、此條件下生物柴油得率為86.43%。對(duì)酯化所得生物柴油的部分理化性能進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果表明基本符合美國生物柴油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和我國-50#輕柴油標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的柴油機(jī)燃燒特性。Oznur等在無任何溶劑的體系中，研究了固定化脂肪酶Novozym435崔化棉籽油的醇解反應(yīng)。在溫度為50C,酶的質(zhì)量為油質(zhì)量的30%油與醇的摩爾比為1:4的條件下，反應(yīng)7h,反應(yīng)液中甲酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大能達(dá)91.5%。鄧?yán)纫怨柙逋翞檩d體，吸附法制備固定化脂肪酶，用固定化脂肪酶催化油酸和甲醇溶液制備生物柴油，并找出酯化工藝的最佳條件：石油醴體系，5%(wt%)固定化脂肪酶，溫度為40C,油酸和甲醇摩爾比為1:1.4,低碳醇分兩次等摩

21、爾流加，在反應(yīng)過程中加入硅膠吸水劑，反應(yīng)時(shí)間為24h,酯化率可以達(dá)到92%。試驗(yàn)結(jié)果還表明，脂肪酸和低碳醇的碳原子數(shù)越多，酯化率越高。固定化脂肪酶雖然彌補(bǔ)了游離脂肪酶的一些缺陷，但其自身也存在不足：(1)甲醇的影響。甲醇等短鏈醇易使脂肪酶變性失活，對(duì)催化作用有很強(qiáng)的抑制作用。解決方法：分批加入甲醇或者乙酸甲酯代替甲醇作為酰基受體。(2)水分的影響。水分過多破壞酶的微環(huán)境導(dǎo)致酶活性和穩(wěn)定性的下降。影響酶的催化效率。解決方法：加入吸水劑除去過量的水分。(3)副產(chǎn)物甘油的影響。甘油在固定化脂肪酶的親水性載體表面積累，抑制反應(yīng)物向酶表面的擴(kuò)散，從而降低甲酯的收率。解決方法：利用硅膠等吸水劑除去生成的甘

22、油。(4)溶劑的影響。對(duì)比無溶劑體系，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系中加入溶劑后，反應(yīng)底物的濃度降低，與酶接觸的表面積增大，酯化率明顯提高。不同溶劑對(duì)脂肪酶酯化反應(yīng)的影響主要是由于溶劑的疏水性的不同引起的。疏水性越強(qiáng)，脂肪酶的活性越高，酯化效果越好。從經(jīng)濟(jì)角度考慮選用石油醴較為合適。4.3 細(xì)胞內(nèi)脂肪酶催化合成生物柴油細(xì)胞內(nèi)脂肪酶催化是指固定化全細(xì)胞酶催化。固定化脂肪酶在生產(chǎn)過程中的提取、純化和固定化等繁瑣的工序中，會(huì)使大量酶損失和失活，增加了酶的生產(chǎn)成本，限制了其作為催化劑在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。目前降低酶法催化劑成本的最有前景的方法之一是以全細(xì)胞生物催化劑的形式來利用脂肪酶，這是因?yàn)槿?xì)胞脂肪酶作為一種特殊形式

23、的固定化酶可以免去上述工序而直接利用，有望降低生物柴油的生產(chǎn)成本。賀芹等研究發(fā)現(xiàn)華根霉全細(xì)胞脂肪酶在無溶劑以及有機(jī)溶劑體系中均可以有效地催化合成生物柴油。在無溶劑體系中最佳工藝條件為：甲醇分3次等量加入、總醇/油摩爾比為3:1、含水量2.0%、反應(yīng)溫度30C、加酶量8.0%。在此反應(yīng)條件下，脂肪酸甲酯最高收率可達(dá)86.0%以上，當(dāng)甲醇過量時(shí)脂肪酸甲酯收率最高可達(dá)93.0%。在有機(jī)溶劑體系中，以正庚烷為助溶劑時(shí)，脂肪酸甲酯的最高收率為86.7%。研究結(jié)果表明，利用廉價(jià)的華根霉全細(xì)胞脂肪酶在無溶劑體系中合成生物柴油具有成本低、底物用量少、對(duì)原料要求低、環(huán)境友好和反應(yīng)條件溫和(常壓，較低的溫度，無須

24、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿)等優(yōu)點(diǎn)，有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。Ban等研究了將米根霉IFO4697細(xì)胞固定于載體上，直接催化大豆油生產(chǎn)生物柴油，為了增強(qiáng)固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)酯化活性，在培養(yǎng)時(shí)添加相關(guān)底物，加入橄欖油和油酸的作用比較顯著，但不能含有葡萄糖。固定化細(xì)胞用有機(jī)溶劑處理，但較未處理的細(xì)胞均未表現(xiàn)出更高的活性。在反應(yīng)體系含水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%口分步添加甲醇的條件下，反應(yīng)液中甲酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)90.0%,達(dá)到了用胞外酶催化的水平。Ham胖首次報(bào)道利用重組真菌全細(xì)胞酶法合成生物柴油。將異抱鐮刀菌中的異種脂肪酶編碼基因重組到米曲霉上，形成重組異抱鐮刀菌脂肪酶（FHL）,得到的米曲霉作為全細(xì)胞酶催化脂肪酸酯的合成。添加5%勺水可有效抑制甲醇對(duì)酶的毒害并利于?；D(zhuǎn)化反應(yīng),脂肪酸甲酯產(chǎn)率達(dá)到94%,可重復(fù)使用10次。對(duì)比試驗(yàn)表明，重組米曲霉較米根霉穩(wěn)定性高，催化活性強(qiáng)，這種重組真菌全細(xì)胞催化劑有望應(yīng)用于生物柴油的工業(yè)化生產(chǎn)中。全細(xì)胞酶催化存在的問題：全細(xì)胞酶的催化活性和穩(wěn)定性分別受細(xì)胞膜的通透性和剛性的影響。在脂肪酶不泄漏到胞外的情況下，反應(yīng)底物需要通過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與酶結(jié)合，因此細(xì)胞的通透性是影響傳質(zhì)阻力的主要因素。細(xì)胞重組技術(shù)可以改善細(xì)胞膜的通透性，但