酶解大豆蛋白生產生物活性肽

1、酶解大豆蛋白生產生物活性肽游子娟 2013.3.18酶的選擇 動物蛋白酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等； 植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶等； 微生物來源蛋白酶，如丹麥 Novo 公司生產的堿性蛋白酶 Alcalase、復合蛋白酶 Protamex、中性蛋白酶 Neutrase 以及國產的堿性蛋白酶地衣型芽抱桿菌2709、中性蛋白酶枯草桿菌 1.398、放線菌 l66、棲土曲霉 3.942、酸性蛋白酶黑曲霉 3350等。一些蛋白酶的切割位點和較適 pH 值大豆肽的性質與功能 （l）易消化、易吸收性 （2）低抗原性 低分子肽具有低的抗原性，不會引起過敏反應，可為食物過敏

2、患者食用。（3）降膽固醇作用 大豆肽能刺激甲狀腺激素分泌，促使膽固醇代謝生成膽汁酸，膽汁酸又被食物纖維素所吸附排出體外，從而阻礙對膽固醇吸收，起到降低膽固醇的作用。（4）降血壓作用（5）減肥作用（6）抗疲勞、增強體力（7）抗氧化活性蛋白酶活力的測定方法 酶活力的定義為：1g 固體酶粉（或 1mL 液體酶），在一定溫度和 pH 條件下，lmin內水解標準酪蛋白產生 1g 酪氨酸，即為 1 個酶活力單位，以 U/g（U/mL）表示。 酶活測定方法為福林酚法。其原理為蛋白酶在一定的溫度與 pH 條件下，水解酪蛋白底物，產生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在堿性條件下，將福林試劑還原，生成鉬藍

3、與鎢藍，用分光光度計于波長 680nm 下測定溶液的吸光度。因酶活力與吸光度成正比例，由此可以計算產品的酶活力。水解度的測定方法 大豆蛋白水解度（DH）是水解過程中所斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的比例，通常表示為百分數(shù)的形式。肽鍵斷裂后生成多肽或氨基酸，-氨基氮含量增加，因此，水解度可根據(jù)水解過程中生成的 -氨基氮的數(shù)量得到按下式進行計算： DH（%）（水解后生成的 -氨基氮的量/樣品總含氮量）100% 水解后生成的 -氨基氮的量由甲醛滴定法測得，樣品總含氮量由凱氏定氮法測得 苦味評價方法 稱取奎啉 0.1g 溶于 50ml 5%乙醇溶液中，從中取 5ml 溶液用蒸餾水稀釋到100ml，得到 1.0

4、10-4奎啉溶液，再進一步稀釋成 510-5、2.510-5、110-5、510-6等濃度奎啉溶液，其苦味值分別定為 10、5、2.5、1、0.5,將制得的大豆多肽與不同濃度奎啉溶液比較，從而確定大豆多肽的苦味值。大豆肽抗氧化性的研究 大豆蛋白酶水解物中存在具有抗氧化性的活性肽，這類活性肽能抑制機體內自由基的大量積累，對提高自由基清除機制起到一定功效。從而能在一定程度上消除機體內多種生理功能的障礙，延緩機體的衰老，減少各種老年性疾病的發(fā)生。 生物抗氧化劑通常通過以下五種途徑來達到抗氧化目的：（1）抑制脂質過氧化反應。（2）直接清除活性氧自由基。（3）清除氧。（4）螯合金屬離子。（5）激活機體本

5、身內在抗氧化防御系統(tǒng)。五種途徑實際上都是圍繞阻斷脂質過氧化鏈式反應來進行。由于過量自由基容易引發(fā)機體內脂質過氧化鏈式反應，而機體內脂質過氧化是導致組織損傷的主要原因，所以研究抗氧化劑防止體內脂質過氧化的能力就顯得特別重要.研究方法 1.采用亞油酸硫氰酸鉀體系、鄰苯三酚自氧化體系研究蛋白酶種類、水解方法、水解時間、水解度對水解物抗氧化活性的影響，確定獲得高抗氧化性水解物的方法。 2.采用 Sephadex G25 凝膠過濾層析將大豆分離蛋白的水解物按分子量大小分成不同部分，采用亞油酸硫氰酸鉀體系、鄰苯三酚自氧化體系和人紅細胞氧化溶血實驗來研究水解液不同部分對抗氧化活性的影響。確定抗氧化性最高的大

6、豆肽的分子量范圍。 3采用高效凝膠過濾色譜對抗氧化活性較好的大豆肽段繼續(xù)進行分離，進一步確定抗氧化大豆肽的分子量分布范圍。亞油酸硫氰酸鉀方法 原理：通過鏈式反應積累起來的大量過氧化脂質將 Fe2+氧化生成Fe3+，F(xiàn)e3+和 SCN-結合，生成紅色硫氰酸鐵。大豆肽由于能夠清除自由基，從而阻斷或抑制鏈式反應，減少紅色硫氰酸鐵產生。因此通過比色反應可以檢測大豆肽抗氧化性的強弱。 在 5ml 具塞玻璃試管加入 1.5ml.0.15mol/L（pH7）的磷酸鹽緩沖液，加入濃度 2待測大豆蛋白水解物樣品 100L，加入 100l 50mmol/L 亞油酸的乙醇溶液和 25l 50mmol/L 的 FeC

7、l2-EDTA 溶液，采用漩渦分散器振蕩后，蓋上玻蓋，于50暗處水浴保溫，記錄保溫時間。 大豆蛋白水解物抗氧化性檢測 另取一支普通試管，加入 3ml75%乙醇，100 l 上述混合液， 100 l 1mol/L 的 FeCl2的 1.0mol/LHCl 溶液，100l30%KSCN，采用漩渦分散器振蕩后，立即計時，三分鐘后用蒸餾水作參比，在480nm 處測定溶液的吸光度 A。以抗氧化劑空白的吸光度為 A0，加抗氧化劑時吸光度為 AS，抗氧化活力 AA（antioxidative activity）可用公式表示： 鄰苯三酚方法 原理：試驗通過鄰苯三酚的自氧化反應產生 O2，研究大豆蛋白水解物對

8、O2的清除能力。鄰苯三酚的自氧化機理比較復雜，它在堿性條件下能迅速自氧化、釋放出 O2，生成黃色的中間產物，中間產物的累積 3040s 后與時間成線性關系，當有抗氧化劑存在時，可清除 O2，從而阻止中間產物的積累，導致產物顏色較淺，采用分光光度計對產物進行比色分析，可以檢測該抗氧化劑清除O2自由基的能力。 步驟：在一系列的試管中加 3ml 0.05mol/L 的 Tris-HCl 緩沖液(pH8.2)，分別加入濃度 2待測大豆肽樣品溶液 100l，空白組加入同體積蒸餾水，再加入 100l的 0.45mol/L 鄰苯三酚溶液，振蕩并計時，待計時至三分鐘時立即加入 100l 3%抗壞血酸溶液，振蕩，終止反應，在 325nm 處測吸光度 A。以抗氧化劑空白的吸光度為 A0，加抗氧化劑時吸光度為 AS，清除自由基活力 SA（scavengingactivity）可用公式表示：存在的問題 與生產大豆蛋白相比，制備大豆肽需要增加一定量的設備和工藝程序，所以生產成本比較高，價格也比較高，這也是多肽類制品進入市場較困難的主要原因 。 其次，將大豆蛋