一代二代三代測序技術(shù)

1、三代基因組測序技術(shù)原理簡介摘要：從1977年第一代DNAM序技術(shù)（Sanger法）1,發(fā)展至今三十多年時(shí)間，測序技術(shù)已取得了相當(dāng)大的發(fā)展，從第一代到第三代乃至第四代，測序讀長從長到短，再從短到長。雖然就當(dāng)前形勢看來第二代短讀長測序技術(shù)在全球測序市場上仍然占有著絕對的優(yōu)勢位置，但第三和第四代測序技術(shù)也已在這一兩年的時(shí)間中快速發(fā)展著。測序技術(shù)的每一次變革，也都對基因組研究，疾病醫(yī)療研究，藥物研發(fā)，育種等領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的推動作用。在這里我主要對當(dāng)前的測序技術(shù)以及它們的測序原理做一個(gè)簡單的小結(jié)。Smfknacikxu.ltRe；ilDwGMRTiPCRr-rDOKIIlSlbbi（1*53）中心法則(l

2、52j工馴fPSncffur_usni_美巴&INTP胡，野商用自動和序獴|LM|MiM(ayo)晶ilJf攸(19MHSolidSyaemaw7)GeXP(MIO1Illumine12006)圖1:測序技術(shù)的發(fā)展歷程生命體遺傳信息的快速獲得對于生命科學(xué)的研究有著十分重要的意義。以上（圖1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DN做螺旋結(jié)構(gòu)以來，整個(gè)測序技術(shù)的發(fā)展歷程。第一代測序技術(shù)第一代DNAM序技術(shù)用的是1975年由桑格（Sanger）和考爾森（Coulson）開創(chuàng)的鏈終止法或者是1976-1977年由馬克西姆（Maxam和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)明的化學(xué)法（鏈降解）.并在1977

3、年,桑格測定了第一個(gè)基因組序列，是噬菌體X174的，全長5375個(gè)堿基1。自此，人類獲得了窺探生命遺傳差異本質(zhì)的能力，并以此為開端步入基因組學(xué)時(shí)代。研究人員在Sanger法的多年實(shí)踐之中不斷對其進(jìn)行改進(jìn)。在2001年，完成的首個(gè)人類基因組圖譜就是以改進(jìn)了的Sanger法為其測序基礎(chǔ)，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2和3都不含羥基，其在DNA勺合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA&成反應(yīng)，在4個(gè)DNA&成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTPSddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定

4、待測分子的DNAff歹I（圖2）。這個(gè)網(wǎng)址為sanger測序法制作了一個(gè)小短片、形象而生動。值得注意的是，就在測序技術(shù)起步發(fā)展的這一時(shí)期中，除了Sanger法之外還出現(xiàn)了一些其他的測序技術(shù)，如焦磷酸測序法、鏈接酶法等。其中，焦磷酸測序法是后來Roche公司454技術(shù)所使用的測序方法2，而連接酶測序法是后來ABI公司SOLID技術(shù)使用的測序方法2但他們的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中斷DNA成反應(yīng)的dNTP*AEADr.FredSangerfredmc*imgtftraiawarded隔praenbcrtifr195ScrndJ990,He恪rtejburffiperjonnfMw

5、orldtoftchAftown(woandMeonfy/mtsoftorecfft*bo精所drrmsfry.4CWWMWI.第JiftfJTixn4Irwnbooomlataspdid電皿ysequencingtecbniquDNAWJS氧威在止法制FFT-CQ.圖2：Sanger法測序原理第二代測序技術(shù)總的說來，第一代測序技術(shù)的主要特點(diǎn)是測序讀長可達(dá)1000bp,準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%,但其測序成本高，通量低等方面的缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了其真正大規(guī)模的應(yīng)用。因而第一代測序技術(shù)并不是最理想的測序方法。經(jīng)過不斷的技術(shù)開發(fā)和改進(jìn)，以Roche公司的454技術(shù)、illumina公司的Solexa,H

6、iseq技術(shù)和ABI公司的Solid技術(shù)為標(biāo)記的第二代測序技術(shù)誕生了。第二代測序技術(shù)大大降低了測序成本的同時(shí)，還大幅提高了測序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性，以前完成一個(gè)人類基因組的測序需要3年時(shí)間，而使用二代測序技術(shù)則僅僅需要1周，但在序列讀長方面比起第一代測序技術(shù)則要短很多。表1和圖3對第一代和第二代測序技術(shù)各自的特點(diǎn)以及測序成本作了一個(gè)簡單的比較5,以下我將對這三種主要的第二代測序技術(shù)的主要原理和特點(diǎn)作一個(gè)簡單的介紹。(asn)力EOUS0J星一鶴Qu圖3.測序成本的變化Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測序機(jī)器，這兩個(gè)系列的技術(shù)核心原理是相同的2

7、4O這兩個(gè)系列的機(jī)器采用的都是邊合成邊測序的方法，它的測序過程主要分為以下4步，如圖4.(1) DNA寺測文庫構(gòu)建利用超聲波把待測的DNA羊本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外,主要是打斷成200-500bp長的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構(gòu)建出單鏈DNAC庫。(2) FlowcellFlowcell是用于吸附流動DNAt段的槽道，當(dāng)文庫建女?后，這些文庫中的DNAft通過flowcell的時(shí)候會隨機(jī)附著在flowcell表面的channel上。每個(gè)Flowcell有8個(gè)channel,每個(gè)channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在D

8、NAt段兩端的接頭相互配對(這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA勺原因)，并能支持DNAft其表面進(jìn)行橋式PCR勺擴(kuò)增。(3) 橋式PCRT增與變性橋式PCFOFlowcell表面所固定的接頭為模板，進(jìn)行橋形擴(kuò)增，如圖4.a所示。經(jīng)過不斷的擴(kuò)增和變性循環(huán)，最終每個(gè)DNAt段都將在各自的位置上集中成束，每一個(gè)束都含有單個(gè)DNA真板的很多分拷貝，進(jìn)行這一過程的目的在于實(shí)現(xiàn)將堿基的信號強(qiáng)度放大，以達(dá)到測序所需的信號要求。(4)測序測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA5合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP(如同Sanger測序法)。這些dNTP的3-OH

9、被化學(xué)方法所保護(hù)，因而每次只能添加一個(gè)dNTP在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DN臊合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號的記錄，最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號并去除dNTP3-OH保護(hù)基團(tuán)，以便能進(jìn)行下一輪的測序反應(yīng)。Illumina的這種測序技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長度的準(zhǔn)確測量問題，它的主要測序錯(cuò)誤來源是堿基的替換，目前它的測序錯(cuò)誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序?yàn)槔?0x測序深度大約為1周。Ad

10、aptersPreparegenomkDNAsampleRandomlyfragmentgenomicDMAndligateadaptertobo(hendsoftheOfpflRKfSAttachDNAtosurfaceBndnglesaredfragmentsrandom夕tothemidesurfaceofThe3Vcellchannels.BridgeamplifiutionAddunlabelednudeoodeandenzyme(oinicacesoldplwsebridge4mplrkAion.Dtrwturthdoublestrandedmolecules:/Imageoffi

11、rstchemistrycycleAfterlaserexcftationrapturetheimageofemittedfluorescencefromeachclusteronthefk)wcellRecordtheidentityofthefirstbaseforeachcluster.BeforeinitiatingthenextchemistrycydeTheblocked3terminusaMthefluoroprefromeachincorporatedbaseareremoved.Arstchemistrycycle:.determinefirstbase.Toinitiate

12、thefirst/sequencingeye他addalfourlabeledreversibleterminators,primerandDNApolymeraseenzymetotheflowcell.SequencereadovermultiplechemistrycyclesRepeatcyclesofsequencingtodeterminethesequenceofbasesinagivenfragmentasinglebaseatatime.http:Vblog.esdn.nct/dyllovc98圖4.Illumina測序流程Roche454測序系統(tǒng)是第一個(gè)商業(yè)化運(yùn)營二代測序技

13、術(shù)的平臺。它的主要測序原理是（圖5abc）2（DdnAc庫制備454測序系統(tǒng)的文件構(gòu)建方式和illumina的不同，它是利用噴霧法將待測DNA丁斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎yDN儂性后用雜交引物進(jìn)行PCFT增，連接載體，構(gòu)建單鏈DN庫（圖5a）。（2）EmulsionPCR（乳液PCR其實(shí)是一個(gè)注水到油的獨(dú)特過程）454當(dāng)然DNAT增過程也和illumina的截然不同，它將這些單鏈DN閣合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCFft大的特點(diǎn)是可以形成數(shù)目龐大的獨(dú)立反應(yīng)空間以進(jìn)行DN/T增。其關(guān)鍵技術(shù)是“注水到油”（水包油），基

14、本過程是在PCRE應(yīng)前，將包含PC刖有反應(yīng)成分的水溶液注入到高速旋轉(zhuǎn)的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數(shù)個(gè)被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構(gòu)成了獨(dú)立的PC阪應(yīng)空間。理想狀態(tài)下，每個(gè)小水滴只含一個(gè)DNA真板和一個(gè)磁珠。這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的DNAff列，因此這些單鏈DNAff列能夠特異地結(jié)合在磁珠上。同時(shí)孵育體系中含有PC網(wǎng)應(yīng)試劑，所以保證了每個(gè)與磁珠結(jié)合的小片段都能獨(dú)立進(jìn)行PCFT增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。當(dāng)反應(yīng)完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA勺磁珠富集下來。進(jìn)過擴(kuò)增，每個(gè)小片段都將被擴(kuò)增約100萬倍，從而達(dá)到下一步測序所要求的DNA!。（3）焦磷酸測序測序前

15、需要先用一種聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白處理帶有DNA勺磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個(gè)小孔僅能容納一個(gè)磁珠，通過這種方法來固定每個(gè)磁珠的位置，以便檢測接下來的測序反應(yīng)過程。測序方法采用焦磷酸測序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動測序反應(yīng)。測序反應(yīng)以磁珠上大量擴(kuò)增出的單鏈DNM模板，每次反應(yīng)加入一種dNTF行合成反應(yīng)。如果dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化學(xué)酶反應(yīng)生成ATR生成的ATPffi熒光素酶共同氧化使測序反應(yīng)中的熒光素分子并發(fā)出熒光，同時(shí)由PTP板另一側(cè)的

16、CCD&相機(jī)記錄，最后通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號處理而獲得最終的測序結(jié)果。由于每一種dNTPft反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來判斷被測分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNT噲?jiān)陔p磷酸酶的作用下降解ATP從而導(dǎo)致熒光淬滅，以便使測序反應(yīng)進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)。由于454測序技術(shù)中，每個(gè)測序反應(yīng)都在PTP上獨(dú)立的小孔中進(jìn)行，因而能大大降低相互間的干擾和測序偏差。454技術(shù)最大的優(yōu)勢在于其能獲得較長的測序讀長，當(dāng)前454技術(shù)的平均讀長可達(dá)400bp,并且454技術(shù)和川umina的Solexa和Hiseq技術(shù)不同，它最主要的一個(gè)缺點(diǎn)是無法準(zhǔn)確測量同聚物的長度，如當(dāng)序列中存在類似于PolyA的情況時(shí)

17、，測序反應(yīng)會一次加入多個(gè)而所加入的T的個(gè)數(shù)只能通過熒光強(qiáng)度推測獲得，這就有可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。也正是由于這一原因，454技術(shù)會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯(cuò)誤。DNAIibniyprepantion45hoursLigationEmdsionKR3hours加.曲河卻b酈黯騏Wilirary.sitDNAlibrarySquindng75MursAmplifiedltDNAlibrarybeadsSbletJor.(EliteABfragrremsAYeldiametefaverageof44pm-400,000readsobtainedinpanllel*Asinglechnadampl

18、ifiedsstDNA上adisdeposited能岷llGenomefragmentedbynebulizatonNocloning;nooolong,ntONRIib修iy。既ted所由adaptors*ME卜網(wǎng)由日腎HfcTMusing加dfbbHiriLxrkdlionsitDNAlibrary/Annealst3NAtoanexcessMEmulsifybeads2ndPCft2bnalamplificationoccuriBramicroreactaisand：DMAcapturebeadsinwater-in-oilai*m21eam)得tfirichforDNA-positiv

19、emkroreactcxsbeds5.Roche454測序流程Solid測序技術(shù)是ABI公司于2007年開始投入用于商業(yè)測序應(yīng)用的儀器。它基于連接酶法,即利用DNA1接酶在連接過程之中測序（圖6）2,4。它的原理是：5OLiDrmsubstrateU1MGlassslidePIadapterTerrplatesequenceDibaseprobesCleavagesiteTemplate2ndbaseHLJ41,PrimeandligatePirimerround1liemDlatesequence5.RepeatstepsUtoextendsequenceUgationcydt1234567

20、!hjft4.CleaveofffluorUniv*rAlprimpr(n-1)ACACGTCAATACCTGTGCAGTTATGG6.RpedlRctwith.n-3rn-4primersReadpositionoUniversalseqprirrer(n)Univrrhilprinirr|n-l)3imwinmninIridgenrobeUniversalseqiprimer3TnvnHnrmvTT16JOSI32B14J3JaRErcI*Universalseqpnmern-J)，3fTTT1PmmTTTTTTBrilgepretiep-Universalseqprimer(n-4)3B

21、ridgifprobinditdtespositionsofknrrogationLign匕皿婢隘匕工34信口6圖6-a.Solid測序技術(shù)(1)dnAc庫構(gòu)建片段打斷并在片段兩端加上測序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNAC庫。（2）EmulsionPCRSolid的PCR3程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsionPCR但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多，只有1um在擴(kuò)增的同時(shí)對擴(kuò)增產(chǎn)物的3端進(jìn)行修飾，這是為下一步的測序過程作的準(zhǔn)備。3修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測序區(qū)域（圖6-a）。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻

22、片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。（3）連接酶測序這一步是Solid測序的獨(dú)特之處。它并沒有采用以前測序時(shí)所常用的DNA5合酶，而是采用了連接酶。Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡單表示為：3-XXnnnzzz-5。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA真板鏈配對。探針的5末端分別標(biāo)記了CY5TexasRed、CY36-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）。這個(gè)8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨(dú)特測序法，兩個(gè)堿基確定一

23、個(gè)熒光信號，相當(dāng)于一次能決定兩個(gè)堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法。當(dāng)熒光探針能夠與DNA真板鏈配對而連接上時(shí)，就會發(fā)出代表第1,2位堿基的熒光信號，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1,2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號后，通過化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割，這樣就能移除熒光信號，以便進(jìn)行下一個(gè)位置的測序。不過值得注意的是，通過這種測序方法，每次測序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位,，在測到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n-1進(jìn)行第二輪測序。引物n-1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個(gè)堿基（圖6-a.

24、8）。也即是，通過引物n-1在引物n的基礎(chǔ)上將測序位置往3端移動一個(gè)堿基位置，因而就能測定第0、1位和第5、6位,，第二輪測序完成，依此類推，直至第五輪測序，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個(gè)位置的堿基均被檢測了兩次。該技術(shù)的讀長在2X50bp,后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜。由于雙次檢測，這一技術(shù)的原始測序準(zhǔn)確性高達(dá)99.94%,而15x覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確性更是達(dá)到了99.999%,應(yīng)該說是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個(gè)熒光信號，因而一旦發(fā)生錯(cuò)誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯(cuò)誤。DatacollectionandimageanalysisCollettIde

25、ntifyIdentifycolorimagebeadsbeadcolorPrimeTroundlrligationcycle1Primerround2tligationcycle1Primerround3rligattoncycle1Primerround4,ligationcycle1ColorspaceforthissequenceDoubleinterrogationWith2baeencodingeachbateisdefinedtwiceDecodingColorspace&equenceTAACAA（GA）PossibledinudeotidesGCCACCICCGGT（GG）A

26、GBasezero（atXtc3TTCTATTGGGGAIYYYlATGGADecodedsequenceBasespesequerfeltP；/bIOg.C5dMIiet/dyl1OVe98圖6-b.Solid測序技術(shù)第三代測序技術(shù)測序技術(shù)在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMR和OxfordNanoporeTechnologies納米孔單分子測序技術(shù)，被稱之為第三代測序技術(shù)。與前兩代相比，他們最大的特點(diǎn)就是單分子測序，測序過程無需進(jìn)行PCRT增。其中PacBioSMR技術(shù)其實(shí)也應(yīng)用了邊合成邊測序的思想5,并以SMRT5片為測序載體。基本原理是：DN碑合酶和年K板結(jié)合，4色熒光

27、標(biāo)記4種堿基（即是dNTP，在堿基配對階段，不同堿基的加入，會發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。同時(shí)這個(gè)DNA聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長讀長的關(guān)鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBioSMR政術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵是怎樣將反應(yīng)信號與周圍游離堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來。他們利用的是ZMW零模波導(dǎo)孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究，如果直徑大于微波波長，能量就會在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板而泄露出來，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長，能量不會輻射到周圍，而是保持直線狀態(tài)（光衍射的原理），從而可起保護(hù)作用。同理，在一個(gè)反應(yīng)管（S

28、MRTCeH:單分子實(shí)時(shí)反應(yīng)孔）中有許多這樣的圓形納米小孔，即ZMW昏模波導(dǎo)孔），外徑100多納米，比檢測激光波長?。〝?shù)百納米）,激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū)，能量被限制在一個(gè)小范圍（體積20X10-21L）里，正好足夠覆蓋需要檢測的部分，使得信號僅來自這個(gè)小反應(yīng)區(qū)域，孔外過多游離核甘酸單體依然留在黑暗中，從而實(shí)現(xiàn)將背景降到最低。另外，可以通過檢測相鄰兩個(gè)堿基之間的測序時(shí)間，來檢測一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾，則通過聚合酶時(shí)的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個(gè)來之間檢測甲基化等信息（圖7）。SMR政術(shù)的測序速度很快，每秒約10個(gè)dNTP但是，同時(shí)其測序錯(cuò)誤

29、率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術(shù)的通病），達(dá)到15%,但好在它的出錯(cuò)是隨機(jī)的，并不會像第二代測序技術(shù)那樣存在測序錯(cuò)誤的偏向，因而可以通過多次測序來進(jìn)行有效的糾錯(cuò)。圖7.PacBioSMRT測序原理OxfordNanoporeTechnologies公司所開發(fā)的納米單分子測序技術(shù)與以往的測序技術(shù)皆不同，它是基于電信號而不是光信號的測序技術(shù)50該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，他們設(shè)計(jì)了一種特殊的納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭。當(dāng)DNAa基通過納米孔時(shí)，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測到這些變化從而鑒定所通過的堿基（圖8）。該

30、公司在去年基因組生物學(xué)技術(shù)進(jìn)展年會668丁）推出第一款商業(yè)化的納米孔測序儀，引起了科學(xué)界的極大關(guān)注。納米孔測序（和其他第三代測序技術(shù)）有望解決目前測序平臺的不足，納米孔測序的主要特點(diǎn)是：讀長很長，大約在幾十kb,甚至100kb;錯(cuò)誤率目前介于1%14%且是隨機(jī)錯(cuò)誤，而不是聚集在t取的兩端；數(shù)據(jù)可實(shí)時(shí)讀??；通量很高（30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成）;起始DNAfe測序過程中不被破壞；以及樣品制備簡單又便宜。理論上，它也能直接測序RNA納米孔單分子測序計(jì)算還有另一大特點(diǎn)，它能夠直接讀取出甲基化的胞喀呢，而不必像傳統(tǒng)方法那樣對基因組進(jìn)行bisulfite處理。這對于在基因組水平直接研究表觀遺傳相關(guān)

31、現(xiàn)象有極大的幫助。并且改方法的測序準(zhǔn)確性可達(dá)99.8%,而且一旦發(fā)現(xiàn)測序錯(cuò)誤也能較容易地進(jìn)行糾正。但目前似乎還沒有應(yīng)用該技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。L.CMMirlkliL/LJU4l4Cl圖8,納米孔測序其他測序技術(shù)目前還有一種基于半導(dǎo)體芯片的新一代革命性測序技術(shù)一一IonTorrent6。該技術(shù)使用了一種布滿小孔的高密度半導(dǎo)體芯片，一個(gè)小孔就是一個(gè)測序反應(yīng)池。當(dāng)DN咪合酶把核甘酸聚合到延伸中的DN&S上時(shí)，會釋放出一個(gè)氫離子，反應(yīng)池中的PH發(fā)生改變，位于池下的離子感受器感受到H璃子信號，H譙子信號再直接轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，從而讀出DN心列（圖9）。這一技術(shù)的發(fā)明人同時(shí)也是454測序技術(shù)的發(fā)明人之一Jona

32、thanRothberg,它的文庫和樣本制備跟454技術(shù)很像，甚至可以說就是454的翻版，只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測H+J號的變化來獲得序列堿基信息。IonTorrent相比于其他測序技術(shù)來說，不需要昂貴的物理成像等設(shè)備，因此，成本相對來說會低，體積也會比較小，同時(shí)操作也要更為簡單，速度也相當(dāng)快速，除了2天文庫制作時(shí)間，整個(gè)上機(jī)測序可在2-3,5小時(shí)內(nèi)完成，不過整個(gè)芯片的通量并不高，目前是10G左右，但非常適合小基因組和外顯子驗(yàn)證的測序。圖9.IonTorrent小結(jié)以上，對各代測序技術(shù)的原理做了簡要的闡述，這三代測序技術(shù)的特點(diǎn)比較匯總在以下表1和表2中。其中測序成

33、本，讀長和通量是評估該測序技術(shù)先進(jìn)與否的三個(gè)重要指標(biāo)。第一代和第二代測序技術(shù)除了通量和成本上的差異之外，其測序核心原理（除Solid是邊連接邊測序之外）都是基于邊合成邊測序的思想。第二代測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是成本較之一代大大下降，通量大大提升，但缺點(diǎn)是所引入PCR程會在一定程度上增加測序的錯(cuò)誤率，并且具有系統(tǒng)偏向性，同時(shí)讀長也比較短。第三代測序技術(shù)是為了解決第二代所存在的缺點(diǎn)而開發(fā)的，它的根本特點(diǎn)是單分子測序，不需要任何PCR的過程，這是為了能有效避免因PC就向性而導(dǎo)致的系統(tǒng)錯(cuò)誤，同時(shí)提高讀長，并要保持二代技術(shù)的高通量，低成本的優(yōu)點(diǎn)。表1:測序技術(shù)的比較第X代公司平臺名稱測序方法檢測方法大約讀長（堿

34、基數(shù)）優(yōu)點(diǎn)相對局限性第一代ABI/生命技術(shù)公司3130xL-3730xL桑格-毛細(xì)管電泳測序法/光學(xué)600-1000高讀長，準(zhǔn)確度一次性達(dá)標(biāo)率高，能很好處理重復(fù)序列和多聚序列通量低；樣品制備成本高，使之難以做大量的平行測序第一代貝克曼GeXR!傳分析系統(tǒng)桑格-毛細(xì)管電泳測序法/光學(xué)600-1000高讀長，準(zhǔn)確度一次性達(dá)標(biāo)率高，能很好處理重復(fù)序列和多聚序列；易小型化通量低；單個(gè)樣品的制備成本相對較局第一代Roche/454基因組測序儀FLX系統(tǒng)焦磷酸測序法光學(xué)230-400在第二代中最高讀長；比第一代的測序通量大樣品制備較難；難于處理重復(fù)和何種堿基多聚區(qū)域；試劑沖洗帶來錯(cuò)誤累積；儀器昂貴第一代可

35、逆鏈IlluminaHiSeq2000,HiSeq2500/MiSeq終止物和合成測序法dt/光學(xué)2x150很高測序通量儀器昂貴；用于數(shù)據(jù)刪節(jié)和分析的費(fèi)用很高第一代很高測序通量；在廣為接受的幾測序運(yùn)行時(shí)間長；讀長短，ABI/Solid5500xlSolid系統(tǒng)連接測序法dt/光學(xué)25-35種第二代平臺中，所要拼接出造成成本高，數(shù)據(jù)分析困難和基因組拼接困難；儀器昂人類基因組的試劑成本最低貴第單分子/光學(xué)高通量；在第二讀長短，推高了測序成本，一搠利克斯Heliscope合成測25-30代中屬于單分子降低了基因組拼接的質(zhì)量；代序法I性質(zhì)的測序技術(shù)儀器非常昂貴第三代太平洋生物科學(xué)公司PacBioRS實(shí)

36、時(shí)單分子DNA測序/光學(xué)1000高平均讀長，比第一代的測序時(shí)間降低；不需要擴(kuò)增；最長單個(gè)讀長接近3000堿基并不能圖效地將DN聯(lián)臺酶加到測序陣列中；準(zhǔn)確性一次性達(dá)標(biāo)的機(jī)會低（81-83%）;DNA聚合酶在陣列中降解；總體上每個(gè)堿基測序成本高（儀器昂貴）；第三代全基因組學(xué)公司GeXR!傳分析系統(tǒng)復(fù)合探針錨雜交和連接技術(shù)/光學(xué)10在第三代中通量最高；在所有測序技術(shù)中，用于拼L個(gè)人基因組的試劑成本最低；每個(gè)測序步驟獨(dú)立，使錯(cuò)誤的累積變得最低低讀長；模板制備妨礙長重復(fù)序列區(qū)域測序；樣品制備費(fèi)事；尚無商業(yè)化供應(yīng)的儀器第三代IonTorrent/生命技術(shù)公司個(gè)人基因組測序儀（PGM合成測序法以離感場效應(yīng)晶體管檢測pH值變化100-200對核酸堿基的摻入可直接測定；在自然條件下進(jìn)行DNA合成（不需要使用修飾過的堿基）一步步的洗脫過程可導(dǎo)致錯(cuò)誤累積；閱讀高重復(fù)和同種多聚序列時(shí)有潛在困難；第三代牛津納米孔公司gridlON納米孔外切酶測序電流問未止里有潛力達(dá)到高讀長；可以成本生產(chǎn)納米孔；無需熒光標(biāo)記或光學(xué)手段切斷的核甘酸可能被讀錯(cuò)方向；難于生產(chǎn)出帶多重平行孔的裝置表2:主流測序機(jī)器的成本測序比較gtAddi腦門向ihstruinynls1CiJDtr.j1bComp明EiMnal相filesi