第七章_細(xì)胞融合及應(yīng)用

1、第七章第七章 細(xì)胞融合與應(yīng)用細(xì)胞融合與應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞融合概述細(xì)胞融合概述細(xì)胞融合（細(xì)胞融合（cell fusion)cell fusion)，又稱體細(xì)胞雜交（somatic hybridiazation），是指兩個(gè)或更多個(gè)相同或不同細(xì)胞通過(guò)膜 融合形成單個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。一、細(xì)胞融合的定義一、細(xì)胞融合的定義uMuller于1838年觀察到脊椎動(dòng)的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。uVirchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。uLuginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。uLange于1875年第一個(gè)觀察到脊椎動(dòng)物

2、（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過(guò)程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無(wú)脊椎動(dòng)中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。u1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒具有觸發(fā)動(dòng)物細(xì)胞融合的效應(yīng)。u1974年華裔加拿大學(xué)者高國(guó)楠?jiǎng)?chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。u20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。二、細(xì)胞融合研究歷史二、細(xì)胞融合研究歷史幾種細(xì)胞融合成功的例子幾種細(xì)胞融合成功的例子植物融合細(xì)胞成長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比植物融合細(xì)胞成長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)比, ,右瓶為地面

3、融合的右瓶為地面融合的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞 動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)使用的小白鼠 三、動(dòng)植物細(xì)胞的融合過(guò)程三、動(dòng)植物細(xì)胞的融合過(guò)程植植物物細(xì)細(xì)胞胞融融合合過(guò)過(guò)程程人人造造小小鼠鼠培培育育過(guò)過(guò)程程示示意意圖圖四、細(xì)胞融合的意義四、細(xì)胞融合的意義u理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對(duì)于種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。u融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。u體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過(guò)程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可

4、發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。u淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞融合的基本原理細(xì)胞融合的基本原理顯微鏡下細(xì)胞融合過(guò)程顯微鏡下細(xì)胞融合過(guò)程融合過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過(guò)程圖解融合過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過(guò)程圖解第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞融合的常用方法細(xì)胞融合的常用方法一、仙臺(tái)病毒法一、仙臺(tái)病毒法仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個(gè)階段：兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4條件下病毒附著在細(xì)胞 膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚；在37中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一

5、8.2；細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需Ca2+和ATP；融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP 。病毒法的主要步驟病毒法的主要步驟1. 兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；2. 通過(guò)病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；3. 兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體；4. 進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖用滅活的病毒誘導(dǎo)的動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 u聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。uPEG濃度以W/W；如將

6、10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培養(yǎng)液為1g重)，即成50PEG溶液。uPEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細(xì)胞。uPEG溶液在pH6.0時(shí)細(xì)胞融合率最高。 u優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。二、聚乙二醇（二、聚乙二醇（PEG）法）法聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過(guò)程）法細(xì)胞融合過(guò)程PEG的作用機(jī)理： Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融

7、合；另外，PEG能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。其缺點(diǎn)是融合過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害。 （1）將兩種不同親本細(xì)胞各5l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；（4）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個(gè)直徑60mm平皿，每個(gè)平皿加培養(yǎng)液至 5ml，37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）624小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法細(xì)胞融

8、合步驟）法細(xì)胞融合步驟PEGPEG誘導(dǎo)的細(xì)胞融合過(guò)程示意圖誘導(dǎo)的細(xì)胞融合過(guò)程示意圖 三、電融合法三、電融合法 電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：電融合法的優(yōu)點(diǎn)：u融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害小；u裝置精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程；u免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后，電流即通過(guò)原生質(zhì)體而不是通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極

9、子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。 電融合法的基本過(guò)程電融合法的基本過(guò)程電融合誘導(dǎo)法原理示意圖電融合誘導(dǎo)法原理示意圖第三節(jié)第三節(jié) 雜種細(xì)胞的篩選雜種細(xì)胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：以下幾種類型：u異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。u同核細(xì)胞：兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。u多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。u基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選u基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選u由溫度敏感

10、型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選u具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選常用的雜種細(xì)胞篩選方法常用的雜種細(xì)胞篩選方法一、何謂單克隆抗體？一、何謂單克隆抗體？應(yīng)用應(yīng)用1 1：細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體：細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體只針對(duì)某一抗原決定簇的抗體分子稱為單克隆抗體。T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞：即胸腺依賴淋巴細(xì)胞（thymus dependent lymphocyte）。亦可簡(jiǎn)稱T細(xì)胞。來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞（胚胎期則來(lái)源于卵黃囊和肝）。目前認(rèn)為，在人體胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干細(xì)胞或前T細(xì)胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細(xì)胞。成

11、熟的T細(xì)胞經(jīng)血流分布至外周免疫器官的胸腺依賴區(qū)定居，并可經(jīng)淋巴管、外周血和組織液等進(jìn)行再循環(huán)，發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)等功能。T細(xì)胞的再循環(huán)有利于廣泛接觸進(jìn)入體內(nèi)的抗原物質(zhì)，加強(qiáng)免疫應(yīng)答，較長(zhǎng)期保持免疫記憶。T細(xì)胞的細(xì)胞膜上有許多不同的標(biāo)志，主要是表面抗原和表面受體。這些表面標(biāo)志都是結(jié)合在細(xì)胞膜上的巨蛋白分子。人類免疫系統(tǒng)的介紹人類免疫系統(tǒng)的介紹 外分泌淋巴系統(tǒng)：呼吸道和生殖泌尿系統(tǒng)外分泌淋巴系統(tǒng)：呼吸道和生殖泌尿系統(tǒng)內(nèi)分泌淋巴系統(tǒng)：胸腺、骨髓、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)等內(nèi)分泌淋巴系統(tǒng)：胸腺、骨髓、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)等B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞：來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞。在禽類是在法氏囊內(nèi)發(fā)育生成，故又稱囊

12、依賴淋巴細(xì)胞（bursa dependent lymphocyte）/骨髓依賴性淋巴細(xì)胞簡(jiǎn)稱B細(xì)胞，是由骨髓中的造血干細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái)。與T淋巴細(xì)胞相比，它的體積略大。這種淋巴細(xì)胞受抗原刺激后，會(huì)增殖分化出大量漿細(xì)胞。漿細(xì)胞可合成和分泌抗體并在血液中循環(huán)。成熟的B細(xì)胞經(jīng)外周血遷出，進(jìn)入脾臟、淋巴結(jié)，主要分布于脾小結(jié)、脾索及淋巴小結(jié)、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小結(jié)中，受抗原刺激后，分化增殖為漿細(xì)胞，合成抗體，發(fā)揮體液免疫的功能。B細(xì)胞在骨髓和集合淋巴結(jié)中的數(shù)量較T細(xì)胞多，在血液和淋巴結(jié)中的數(shù)量比T細(xì)胞少，在胸導(dǎo)管中則更少，僅少數(shù)參加再循環(huán)。B細(xì)胞的細(xì)胞膜上有許多不同的標(biāo)志，主要是表面抗原及表面受

13、體。這些表面標(biāo)志都是結(jié)合在細(xì)胞膜上的巨蛋白分子。B1細(xì)胞為T細(xì)胞非依賴性細(xì)胞。B2為T細(xì)胞依賴性細(xì)胞。B細(xì)胞在體內(nèi)存活的時(shí)間較短，僅數(shù)天至數(shù)周，但其記憶細(xì)胞在體內(nèi)可長(zhǎng)期存在。 B細(xì)胞淋巴瘤是一種最常見(jiàn)的淋巴細(xì)胞白血病，有關(guān)這種疾病的研究不斷涌現(xiàn)。 單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myeloma cell)與經(jīng)特定抗原免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridoma cell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無(wú)限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridom

14、a technology ）。Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein 免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)單克隆抗體：?jiǎn)慰寺】贵w：1984 Nobel二、雜交瘤技術(shù)的基本原理二、雜交瘤技術(shù)的基本原理三、雜交瘤細(xì)胞的制備三、雜交瘤細(xì)胞的制備（一）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基（一）骨髓瘤細(xì)胞選擇及選擇性培養(yǎng)基骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體骨髓瘤細(xì)胞本身不能分泌抗體選擇次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型選擇次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（am

15、inopterin， A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine， T）次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（二）免疫小鼠（二）免疫小鼠 免疫程序是取68周齡BalbC雌鼠，基礎(chǔ)免疫2周，靜脈再加強(qiáng)免疫一次，35天后用于融合。免疫時(shí)是否采用佐劑和事先處理抗原，要依抗原性的強(qiáng)弱而定。一般來(lái)講可溶性抗原用完全佐劑效果較好。抗原量同樣與抗原強(qiáng)弱有關(guān)，以IgG為例，第一次為l00 g，第二次為50 g，免疫途徑第一次可經(jīng)腹腔注射。對(duì)于細(xì)胞性抗原不用佐劑，每次腹腔注射1l06一1107。（三）脾細(xì)胞的制

16、備（三）脾細(xì)胞的制備(1)引頸處死小鼠，用酒精消毒體表；(2)無(wú)菌條件下取出脾臟，剃除結(jié)締組織和脂肪，用5ml無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗一次；(3)把脾臟置于已消毒的90一100目不銹鋼網(wǎng)或尼龍紗網(wǎng)中；(4)在脾中部切開(kāi)一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗，令細(xì)胞通過(guò)紗網(wǎng)，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內(nèi)注入3ml無(wú)血清培養(yǎng)液，反復(fù)抽吸數(shù)次方法獲取細(xì)胞，再制成細(xì)胞懸液亦可；(5)把細(xì)胞懸液注入50ml離心管中，加l0一20ml培養(yǎng)液：輕輕吹打數(shù)次，室溫中置5分鐘；(6)離心(800一1000轉(zhuǎn)分)計(jì)數(shù)、備用。（四）細(xì)胞準(zhǔn)備（四）細(xì)胞準(zhǔn)備（1）收集骨髓瘤細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次(37)

17、，計(jì)數(shù)活力細(xì)胞(不少于90)；（2）收集小鼠脾細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次(37)，并計(jì)細(xì)胞數(shù)和測(cè)定活力細(xì)胞；（3）按1：5或1：10混合脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上清。（五）細(xì)胞融合（五）細(xì)胞融合(1)將1ml 40的PEG液一滴滴加入列細(xì)胞團(tuán)中，在60秒內(nèi)加完，同時(shí)并不斷輕微轉(zhuǎn)動(dòng)離心管或用手指輕彈離心管；(2)在不斷轉(zhuǎn)動(dòng)離心管中加1ml無(wú)血清培養(yǎng)液，60秒鐘內(nèi)加完；(3)于5分鐘內(nèi)慢慢加完20ml無(wú)血清培養(yǎng)液；此時(shí)細(xì)胞對(duì)機(jī)械損傷非常敏感，(4)離心(800轉(zhuǎn)分，8分鐘)，去上清，用完全培養(yǎng)液10ml懸浮，輕輕混勻；(5)取96孔板，每孔加50l；(6)取等體積細(xì)

18、胞懸液，向另一96孔板中加50P1；(7)送入5CO2，溫箱中37培養(yǎng)，24小時(shí)后更換成HAT選擇性培養(yǎng)掖。（六）融合后細(xì)胞培養(yǎng)（六）融合后細(xì)胞培養(yǎng)(1)融合后710天用HAT培養(yǎng)液半量換液(留一半舊的加一半新的) 后每隔23天半量換液一次；(2)兩周后可改用HA培養(yǎng)液半量換液，或仍用HAT培養(yǎng)液；(3)23周后出現(xiàn)雜交細(xì)胞集落，細(xì)胞個(gè)大、圓且透明；(4)待集落增殖生長(zhǎng)至13孔時(shí)，應(yīng)進(jìn)行抗體檢測(cè)。HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)基次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin， A）胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine， T）次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖

19、激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（七）抗體檢測(cè)（七）抗體檢測(cè)免疫熒光試驗(yàn)放射免疫試驗(yàn)(RIA)聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)（八）單克隆抗體的大量制備（八）單克隆抗體的大量制備體內(nèi)接種法體內(nèi)接種法體外培養(yǎng)法體外培養(yǎng)法血清法血清法腹水法腹水法傳統(tǒng)培養(yǎng)法傳統(tǒng)培養(yǎng)法生物反應(yīng)器培養(yǎng)法生物反應(yīng)器培養(yǎng)法四、單克隆抗體的應(yīng)用四、單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病 診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成 本，同時(shí)也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動(dòng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不 斷發(fā)展。 五、五、 人源單克隆抗體人源單克隆抗體為什么制備人源單克隆抗