基因工程基本操作過程目的基因與運載體結(jié)合實用教案

1、 基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究(ynji)提供了有力的手段。 基因工程要素：包括外源DNA，載體分子，工具酶和受體細(xì)胞等第1頁/共31頁第一頁，共32頁。1.提取目的基因2.目的基因與運載體結(jié)合（基因表達(biod)載體的構(gòu)建）是基因工程的核心。3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測和表達(biod) 切、接

2、、轉(zhuǎn)、增、檢重組(zhn z)DNA技術(shù)的操作步驟：第2頁/共31頁第二頁，共32頁。第3頁/共31頁第三頁，共32頁。 外源DNA片段同載體(zit)分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)，主要是依賴于限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶的作用. 基因重組: 就是利用 限制性內(nèi)切酶及其他一些酶類，切割和修飾載體(zit)DNA和目的基因?qū)烧哌B接起來，將目的基因插入于可以自我復(fù)制的載體(zit)內(nèi)，再轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，以這種外源性的目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)得到擴增或正確表達。 第4頁/共31頁第四頁，共32頁。 依不同的研究目的而定，認(rèn)真設(shè)計最終構(gòu)建的重組體分子。需要考慮下列2個方面。 如果研究目的是：

3、 (1) 表達有價值的蛋白(dnbi)質(zhì)，要考慮選用適當(dāng)?shù)膯幼印⒃鰪娮拥日{(diào)節(jié)序列和終止序列，要將目的基因置于啟動子的轉(zhuǎn)錄起始點的下游，并審視“閱讀框”是否正確，這些對表達融合蛋白(dnbi)至關(guān)重要。 (2) 對某一基因的上游序列進行調(diào)控機能分析，則需考慮選擇適當(dāng)?shù)膱蟾婊?，并將可能具有調(diào)控機能的目的基因置于報告基因的上游適當(dāng)位置。 若調(diào)控基因可能有增強子作用，還應(yīng)在報告基因下游適當(dāng)部位插入一個功能基因，由此反映增強子的作用。一、連接(linji)前的準(zhǔn)備第5頁/共31頁第五頁，共32頁。第6頁/共31頁第六頁，共32頁。 為了將目的基因重組于載體分子之中，需要將載體DNA和目的基因分別進行

4、適當(dāng)處理(chl)，使其可以互相連接，形成新的重組分子。二、連接(linji)前的處理第7頁/共31頁第七頁，共32頁。 載體DNA通常(tngchng)有著許多酶切位點但是并不是所有的酶切位點都可用于重組切割，理想的酶切位點應(yīng)該符合下列幾個條件: 1）位于載體上特定的酶切位點要盡可能少,最好是單一酶切位點,這樣才能保證目的基因和載體DNA以最高的幾率正確組合. 2） 在酶切位點之前要有一個較強的啟動子，使插入的目的基因可在該啟動子的指導(dǎo)下高效表達。 3）選擇的載體必須在連接后對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的編碼區(qū)讀框不改變。 1.對載體(zit)的要求第8頁/共31頁第八頁，共32頁。當(dāng)載體和外源D

5、NA用同樣(tngyng)的限制性內(nèi)切酶切割時，所形成的DNA末端就能夠彼此相匹配，可以被T4連接酶共價地連接起來，形成重組體分子。 但是,當(dāng)靶片段的末端與載體不匹配時，必須轉(zhuǎn)換其中一個或兩個片段的末端形式以便使之連接。這種末端的轉(zhuǎn)換通常用以下三種方式轉(zhuǎn)換： 3凹端補平：使用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段部分補平3凹端，將不匹配的3凹端轉(zhuǎn)換為粘端；或者完全補平，產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA相連接。 3突端切除：T4噬菌體DNA聚合酶具有強烈的3- 5外切核酸酶活性，可將3突端切除。 平端加上人工合成接頭：合成接頭是自相互補的兩個化學(xué)合成的寡核苷酸的等摩爾混合物，而兩個寡

6、聚體可形成帶一個或多個限制性酶切位點的平端雙鏈體。因此在平端DNA加接頭可為其亞克隆操作增加一個或多個限制性酶切位點。2、連接(linji)前的處理：末端的轉(zhuǎn)換 第9頁/共31頁第九頁，共32頁。 載體DNA和目的基因DNA的連接,按DNA片段末端性質(zhì)(xngzh)不同，可有下述不同的連接方法： 粘性末端連接法 平端連接法 同聚物加尾連接法 人工接頭連接法 三基因與載體(zit)的連接 4種方法 第10頁/共31頁第十頁，共32頁。 1. 同一限制酶切位點連接: 由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割產(chǎn)生單鏈突出的粘性末端和酶切位點附近的DNA序列不影響連接

7、.在連接酶的作用下即可形成重組DNA分子. 上述方法的缺點：由限制酶產(chǎn)生的具有粘性末端的載體DNA分子，在連接反應(yīng)中常發(fā)生自我環(huán)化作用，并在連接酶的作用下重新變成穩(wěn)定的共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 解決方法：用細(xì)菌的堿性磷酸酶預(yù)先處理線性的載體DNA分子，去除(q ch)其5末端的磷酸基。（一）粘性末端DNA片段(pin dun)的連接 第11頁/共31頁第十一頁，共32頁。第12頁/共31頁第十二頁，共32頁。 2.不同限制酶切位點連接: 由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的DNA片段、具有相同類型的粘性末端，彼此稱為互補末端也可以采用粘性末端連接。外源DNA和載體DNA經(jīng)過(jnggu)兩個限制性內(nèi)切

8、酶切割后一側(cè)產(chǎn)生的黏性末端，另一側(cè)產(chǎn)生平未端（可先生成黏性末端再補平）。第13頁/共31頁第十三頁，共32頁。第14頁/共31頁第十四頁，共32頁。雙酶切片(qi pin)段的定向克隆的優(yōu)點外源DNA只能以一個方向定向插入到重組質(zhì)粒中，以便目的基因(jyn)的正確轉(zhuǎn)錄和表達。載體與外源DNA結(jié)合處的限制酶切位點仍然保留，可以隨時從重組載體中通過相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割后分離獲得(hud)目的基因。不會自身環(huán)化，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌克隆大多數(shù)攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒。第15頁/共31頁第十五頁，共32頁。 一些內(nèi)切酶如Hae和Hpa切割產(chǎn)生DNA的片段沒有粘性末端，而是平末端。 具有平末端的酶切

9、載體只能與平末端的目的(md)基因連接。 T4DNA連接酶可催化相同或不相同的限制性內(nèi)切酶切割的平端間的連接。 平端連接比粘性末端連接要困難的多，其連接效率很低，約有粘性末端連接的1%。 適用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 適用于粘端補齊或切平形成的平端 （二）平端連接(linji) 第16頁/共31頁第十六頁，共32頁。第17頁/共31頁第十七頁，共32頁。提高平頭末端連接效率的方法包括： 加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加(zngji)分子間碰撞機會；加入10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用；加入單價陽離子（NaCl）。第18頁/共31頁第十八

10、頁，共32頁。 當(dāng)載體和外源DNA片段兩端的酶切位點之間，不可能 找到恰當(dāng)?shù)钠ヅ鋾r，解決方法： 人工接頭連接法：通過依次加入、連接合成DNA接 頭，再用限制酶切加以解決。 同聚物加尾連接法：可以(ky)利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在 載體酶切位點處和外源DNA片段的3端加上相互補 的同聚尾加以解決。 PCR法：通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)擴增外源DNA 片段，從而加上合適的限制性內(nèi)切酶的單一識別序 列，再用限制酶切加以解決。第19頁/共31頁第十九頁，共32頁。 同聚物加尾連接：利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源DNA和載體DNA分子要分別加上不同(

11、b tn)的寡聚核苷酸。dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA連接酶的作用下, 連接成為重組的DNA。這種方法可適用于任何來源的DNA片段。 但方法較繁，需要核酸外切酶、S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用 。（三）同聚物加尾法 第20頁/共31頁第二十頁，共32頁。第21頁/共31頁第二十一頁，共32頁。 同聚物接尾法實際上是一種人工粘性末端(m dun)連接法。 優(yōu)點：通過DNA加尾，既可以使兩個具平末端(m dun)的DNA片段進行連接，也可以使具平末端(m dun)的DNA片段與粘性末端(m dun)的DNA片段進行連接。 缺點：只對質(zhì)粒載體有效；質(zhì)粒和cDNA上的同聚物長度難以控制相等

12、，影響克隆效率；用其轉(zhuǎn)化宿主菌的效率依不同菌株而有較大差異。第22頁/共31頁第二十二頁，共32頁。 人工接頭（DNA寡核苷酸連桿）是人工合成的具有一個或數(shù)個特定 限制性內(nèi)切酶識別和切割序列的雙股平端DNA 短序列。 由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除(qich)產(chǎn) 生粘性末端，而進行粘端連接。（四）人工接頭(ji tu)連接法 第23頁/共31頁第二十三頁，共32頁。第24頁/共31頁第二十四頁，共32頁。 優(yōu)點：是進行DNA重組的一種既有效又實用的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端連接法的優(yōu)點，而且它可以根據(jù)(gnj)實驗的不同要求，設(shè)計出具有不同限制酶位點的人工接頭。若在體外連接反應(yīng)

13、中增加人工接頭的濃度，還會大大提高平末端DNA片段間的連接效率。 缺點：如果待克隆的DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的人工接頭相同的限制酶切位點，這樣在酶切消化人工接頭產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把克隆的外源基因切成不同的片段，從而為后繼的操作造成麻煩。 第25頁/共31頁第二十五頁，共32頁。自從 1973 年 Jackson 等人在一次分子生物學(xué)學(xué)會上首次提出基因可以人工重組，并能在細(xì)菌中復(fù)制。從此以后，基因工程成為一項新興的研究領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展，無論是基礎(chǔ)研究，還是應(yīng)用研究均取得了喜人的成果。這是生命科學(xué)發(fā)展的一次飛躍，生命科學(xué)已經(jīng)進入了一個(y )定向、快速改造生物性狀的新時代，受

14、到了國內(nèi)外廣泛的重視。開展基因工程研究幾十年來，建立了多種分別適用于微生物、動植物轉(zhuǎn)基因的載體受體系統(tǒng)，克隆出了一批有用的目的基因，研制出了數(shù)十種昂貴的基因工程藥物，培育出了一批具有特殊性狀的轉(zhuǎn)基因動植物。基因工程(jyn gngchng)成果：第26頁/共31頁第二十六頁，共32頁。 基因(jyn)工程在20世紀(jì)取得了很大的進展，至少有兩個有力的證明。一是轉(zhuǎn)基因(jyn)動植物，一是克隆技術(shù)。 轉(zhuǎn)基因(jyn)動植物由于植入了新的基因(jyn)，使得動植物具有了原先沒有的全新的性狀，這引起了一場農(nóng)業(yè)革命。如今，轉(zhuǎn)基因(jyn)技術(shù)已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用，如抗蟲西紅柿、生長迅速的鯽魚等。 1997年

15、世界十大科技突破之首是克隆羊的誕生。這只叫“多利”母綿羊是第一只通過無性繁殖產(chǎn)生的哺乳動物，它完全秉承了給予它細(xì)胞核的那只母羊的遺傳基因(jyn)?！翱寺　币粫r間成為人們注目的焦點。盡管有著倫理和社會方面的憂慮，但生物技術(shù)的巨大進步使人類對未來的想象有了更廣闊的空間。第27頁/共31頁第二十七頁，共32頁。第28頁/共31頁第二十八頁，共32頁。 當(dāng)今，國際上一項合作性的基因組測序計劃的完成。隨著功能性基因不斷被開發(fā)出，分離及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷完善，轉(zhuǎn)基因獲表達效率不斷提高，21 世紀(jì)基因工程研究將會有更大的發(fā)展。 人類將因為有了基因工程會使壽命大大延長；生物的多樣性將得到(d do)維護并發(fā)展?？茖W(xué)家們紛紛發(fā)表文章稱“基因工程，前景誘人”，但出現(xiàn)的問題也是極其復(fù)雜的，關(guān)系到人類自身的安全，包括我們生存的環(huán)境，種族的延續(xù)，甚至倫理道德。所以，在實施該工程時，必須把好審批關(guān)，從嚴(yán)掌握，避免失誤?；蚬こ?jyn gngchng)發(fā)展：第29頁/共31頁第二十九頁，共32頁。謝謝(xi xie)歡迎批評指正第30頁/共31頁第三十頁，共32頁。感謝您的觀看(gunkn)！第31頁/共3