定量免疫實(shí)驗(yàn)

1、 趙麗婭趙麗婭一、原理一、原理 定量免疫實(shí)驗(yàn)的原理是基于抗原 - 抗體的反應(yīng)。即抗原決定簇與抗體結(jié)合部位相結(jié)合，這種結(jié)合，這是由氫鍵，離子鍵，疏水相互作用，以及范德華力來實(shí)現(xiàn)的，它是一種平衡反應(yīng)，符合質(zhì)量相互作用定律。 由于抗體抗原的結(jié)合具有特異性和專一性的特點(diǎn)，這種檢測可以定量地檢測某一特異的蛋白（抗原或抗體）。抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的速度，跟溫的速度，跟溫度相關(guān)，適當(dāng)度相關(guān)，適當(dāng)?shù)脑黾訙囟?，的增加溫度，或者降低溫度，或者降低溫度，可以改變抗原可以改變抗原抗體的反應(yīng)時抗體的反應(yīng)時間。間。二二 、應(yīng)用、應(yīng)用 在醫(yī)療診斷和研究中測定生物分子的濃度，例如，激素，細(xì)胞因子，和腫瘤標(biāo)志物或者小的化學(xué)

2、分子，可用于各種疾病的 診斷、療效評價及發(fā)病機(jī)制的研究。免疫測定法的優(yōu)點(diǎn)是它具有很高的靈敏度。測定的靈敏度ng 甚至pg水平。三、常用方法三、常用方法1、雙抗體夾心法 將已知抗體結(jié)合在固相載體，加入待測的樣品（抗原），再加入酶標(biāo)抗體。最后再加入酶的顯色底物與之反應(yīng)顯色。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗原）與固相載體表面的抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的

3、深淺進(jìn)行定性或定量分析。2、競爭法 小分子半抗原如地高辛、茶堿等因其只有一個抗原決定簇，可采用競爭抑制法測定。競爭法就是將待檢抗原和標(biāo)記的抗原競爭的 與固相的抗體結(jié)合，樣品中抗原含量越多，結(jié)合在固相抗體上的酶標(biāo)抗原就越少，顯色越淺。以此便可以檢測出未知抗原的量。操作步驟1）先用特異性抗體包被固相載體并封閉。2）同時加入待測樣本和酶標(biāo)抗原小分子，孵育一定時間后洗板。3）加入酶底物，孵育顯色測定，顯色的強(qiáng)弱與待測樣本的小分子含量成反比，檢測限度檢測限度定義：檢測限為最低抗原濃度，用統(tǒng)計學(xué)方法計算出的，最低的測量信號是一個顯著偏離0的值。方法：對應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的零值，用10個起始抗原濃度的數(shù)值。計算它

4、們的的算術(shù)平均值和它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差。選擇方法的原則選擇方法的原則每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，如何選擇將取決于實(shí)驗(yàn)者的免疫測定的要求。關(guān)鍵參數(shù)是所需靈敏度，合適的時間，抗原的大小，標(biāo)記的能力。對于非常低的抗原濃度的標(biāo)本，需要敏感性高的方法。夾心測定其理論最高敏感度為10-15 到10- 16 mol/l。競爭實(shí)驗(yàn)只有約10-14 mol/I。免疫測定的靈敏度，主要取決于抗體與抗原親和力。抗原的大小和結(jié)構(gòu)也很重要。使用夾心測定法中，抗原必須具備兩個抗體結(jié)合位點(diǎn)，可以結(jié)合不同的兩種抗體，小的半抗原不能用雙抗體夾心法進(jìn)行檢測。RIA放射免疫實(shí)驗(yàn)放射免疫實(shí)驗(yàn)放射免疫分析也稱同位素標(biāo)記技術(shù)。它是將同位素分析的高靈敏

5、性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種靈敏的檢測方法。RIA法所用的標(biāo)記標(biāo)記物質(zhì)是放射性核素，檢測時需要特殊儀器檢測放射量，以對待測物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析。雖然放射免疫法，在許多領(lǐng)域被其他免疫測定法（ELISA法等）被替代，但它對于小分子的定量測定始終扮演一個重要的角色（如肽激素）。 放射免疫分析技術(shù)的原理為放射性標(biāo)記的抗原（Ag*)和被測抗原Ag（或標(biāo)準(zhǔn)品）與有限的特異性抗體發(fā)生可逆的競爭結(jié)合反應(yīng)，最終形成的放射性抗原-抗體復(fù)合物的量與被測物的含量成負(fù)相關(guān)。當(dāng)被測抗原含量高時，對抗體的競爭結(jié)合能力就越強(qiáng)，Ag-Ab的形成量越多,Ag*-Ab的復(fù)合物就相對較少，反之，當(dāng)待測抗原含量低時，對抗體的

6、結(jié)合能力就弱，Ag*-Ab復(fù)合物的形成量就增多。游離抗原與抗原抗體的分離游離抗原與抗原抗體的分離1、吸附游離的抗原活性炭、滑石粉、硅酸鹽、離子交換凝膠柱2、沉淀抗原抗體復(fù)合物。有機(jī)溶劑，硫酸銨，PEG3、市售的固相分離的固相載體。放射性的檢測放射性的檢測放射活性可用閃爍計數(shù)器測定。此裝置的原理是基于放射性同位素釋放的放射性能量可轉(zhuǎn)換為光子，其信號能夠被檢測到。光強(qiáng)度與核衰變釋放的能量成正比。常用的測量儀器：1、碘化鈉晶體閃爍器。但采用晶體閃爍器的測量儀器不適合用于檢測弱發(fā)射器如3H和14C。2、液體閃爍計數(shù)器。它是一種或多種有機(jī)溶劑的混合物，可確保與含水試樣好混勻。一個粒子的放射性衰變后的能量

7、就轉(zhuǎn)移到溶劑分子，使它變得活躍。這些溶劑分子的能量轉(zhuǎn)移到熒光團(tuán)分子。能量大約為365納米范圍內(nèi)的光子的形式，可以檢測熒光的強(qiáng)度與抗原或抗體的濃度呈負(fù)相關(guān)。 一些液體閃爍計數(shù)器不能檢測短波，所以第二熒光團(tuán)加入到混合液中。它由第一熒光團(tuán)激發(fā)而發(fā)射更長波長的光，范圍為約420納米內(nèi)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)1971年瑞典的Engvall等人分別以纖維素和聚苯乙烯試管作為固相載體吸附抗原/抗體，建立了酶聯(lián)免疫吸附法簡稱(ELISA)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反應(yīng)板作為固相免疫吸附載體，使ELISA法得以推廣應(yīng)用。由于標(biāo)記酶的酶促反應(yīng)的放大作用，它的靈敏度不僅接近

8、放射免疫的檢出水平，并且還避免使用放射性同位素產(chǎn)生的弊病。 ELISA法由于無需特殊的儀器， 檢測簡單，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床和生物學(xué)研究上，測定各種各樣的抗原、半抗原和抗體，特別是在單克隆抗體研究中，為雜交瘤細(xì)胞株的篩選，提供了簡便、靈敏、快速的檢測方法。 ELISA是免疫酶技術(shù)的一種，其特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板（或球）吸附抗原或抗體，使之固相化，免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都能在其中進(jìn)行，在每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌，這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系，也減少了未反應(yīng)的游離的抗體或抗原的分離步驟。 幾種常用的幾種常用的ELISA測定方法測定方法測定抗體的間接法測定抗體的間接法測定抗原的雙抗體夾心法測定抗原的

9、雙抗體夾心法測定抗原的競爭法測定抗原的競爭法 測定抗原抗體的間接法 原理是利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已于固相抗原結(jié)合的待檢抗體，故稱為間接法。 首先將已知的定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板的凹孔內(nèi)，加待測抗體，保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白，加酶標(biāo)抗抗體，保溫后洗滌，加底物保溫30分鐘后，加酸或堿中止酶促反應(yīng)，用目測或光電比色測定抗體含量。包被包被 包被就是將抗體或抗原結(jié)合到固相載體上的過程。聚苯乙烯微量滴定板是比較常用的，它具有對蛋白質(zhì)高結(jié)合能力，這種結(jié)合主要是基于疏水相互作用相對不依賴于pH，一般來說，抗體和抗原的稀釋液采用PBS（pH7.4）碳酸鈉緩沖液（pH 9.6）（表4-1）。最優(yōu)的

10、抗體和抗原濃度必須憑經(jīng)驗(yàn)確定，根據(jù)測定的要求，但它應(yīng)位于0.5一10.0g/ ml的范圍內(nèi)。通常在加入適量包被緩沖液后。溫育過夜（1 0一1 8小時） 以避免在各個洗滌步驟中的抗原 - 抗體復(fù)合物的損失，抗體或抗原可以共價偶聯(lián)到微量滴定板。封閉包被時所用的抗體或抗原濃度較低，吸收后固相載體表面仍有未被占據(jù)的空隙，為了避免固相載體非特異性吸附酶標(biāo)記抗體或抗原分子。因此，需要用一種不相關(guān)蛋白填充空隙，此步驟叫做封閉。常用的封閉劑有4%的脫脂奶粉，0.55的BSA（表4-1）10%的小牛血清1%的明膠。 封閉是否必要，取決于elisa的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA 固相均需封閉，封閉不

11、當(dāng)反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的洗滌 各步驟的洗滌對于獲取好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，取得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是至關(guān)重要的。對于洗滌步驟，可以用PBS，生理鹽水，PBS液，或者用簡單的自來水。提示：洗滌時添加非離子型去污劑，如吐溫20，Nonidet洗滌劑P-40和Triton X-100中的0.010.1的溫育與標(biāo)記抗體或抗原中的濃度也降低了非特異性吸附。而且在該濃度范圍內(nèi)抗原抗體的特異性結(jié)合的也不被干擾。酶和底物酶和底物被用作標(biāo)記的酶，必須適應(yīng)多種要求1、高酶活性是一個重要的條件。2、該酶應(yīng)

12、該能在4- 37的范圍內(nèi)穩(wěn)定一段較長時間，并應(yīng)容易與抗體或抗原耦合。酶辣根過氧化物酶（HRP），從小牛腸堿性磷酸酶（AP），半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶。酶的活性是通過比色法，熒光法等技術(shù)檢測來確定。比色法是最基礎(chǔ)最常用的，由于以下優(yōu)點(diǎn)：（1）有色終產(chǎn)物在反應(yīng)停止后保持穩(wěn)定很長一段時間; （2）在篩選程序中，微量滴定板的成色反應(yīng)可被非?？斓哪繙y到; （3）反應(yīng)結(jié)果的測量可以快速用相對廉價的分光光度計進(jìn)行。常見的酶及其底物辣根過氧化物酶（HRP)，常用的供氫體是TMB，TMB氧化后呈藍(lán)色，最適的吸收波長為405nm。常用的反應(yīng)終止液為硫酸，濃度一般采用2mol/l。堿性磷酸酯酶（AP),在ELISA

13、中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價格昂貴。采用的對硝基苯磷酸酯作為底物，顯色反應(yīng)后呈黃色，反應(yīng)終止液為NaOH,濃度一般采用2mol/l。 HRP和AP均有熒光底物，可以取代顯色反應(yīng)而進(jìn)行熒光檢測，熒光檢測的靈敏度高于顯色反應(yīng)，但是顯色反應(yīng)所需藥品較便宜，所以一般顯色反應(yīng)較常用。Table 4-2: Enzymes and substrates for the ELlSA.實(shí)踐實(shí)踐人表皮生長因子人表皮生長因子ELISA試劑盒試劑盒TextTextTextAdd your title請在此添加段落內(nèi)容請在此添加段落內(nèi)容請在此添加段落內(nèi)容請在此添加段落內(nèi)容Content

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