crispr-cas基因編輯技術(shù)原理與應(yīng)用講解學(xué)習(xí)

1、crispr-cas基因編輯技術(shù)原理與應(yīng)用LOREM IPSUM DOLORLorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.目錄 發(fā)現(xiàn)原理應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)發(fā)展前景CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)發(fā)現(xiàn)2013年2月發(fā)表在Science雜志上的兩篇文章發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)能在293T,K562等多種細(xì)胞中進(jìn)行有效的靶向酶切,非同源末端連接同源重組效率約在在3-25%之間,與被Science雜志評(píng)為2012年十大科學(xué)突破之一的TALEN技術(shù)的酶切效果相當(dāng)?？捎糜诰庉嬋祟?lèi)基因組。發(fā)現(xiàn)原理CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過(guò)將入侵噬菌體

2、和質(zhì)粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相應(yīng)的 CRISPR RNAs(crRNAs)來(lái)指導(dǎo)同源序列的降解，從而提供免疫性。CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 來(lái)識(shí)別并剪切DNA以降解外來(lái)核酸分子。原理示意圖RNA指導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因剪切系統(tǒng)利用CRISPRCas進(jìn)行基因組工程，圖中不同顏色的剪刀代表著不同的Cas9酶 用CRISPR/Cas技術(shù)繞過(guò)了胚胎干細(xì)胞操作過(guò)程,可快速而有效地建立攜帶多個(gè)基因突變的小鼠。因其不依賴在胚胎干細(xì)胞上操作,可用于多生物細(xì)胞的基因操作。模型生物的建立也不再局限于小鼠及少數(shù)大鼠中,任何可進(jìn)行胚胎操作的物種都能成為基因組工程的目標(biāo)。

3、應(yīng)用應(yīng)用Rudolf Jaenisch教授實(shí)驗(yàn)室采用CRISPR/Cas技術(shù)繞過(guò)了胚胎干細(xì)胞操作過(guò)程，可快速而有效地建立攜帶多個(gè)基因突變的小鼠。這是CRISPR/Cas技術(shù)首次被用于多細(xì)胞生物的基因操作。應(yīng)用 。基因編輯功能應(yīng)用疾病治療方向應(yīng)用疾病模式動(dòng)物疾病模式動(dòng)物 科學(xué)家們一直改變與特定疾病相關(guān)的基因來(lái)用小鼠或其他模型動(dòng)物建立相應(yīng)的疾病模型。研究者可以應(yīng)用這些疾病模型研究疾病的發(fā)病機(jī)制,再現(xiàn)疾病發(fā)生過(guò)程;也可用于篩選有效治療藥物,或通過(guò)研究特異的表面分子、信號(hào)通路等開(kāi)發(fā)新的靶向治療藥物等。疾病模式動(dòng)物傳統(tǒng)方式缺 陷用特定的手段將目的DNA片段插入到小鼠胚胎干細(xì)胞中,篩選出成功修飾的胚胎干細(xì)

4、胞,應(yīng)用顯微操作技術(shù)將其移入到早期胚胎(即囊庇)中,將改造后的臟胎移植到假孕母鼠中,再自生出的小鼠篩選疾病模型。成本高,應(yīng)用的物種有限,操縱的基因亦有限?；蚓庉嫻δ軕?yīng)用 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯功能主要應(yīng)用于在不同物種的基因組產(chǎn)生需要的等位基因突變,來(lái)研究基因功能或建立疾病模型。 如果CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯功能如果真如研究者報(bào)道那樣強(qiáng)大的話，那該技術(shù)在先天性突變或獲得突變所致疾病的修復(fù)治療中將有巨大的潛在價(jià)值。這一點(diǎn)還有待研究。疾病治療方向應(yīng)用以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)在一系列基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域都展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病。

5、CRISPR/Cas9在多種類(lèi)型的細(xì)胞和組織中都具有高效精確的基因編輯能力，在CAR-T、造血干細(xì)胞等體外治療手段中是一個(gè)非常理想的操作平臺(tái)，在體內(nèi)也可適用。CRISPR/Cas技術(shù)靈魂人物Feng Zhang（張鋒）MIT麥戈文腦研究所（McGovernInstitute for Brain Research）助理教授Feng Zhang獲得瓦利基金青年研究家獎(jiǎng)（Vallee Foundation Young Investigator Award）。Feng Zhang目前的研究方向是設(shè)計(jì)新的分子工具來(lái)操控活體大腦，他同時(shí)也是布羅德研究所（Broad Institute）的核心成員。“現(xiàn)在，

6、人們可以用這一技術(shù)在活細(xì)胞中有效啟動(dòng)任何基因。這個(gè)系統(tǒng)可以讓科學(xué)家們更簡(jiǎn)便地研究不同基因的功能?！备脑旌蟮腃RISPR技術(shù)，可以快速對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行功能篩選，幫助人們鑒定涉及特定疾病的基因。張鋒等人在這項(xiàng)研究中就鑒定了讓黑色素瘤細(xì)胞抵抗癌癥藥物的幾個(gè)基因?；蚯贸乃姆N方法 1234鋅指核酸酶鋅指核酸酶(ZFN)ES 細(xì)胞打靶細(xì)胞打靶類(lèi)轉(zhuǎn)錄活化因子核酸酶類(lèi)轉(zhuǎn)錄活化因子核酸酶(TALEN)CRISPR/Cas基因編輯技術(shù) 鋅指核酸酶鋅指核酸酶(ZFN)010203構(gòu)成：鋅指核糖核酸酶（ZFN） 由一個(gè) DNA 識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。作用：增強(qiáng)線蟲(chóng)的同源重組前景：ZFN技術(shù)亦具有潛在

7、的臨床應(yīng)用前景。04缺陷：1、不能預(yù)期引入的ZFN蛋白是 不是會(huì)引起免疫系統(tǒng)的進(jìn)攻。 2、直接體內(nèi)注入基因的效率低。 3、在細(xì)胞內(nèi)精確度難以預(yù)估。定義基因打靶是指通過(guò)DNA定點(diǎn)同源重組，改變基因組中的某一特定基因，從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能。 ES 細(xì)胞細(xì)胞打靶打靶原理獲得ES細(xì)胞系，用同源重組技術(shù)獲得帶有預(yù)先設(shè)計(jì)突變的中靶ES細(xì)胞。通過(guò)顯微注射或者胚胎融合將經(jīng)過(guò)遺傳修飾的ES細(xì)胞引入受體胚胎內(nèi)。ES細(xì)胞仍然保持分化的全能性，可發(fā)育為嵌合體動(dòng)物的生殖細(xì)胞，使修飾過(guò)的遺傳信息經(jīng)生殖系遺傳。獲得的突變動(dòng)物提供了一個(gè)特殊的研究體系，使他們可以在生物活體中研究特定基因的功能。應(yīng)用基因打靶技術(shù)在基

8、因功能研究中的應(yīng)用、研制人類(lèi)疾病動(dòng)物模型、改良動(dòng)物品系和研制動(dòng)物反應(yīng)器等。類(lèi)轉(zhuǎn)錄活化類(lèi)轉(zhuǎn)錄活化因子核酸酶因子核酸酶(TALEN)01020304優(yōu)點(diǎn)：設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)單，特異性更高。缺點(diǎn)：具有一定細(xì)胞毒性，模塊組裝過(guò)程繁瑣，一般需要求助于外包公司應(yīng)用：基于TALE的基因組編輯技術(shù)已經(jīng)被廣泛作用于基因敲除、敲入、轉(zhuǎn)錄激活等。簡(jiǎn)介;TALENs是一種可靶向修飾特異DNA序列的酶，它借助于TAL效應(yīng)子一種由植物細(xì)菌分泌的天然蛋白來(lái)識(shí)別特異性DNA堿基對(duì)。利用CRISPR/Cas技術(shù)構(gòu)建基因敲出小鼠的效率非常高，可以非常高效率地在四個(gè)位點(diǎn)上對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行敲出，效率達(dá)到了80%左右。如果利用TALENT技術(shù)，單

9、基因敲出的效率只有30%。傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過(guò)打靶載體構(gòu)建、ES細(xì)胞篩選、嵌合體小鼠選育等一系列步驟，不僅流程繁瑣、技術(shù)要求很高，而且費(fèi)用大、耗時(shí)較長(zhǎng)，成功率受到多方面因素的限制。其他技術(shù)的不足方法靶標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建基因下調(diào)基因敲除基因定點(diǎn)突變或多點(diǎn)突變基因組改變遺傳密碼子改變遺傳性RNAi(siRNA,shRNA)mRNA（轉(zhuǎn)錄水平）簡(jiǎn)單 yesNONONOsiRNA：瞬轉(zhuǎn) ；shRNA:可借助慢病毒實(shí)現(xiàn)遺傳性CRISPRDNA序列（基因組水平）簡(jiǎn)單 yesyesyesyesyesTALENDNA序列（基因組水平）復(fù)雜 yesyesyesyesyes操作簡(jiǎn)單，靶向精確性更高，成本低可對(duì)靶基因

10、單個(gè)位點(diǎn)或多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)敲除可同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行敲除是由RNA調(diào)控的對(duì)DNA的修飾，其基因修飾可遺傳可應(yīng)用于任何物種擁有CRISPR/Cas9腺病毒/慢病毒系統(tǒng)，對(duì)分裂期和非分裂期細(xì)胞均有感染作用。優(yōu)點(diǎn)更容易得到純合子突變體缺點(diǎn)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因和基因打靶技術(shù)，由于技術(shù)穩(wěn)定成熟，可以對(duì)小鼠和大鼠的基因組序列進(jìn)行各種修飾，仍將是模式動(dòng)物的構(gòu)建的主要技術(shù)。該系統(tǒng)是否有脫靶效應(yīng)尚需進(jìn)一步的研究缺點(diǎn)CRISPR-Cas技術(shù)尤其是CRISPR-Cas9作為基因編輯的核心技術(shù)，它仍然是一項(xiàng)非常新穎的技術(shù)，除了存在“脫靶”的主要問(wèn)題外，還有許多的技術(shù)難點(diǎn)尚未突破，尤其是臨床應(yīng)用的有效性和安全性依然是科學(xué)家關(guān)注和爭(zhēng)

11、論的焦點(diǎn)。進(jìn)展 010203040506細(xì)菌，哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的定點(diǎn)突變多基因 打靶斑馬魚(yú)擬南芥靶序列互補(bǔ)1 隨著 CISP/Cas 技術(shù)的快速發(fā)展,它已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、人類(lèi)胚胎干細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、釀酒酵母、線蟲(chóng)、果蠅和農(nóng)作物等的基因研究，并具有操作簡(jiǎn)單、快速、靶向精確性高、可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)敲除等特點(diǎn)。在細(xì)菌研究方面，確定了副溶血性弧菌的 6 個(gè)不同的 CISP序列類(lèi)型，同時(shí) CISP 序列類(lèi)型被認(rèn)為與毒力因子測(cè)試和MLST 基因型明顯相關(guān)。 進(jìn)展2 在斑馬魚(yú)研究方面，通過(guò)注射兩個(gè)簡(jiǎn)單的體外合成的組件(即使用一個(gè)密碼子優(yōu)化的Cas9 和單鏈向?qū)?sgNA)到單細(xì)胞期胚胎中，使目標(biāo)

12、基因突變。這種靈活的基因失活的方法為斑馬魚(yú)基因功能和基因相互作用提供了一個(gè)有效的方式。進(jìn)展 3 干細(xì)胞中的定點(diǎn)突變，包括引進(jìn)或疾病患者特異性突變模型的修正。然而，在人類(lèi)胚胎干細(xì)胞中將一個(gè)報(bào)告基因整合成一種內(nèi)源性基因還需要漫長(zhǎng)艱苦的兩步:首先要正確識(shí)別目標(biāo)然后要排除耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，tracrNA 和crNA 分開(kāi)單獨(dú)表達(dá)，還能夠提高切割的效率。這個(gè)發(fā)現(xiàn)讓大家意識(shí)到:可以通過(guò)進(jìn)一步修改 sgNA 的設(shè)計(jì)方案，讓它與雙 NA 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)更加相近，就能夠進(jìn)一步提高 Cas9 系統(tǒng)的基因組編輯效率。進(jìn)展4 在擬南芥研究方面，利用CISP/Cas 系統(tǒng)對(duì)分裂組織有針對(duì)性地定點(diǎn)誘變產(chǎn)生遺傳突變，結(jié)果表明

13、，在擬南芥中使用 CISP/Cas系統(tǒng)為 RNA 引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶(RGEN)定點(diǎn)突變分裂組織提供了一種有效的遺傳基因工程的方法。進(jìn)展進(jìn)展5 CRISPR/Cas 的 打 靶 效 率 比 較 高，最 高 可 達(dá) 80% ，且靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)靈活、方便，載體構(gòu)建簡(jiǎn)單;CRISPR/Cas 技術(shù)已經(jīng)做到了降低脫靶的幾率，降低細(xì)胞毒性，但這并不是代表不會(huì)產(chǎn)生; 此外較于 ZFN與 TALEN，CRISPR/Cas 的設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單、廉價(jià)，一般普通的試驗(yàn)也可自行操作; 現(xiàn)在的技術(shù)已經(jīng)做到，可使CRISPR/Cas 同時(shí)打靶多個(gè)基因，且每多一個(gè)靶位點(diǎn)只需多一個(gè) gRNA 質(zhì)粒。1. 目前 CRISPR-Cas9

14、 系統(tǒng)中仍有一系列有待解決與發(fā)展的問(wèn)題，例如如何突破 PAM 序列的限制、如何建立對(duì) Cas9 特異性(脫靶效應(yīng))的全面評(píng)價(jià)體系、如何構(gòu)建不同物種中可通用的 Cas9 與 sgRNA 導(dǎo)入與表達(dá)系統(tǒng)以及如何更有效的激活同源重組修復(fù)等。但是基于CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的迅猛發(fā)展速度，我們可以預(yù)見(jiàn)，隨著相關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)研究的深入，CISP-Cas9系統(tǒng)將在基因組水平上的基因改造、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與表觀遺傳調(diào)控等不同層次上得到更廣闊的發(fā)展與應(yīng)用。前景2. 自 Cas9 被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究人員一直把它作為一把有潛力的鑰匙來(lái)開(kāi)啟遺傳疾病的新療法，并且利用NA 導(dǎo)向的 Cas9 核酸酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和斑馬魚(yú)胚胎中進(jìn)

15、行基因組編輯。研究發(fā)現(xiàn)，Cas9/gNA 有效誘導(dǎo)了生成的體細(xì)胞中 etsrp 或 gata5 的雙等位基因轉(zhuǎn)換。研究者通過(guò) Cas9/gNA 系統(tǒng)的誘導(dǎo)在斑馬魚(yú)胚胎中獲得了位點(diǎn)特異性的 mloxP 序列插入。因此，Cas9 核酸酶的功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于目前所了解到的，加大對(duì) Cas9 核酸酶的特異性研究并深入了解，有助于生命科學(xué)的研究。前景3. 外源性基因的插入會(huì)引起很多負(fù)面影響和意外突變，成為研究者們必須解決的問(wèn)題。而 CISP/Cas 系統(tǒng)的深入研究將是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵。在人類(lèi)疾病的研究上，癌癥基因的敲除、艾滋病毒等治療，CISP/Cas9 技術(shù)擁有很大優(yōu)勢(shì)，這也將成為未來(lái)的研究趨勢(shì)。同時(shí)也將

16、為人類(lèi)不可戰(zhàn)勝的疾病提供了更好的治療方法前景4. 通過(guò)目前對(duì) CRISPR/Cas 系統(tǒng)研究，不管是在細(xì)胞中還是在動(dòng)物胚胎中已經(jīng)能夠?qū)蜻M(jìn)行敲除或是修飾來(lái)優(yōu)化品種或者治療疾病 。為了對(duì)遺傳缺陷進(jìn)行糾正或刪除，將 Cas9 系統(tǒng)和相應(yīng)的靶向致病基因的 sgRNA 載體導(dǎo)入機(jī)體，這種技術(shù)在未來(lái)較短的時(shí)間內(nèi)會(huì)成為一種成熟的非常有效的治療手段。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在疾病治療 、基礎(chǔ)理論研究和農(nóng)牧漁業(yè)等領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛研究，這將對(duì)分子生物學(xué)研究和基因治療領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。前景5. 許多研究利用這種技術(shù)為各種人類(lèi)疾病構(gòu)建出動(dòng)物模型，已經(jīng)取得重大成果。為了擴(kuò)大這項(xiàng)技術(shù)的使用范圍，研究者們將 CISP/Cas9 系統(tǒng)與其他的基因組改造技術(shù)(如巨核酶技術(shù)、鋅指核酶技術(shù)及 TALEN 技術(shù)等)進(jìn)行更加深入的比較研究。研究表明，CISP 系統(tǒng)還參與細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的調(diào)控，這說(shuō)明Cas 蛋白和 CISP NA 的功能已經(jīng)不只能局限于免疫抑制，對(duì)于它的研究還需要更加深入。同時(shí)它也呈現(xiàn)出越來(lái)越多的可能性和不可知性，這都需要研究者去發(fā)現(xiàn)、利用。前景6. 隨著基因測(cè)序技術(shù)的不斷成熟，3 種技術(shù)不斷完善。ZFN 作為第一代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)，敲開(kāi)了基因