薄層色譜生物自顯影技術

1、張旭.薄層色譜自顯影跟蹤分離天然乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究D.蘭州：蘭州理工大學，2010：1-62一、引言二、AD的發(fā)病機制及其治療藥物三、乙酰膽堿酯酶和阿爾茨海默癥四、改進的實驗方法的優(yōu)勢 人口老齡化是社會發(fā)展的趨勢與潮流。面對人口老齡化的世界性難題,老年性疾病的防治是刻不容緩的,這不僅是一個醫(yī)學問題也是一個社會問題。癡呆癥是腦部疾病引起的癥狀,表現為記憶力、學習能力、方向感、語言表達能力、理解能力和判斷力等智力的整體逐漸衰退,它主要困擾著老年人,是造成晚年殘疾的主要原因之一。阿爾茨海默病(AD)是造成老年癡呆的最主要原因,是一種進行性和致命性疾病。 AD是以-淀粉樣蛋白沉積的老年斑、異常磷

2、酸化Tau蛋白構成的神經纖維纏結和突觸變性、皮質及皮質下神經元變性為特征的腦退行性疾病,其發(fā)病機制比較復雜,包括遺傳因素、慢性感染、免疫缺陷和環(huán)境毒素等多種原因。關于AD發(fā)病機制的假說有很多,如膽堿能學說、A（-淀粉樣蛋白）學說、氧化應激學說、Tau蛋白學說、神經血管學說、基因學說等。這其中始于20世紀70年代的膽堿能學說是AD發(fā)病機制的最重要假說之一,也是目前絕大多數臨床藥物的理論依據。另外,20世紀80年代出現的A學說也越來越得到各國學者的認可和推崇。AChE的生物功能： 分為催化功能和非催化功能。催化功能是指AChE的經典功能,即在膽堿能突觸處快速水解神經遞質ACh,從而終止膽堿能神經信

3、號的傳遞。非催化功能是指其具有誘導軸突生長和突觸形成,參與細胞遷移、粘附和凋亡,促進造血細胞形成和A聚集以及影響炎癥和免疫反應等非經典功能。AChE是中樞膽堿能代謝的重要物質,其活性直接影響腦內興奮性遞質ACh的含量。它在膽堿能突觸間快速水解神經遞質ACh會加重患者的癥狀,因此抑制其活性可以間接改善癥狀。另一方面,促進A聚集的功能和AD密切相關。誘導細胞過度表達會AChE伴隨A表達升高,而且誘導A沉積并與之結合形成一種穩(wěn)定的復合物,比單純的A更具神經毒性,會造成周圍神經元死亡。上述結果表明,AChE不僅和AD的膽堿能系統(tǒng)有關,也參與了AD患者老年斑的形成發(fā)展以及神經元的死亡過程,而膽堿能活性下

4、降與AD的老年斑和神經纖維纏結密切相關,二者形成惡性循環(huán),加劇了AD的惡化。目前,增強膽堿能活性仍然是緩解AD癥狀最有效的方法,因此,尋找活性好、毒性低的AChE仍是開發(fā)治療AD新藥的有效途徑。目前用于治療AD的AchE類藥物除石杉堿甲外都是合成藥物，如他克林，多奈哌齊等，它們的存在活性不是很強，選擇性較低的缺點。目前發(fā)現的抗AChE活性較好的化合物多半是生物堿。此外，皂苷、萜類等也有不錯的AChE抑制活性。一、傳統(tǒng)的薄層色譜生物自顯影方法二、改進的薄層色譜生物自顯影方法Rhee等采用TCL生物自顯影技術對15種石蒜科植物提取物進行了AChE抑制活性測定,發(fā)現這種方法同Ellman方法相比檢測

5、限更低且避免了難溶樣品給測定帶來的不便。Marton等利用AChE水解乙酸-萘酯的產物可以和快藍鹽B發(fā)生顯色反應的原理,以TCL生物自顯影方法跟蹤分離,顯色后其背景為紫色,抑制劑斑點顯白色。然而,以上TCL生物自顯影方法存在三個不足:第一、酶、底物和顯色劑的用量較大,導致費用較高,難以大 規(guī)模應用,特別是對于研究經費不足的科研機構第二、檢測限過高,導致靈敏度較低第三、顯色背景和抑制劑斑點反差不明顯,不易觀察。酶用量的改進：當將顯色劑快藍鹽B的濃度降到0.5mg/mL時,可在酶溶液濃度為1.0U/mL的條件下出現穩(wěn)定的紫色背景,但顏色很淺。由于產生的背景很淺，不利于觀察抑制斑點，因此對部分實驗操

6、作進行了改進：待測樣品在薄層板上展開后,先噴酶液再噴乙酸-萘酯,并讓它們充分反應一段時間,最后再噴快藍鹽B。這樣做可以保證在實驗過程中生成更多的-萘酚,從而可以比原方法使用更少的酶液。實驗中噴灑酶液后,并非用熱風將板子完全吹干,而是改用冷風吹薄層板到沒有液體流動為止,并不將板子完全吹干,這樣做更有利于保持酶的活性。顯色背景的優(yōu)化底物溶液中所含乙醇比例對顯色背景的影響：乙醇濃度不宜過高,30%-40%為宜。底物溶液濃度對顯色背景的影響：1.5mg/mL的底物濃度較為合適假陽性結果的排除將改進的TCL生物自顯影方法中的乙酸-萘酯溶液換成-萘酚溶液進行實驗,排除由于天然產物阻止-萘酚和快藍鹽B反應產

7、生的假陽性結果,提高方法的準確率1、將所用酶溶液的濃度從6.67U/mL降低到1.0U/mL,同時降低了底物和顯 色劑的用量,從而大大降低了實驗所需費用。2、將原方法的檢測限至少降低了兩個數量級,這對發(fā)現植物中微量的AChE 非常有利。3、優(yōu)化了顯色背景,從而使抑制劑斑點更容易被觀察到。4、將改進的生物自顯影方法中的乙酸-萘酯溶液換成-萘酚溶液進行實驗, 排除由于TCL天然產物阻止-萘酚和快藍鹽B反應產生的假陽性結果, 提高 方法的準確率。 通過一系列的改進,此薄層色譜生物自顯影方法已經成為一種高通量、低花費、便于大范圍推廣的跟蹤分離天然的方法。一、實驗材料二、儀器與試劑三、實驗步驟一、實驗材

8、料： 天南星科植物石菖蒲的干燥根莖二、實驗儀器與試劑： 旋轉蒸發(fā)儀 薄層板 乙醇 三、實驗步驟：醇提物制備 稱取石菖蒲粉末50g,加入500mL乙醇熱回流提取1h,將提取液倒出,加500mL乙醇再次回流提取,兩次的提取液合并濃縮至干的醇提物?；钚詼y定 溶液配制： 底物AChE溶液的配制： AChE(500U)溶解于500mL Tris-HCL緩沖液(pH=7.8),加入500mgBSA(牛 血清白蛋白)以保持酶溶液的穩(wěn)定,此溶液可在4保持活性達6個月。150mg乙酸-萘酯溶解于40mL無水乙醇中,再用蒸餾水定容至100mL配成溶液（1.5mg/mL） 2.快藍鹽B溶液配制： 50mg快藍鹽B溶解于100mL蒸餾水中配成溶液（0.5mg/mL）點樣與顯色 首先,將待測樣品點于薄層板一端,用合適的溶劑系統(tǒng)展開,然后用吹風機將板子完全吹干,不能殘留任何有機溶劑。噴1.0U/mLAChE溶液,冷風快速吹至板子上沒有液體流動,再噴40%乙醇配的1.5mg/mL乙酸-萘酯溶液,也快速吹至板子上無浮液。在37恒溫水浴熱板上放置一套培養(yǎng)皿,皿底放少