第二章微生物發(fā)酵制藥常用菌種的分離

1、微生物發(fā)酵制藥常用菌種的分離微生物發(fā)酵制藥常用菌種的分離n工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)水平的高低取決于生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)水平的高低取決于生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和后提取工藝三個(gè)因素。工藝和后提取工藝三個(gè)因素。n擁有良好的生產(chǎn)菌種是提高生產(chǎn)水平的前提，除擁有良好的生產(chǎn)菌種是提高生產(chǎn)水平的前提，除了提高產(chǎn)量，菌種選育還能提高產(chǎn)品質(zhì)量、改善了提高產(chǎn)量，菌種選育還能提高產(chǎn)品質(zhì)量、改善加工工藝和開發(fā)新產(chǎn)品。加工工藝和開發(fā)新產(chǎn)品。n在科學(xué)研究中通過菌種選育還可以了解菌種的遺在科學(xué)研究中通過菌種選育還可以了解菌種的遺傳學(xué)性質(zhì)，因此，在生產(chǎn)和科研中，菌種選育都傳學(xué)性質(zhì)，因此，在生產(chǎn)和科研中，菌種選育都具有重要意義。具有重要

2、意義。n知識(shí)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)1、了解工業(yè)發(fā)酵制藥常見微生物及其代謝物。、了解工業(yè)發(fā)酵制藥常見微生物及其代謝物。2、了解各種菌種保藏原理以及主要菌種保藏機(jī)構(gòu)。、了解各種菌種保藏原理以及主要菌種保藏機(jī)構(gòu)。3、理解次級(jí)代謝產(chǎn)物與初級(jí)代謝產(chǎn)物的關(guān)系。、理解次級(jí)代謝產(chǎn)物與初級(jí)代謝產(chǎn)物的關(guān)系。4、理解工業(yè)發(fā)酵對(duì)生產(chǎn)菌種的要求及菌種來源。、理解工業(yè)發(fā)酵對(duì)生產(chǎn)菌種的要求及菌種來源。5、掌握自然選育、誘變育種的操作要點(diǎn)。、掌握自然選育、誘變育種的操作要點(diǎn)。6、掌握菌種保藏中常用方法的操作要點(diǎn)。、掌握菌種保藏中常用方法的操作要點(diǎn)。n能力目標(biāo)能力目標(biāo)1、能利用自然選育技術(shù)對(duì)生產(chǎn)菌、能利用自然選育技術(shù)對(duì)生產(chǎn)菌種進(jìn)行純種分

3、離或復(fù)壯。種進(jìn)行純種分離或復(fù)壯。2、能利用誘變育種技術(shù)對(duì)生產(chǎn)菌、能利用誘變育種技術(shù)對(duì)生產(chǎn)菌種進(jìn)行紫外誘變或化學(xué)誘變選育。種進(jìn)行紫外誘變或化學(xué)誘變選育。3、能對(duì)生產(chǎn)菌種進(jìn)行合理保藏。、能對(duì)生產(chǎn)菌種進(jìn)行合理保藏。第一節(jié)第一節(jié) 工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種一、工業(yè)發(fā)酵微生物及其代謝產(chǎn)物一、工業(yè)發(fā)酵微生物及其代謝產(chǎn)物（一）微生物代謝產(chǎn)物的類型（一）微生物代謝產(chǎn)物的類型 1、初級(jí)代謝產(chǎn)物、初級(jí)代謝產(chǎn)物 2、次級(jí)代謝產(chǎn)物、次級(jí)代謝產(chǎn)物 初級(jí)代謝和初級(jí)代謝產(chǎn)物初級(jí)代謝和初級(jí)代謝產(chǎn)物n初級(jí)代謝初級(jí)代謝主要是指把營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為主要是指把營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為機(jī)體結(jié)構(gòu)和生理活性物質(zhì)以及提供能機(jī)體結(jié)構(gòu)和生理活性物質(zhì)以及

4、提供能量的代謝作用。微生物通過初級(jí)代謝量的代謝作用。微生物通過初級(jí)代謝途徑產(chǎn)生自身生長繁殖所必需的代謝途徑產(chǎn)生自身生長繁殖所必需的代謝產(chǎn)物稱之為產(chǎn)物稱之為初級(jí)代謝產(chǎn)物初級(jí)代謝產(chǎn)物。如氨基酸、。如氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、多糖等。核苷酸、蛋白質(zhì)、多糖等。次級(jí)代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)物n次級(jí)代謝次級(jí)代謝是指微生物在一定的生理階段出是指微生物在一定的生理階段出現(xiàn)的一種特殊代謝類型，是某些微生物為現(xiàn)的一種特殊代謝類型，是某些微生物為了避免在代謝過程中某些代謝產(chǎn)物累積造了避免在代謝過程中某些代謝產(chǎn)物累積造成的不利作用而產(chǎn)生的一類有利于生存的成的不利作用而產(chǎn)生的一類有利于生存的代謝類型。代謝類

5、型。次級(jí)代謝產(chǎn)物次級(jí)代謝產(chǎn)物是通過次級(jí)代謝是通過次級(jí)代謝合成的產(chǎn)物，通常在生產(chǎn)后期合成，如抗合成的產(chǎn)物，通常在生產(chǎn)后期合成，如抗生素、色素、激素、毒素等。生素、色素、激素、毒素等。3、次級(jí)代謝產(chǎn)物、次級(jí)代謝產(chǎn)物 和初級(jí)代謝產(chǎn)物的關(guān)系和初級(jí)代謝產(chǎn)物的關(guān)系 對(duì)產(chǎn)生菌的生長繁殖作用不同，對(duì)產(chǎn)生菌的生長繁殖作用不同， 但生物合成途徑是相互關(guān)聯(lián)的，初但生物合成途徑是相互關(guān)聯(lián)的，初級(jí)代謝產(chǎn)生的一些小分子化合物是級(jí)代謝產(chǎn)生的一些小分子化合物是次級(jí)代謝途徑的原料。次級(jí)代謝途徑的原料。n從代謝途徑看，次級(jí)代謝產(chǎn)物是以初級(jí)代謝從代謝途徑看，次級(jí)代謝產(chǎn)物是以初級(jí)代謝產(chǎn)物作為前體衍生出來的。菌體代謝過程中產(chǎn)物作為前體

6、衍生出來的。菌體代謝過程中產(chǎn)生的某些中間產(chǎn)物既可以合成初級(jí)代謝產(chǎn)產(chǎn)生的某些中間產(chǎn)物既可以合成初級(jí)代謝產(chǎn)物，也可以合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物，也可以合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物稱為物稱為“分叉中間體分叉中間體”。n從酶學(xué)關(guān)系看，有些酶具有通用性，此外，從酶學(xué)關(guān)系看，有些酶具有通用性，此外，某些初級(jí)產(chǎn)物對(duì)次級(jí)產(chǎn)代謝有一定調(diào)節(jié)作用。某些初級(jí)產(chǎn)物對(duì)次級(jí)產(chǎn)代謝有一定調(diào)節(jié)作用。n從遺傳控制看，初級(jí)代謝與次級(jí)代謝都受到從遺傳控制看，初級(jí)代謝與次級(jí)代謝都受到核內(nèi)遺傳物質(zhì)的控制，抗生素合成受到核外核內(nèi)遺傳物質(zhì)的控制，抗生素合成受到核外遺傳物質(zhì)質(zhì)粒的控制，稱為遺傳物質(zhì)質(zhì)粒的控制，稱為“質(zhì)粒產(chǎn)物質(zhì)粒產(chǎn)物。 常

7、見微生物常見微生物 1 1、細(xì)菌、細(xì)菌 2 2、放線菌、放線菌 3 3、酵母菌、酵母菌 4 4、霉菌、霉菌 （二）工業(yè)發(fā)酵常見微生物及其代謝產(chǎn)物（二）工業(yè)發(fā)酵常見微生物及其代謝產(chǎn)物1.細(xì)菌（細(xì)菌（bacteria）及其代謝產(chǎn)物）及其代謝產(chǎn)物n醋桿菌屬（醋桿菌屬（Acetobacter）：醋酸、山梨醇）：醋酸、山梨醇n乳桿菌屬（乳桿菌屬（Lactobacillus）：乳酸、乳制品）：乳酸、乳制品n芽孢桿菌屬（芽孢桿菌屬（Bacillus）：丙酮、乙醇、丁醇、）：丙酮、乙醇、丁醇、淀粉酶、蛋白酶、果膠酶淀粉酶、蛋白酶、果膠酶n假單胞菌屬假單胞菌屬（Pseudomonas ）：維生素維生素B12、色

8、素色素n黃單胞菌屬黃單胞菌屬（Xanthomonas）：）：維生素維生素B12、黃原膠黃原膠 2.2.放線菌放線菌（actinomyces）及其代謝產(chǎn)物及其代謝產(chǎn)物主要代謝產(chǎn)物是抗生素主要代謝產(chǎn)物是抗生素（antibiotic） ：鏈：鏈霉素、土霉素、金霉素、卡那霉素等，霉素、土霉素、金霉素、卡那霉素等，此外還用于維生素和酶制劑的生產(chǎn)。此外還用于維生素和酶制劑的生產(chǎn)。 鏈霉菌（鏈霉菌（StreptomycesStreptomyces） 小單孢菌屬（小單孢菌屬（MicromonosporaMicromonospora） 3 3、霉菌、霉菌（mould）及其代謝產(chǎn)物及其代謝產(chǎn)物 （1 1）曲霉屬（

9、）曲霉屬（AspergillusAspergillus） 黑曲霉（黑曲霉（A. nigerA. niger） 米曲霉（米曲霉（A. oryzaeA. oryzae） 黃曲霉（黃曲霉（A. flavusA. flavus） （2 2）青霉屬（）青霉屬（PenicillumPenicillum） （3 3） 根霉屬根霉屬（Rhizopus ） 米根霉米根霉（R. oryzae）華根霉華根霉（R. chinensis） （4 4） 紅曲霉屬紅曲霉屬（Monascus） 霉菌菌落霉菌菌落4 4、酵母（、酵母（yeast）及其代謝產(chǎn)物及其代謝產(chǎn)物1.1.酵母屬（酵母屬（SaccharomycesSacc

10、haromyces） 啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）2. 2. 假絲酵母屬（假絲酵母屬（CandidaCandida） 產(chǎn)朊假絲酵母（產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilisCandida utilis）3. 3. 畢赤酵母屬（畢赤酵母屬（PichiaPichia）含豐富的蛋白質(zhì)、維生素、酶，制造單細(xì)胞含豐富的蛋白質(zhì)、維生素、酶，制造單細(xì)胞蛋白、釀酒蛋白、釀酒1.1.擔(dān)子菌（擔(dān)子菌（basidiomycetesbasidiomycetes） 即菇類（即菇類（mushroommushroom）2. 2. 藻

11、類（藻類（algaalga）5、其它微生物、其它微生物 二、工業(yè)發(fā)酵對(duì)生產(chǎn)菌種的一般要求二、工業(yè)發(fā)酵對(duì)生產(chǎn)菌種的一般要求1.1.原料廉價(jià)，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。原料廉價(jià)，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。2.2.易控制培養(yǎng)條件，糖濃度、易控制培養(yǎng)條件，糖濃度、pHpH、溫度、溶解氧、溫度、溶解氧3.3.生長迅速、產(chǎn)物生成快，發(fā)酵周期較短。生長迅速、產(chǎn)物生成快，發(fā)酵周期較短。4 4、選擇單產(chǎn)高的營養(yǎng)缺陷型突變株或野生菌株、選擇單產(chǎn)高的營養(yǎng)缺陷型突變株或野生菌株5.5.選擇抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)的菌株。選擇抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)的菌株。6.6.不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和不易變異和退化，不產(chǎn)生

12、任何有害物質(zhì)和 毒素。毒素。三、工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種來源三、工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種來源n1、從自然界分離篩選。、從自然界分離篩選。n2、從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得。、從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得。n3、從生產(chǎn)過程中已有菌株篩、從生產(chǎn)過程中已有菌株篩 選發(fā)生正突變的優(yōu)良菌種選發(fā)生正突變的優(yōu)良菌種。 第二節(jié)第二節(jié) 生產(chǎn)菌種的選育生產(chǎn)菌種的選育 發(fā)酵工業(yè)所需優(yōu)良菌種都發(fā)酵工業(yè)所需優(yōu)良菌種都是通過菌種選育獲得的，菌是通過菌種選育獲得的，菌種選育方法主要包括種選育方法主要包括自然選自然選育育、誘變選育誘變選育、雜交育種雜交育種和和基因工程育種基因工程育種。一、自然選育一、自然選育n在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，在生產(chǎn)過程中，不

13、經(jīng)過人工誘變處理，利用菌株的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的利用菌株的自發(fā)突變而進(jìn)行菌種篩選的過程，稱為過程，稱為自然選育自然選育或或自然分離自然分離。n自然選育的菌種來源于自然界、菌種保自然選育的菌種來源于自然界、菌種保藏機(jī)構(gòu)或生產(chǎn)過程，其中從自然界選育藏機(jī)構(gòu)或生產(chǎn)過程，其中從自然界選育菌種過程較為復(fù)雜。菌種過程較為復(fù)雜。自然選育的主要步驟自然選育的主要步驟 1.采樣：采樣：有針對(duì)性地采集樣品有針對(duì)性地采集樣品 2.增殖培養(yǎng)：增殖培養(yǎng)：人為地通過控制養(yǎng)分或人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)數(shù)量上占優(yōu)勢(shì) 3.培養(yǎng)分離：培養(yǎng)分離：利用分離技術(shù)

14、得到純種利用分離技術(shù)得到純種 4.篩選或毒性鑒定：篩選或毒性鑒定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測進(jìn)行生產(chǎn)性能測定和毒性測定定和毒性測定（一）采樣（一）采樣 1 1、采樣地點(diǎn)、采樣地點(diǎn)：以土壤為主，也可以是植：以土壤為主，也可以是植 物、腐敗物品、水域物、腐敗物品、水域 2 2、采樣地點(diǎn)確定方法、采樣地點(diǎn)確定方法： 3 3、采樣方法、采樣方法：去除表層：去除表層5 5厘米左右浮土，厘米左右浮土，取取5-25cm5-25cm處的土樣處的土樣10-25g10-25g，裝入事先準(zhǔn)備，裝入事先準(zhǔn)備好的無菌塑料袋內(nèi)扎好，記錄采樣時(shí)間、好的無菌塑料袋內(nèi)扎好，記錄采樣時(shí)間、地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱以及具體的環(huán)地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、

15、植被名稱以及具體的環(huán)境條件，以備查考，并盡快分離。境條件，以備查考，并盡快分離。（二）富集培養(yǎng)（二）富集培養(yǎng) 由于采集樣品中各種微生物數(shù)量有很大差由于采集樣品中各種微生物數(shù)量有很大差異，要分離的菌種數(shù)量不多時(shí)，就要人為增異，要分離的菌種數(shù)量不多時(shí)，就要人為增加分離的概率，增加該菌種的數(shù)量，稱為加分離的概率，增加該菌種的數(shù)量，稱為富富集培養(yǎng)。集培養(yǎng)。 常用富集培養(yǎng)方法：常用富集培養(yǎng)方法：n （1）控制培養(yǎng)基成分）控制培養(yǎng)基成分n （2）控制培養(yǎng)條件）控制培養(yǎng)條件n （3）抑制不需要的菌類）抑制不需要的菌類（三）（三） 純種分離純種分離（1 1）劃線分離法：簡單、快捷。）劃線分離法：簡單、快捷。

16、（2 2）稀釋分離法：菌落單一均勻。）稀釋分離法：菌落單一均勻。（3 3）組織分離法：適用于高等真菌）組織分離法：適用于高等真菌1、劃線分離法操作步驟、劃線分離法操作步驟接種針先以火焰滅菌法滅菌接種針先以火焰滅菌法滅菌 步驟一輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻 步驟二以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。 步驟三更換一個(gè)新的無菌營養(yǎng)平板更換一個(gè)新的無菌營養(yǎng)平板 步驟四將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營養(yǎng)平板將接種針上的細(xì)菌劃于一個(gè)新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū)上。此為第一菌區(qū) 。步驟五重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法重復(fù)第一步驟，將接

17、種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。區(qū)，如右上圖。步驟七重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。 步驟八重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營養(yǎng)平板，如右上圖。的營養(yǎng)平板，如右上圖。步驟九 在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽（注意不能在皿蓋上標(biāo)簽，以（注意不能在皿蓋上標(biāo)簽

18、，以防混亂）防混亂） ，標(biāo)示好接種日期、，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及培操作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。養(yǎng)基名稱。步驟十步驟十2、稀釋分離法步驟、稀釋分離法步驟 取取1 1克土樣，在火焰旁放入裝有克土樣，在火焰旁放入裝有9999毫克無菌毫克無菌水的錐形瓶內(nèi)，充分搖勻，將菌分散。水的錐形瓶內(nèi)，充分搖勻，將菌分散。 用移液管吸取上述菌懸液用移液管吸取上述菌懸液1 1毫升，放入盛毫升，放入盛有有9 9毫升無菌水的試管中，并進(jìn)一步稀釋成毫升無菌水的試管中，并進(jìn)一步稀釋成10001000倍，即倍，即1010-3-3的菌懸液。按的菌懸液。按1010倍稀釋法連倍稀釋法連續(xù)稀釋到續(xù)稀釋到101

19、0-8-8（每（每1 1次稀釋，都須更換移液次稀釋，都須更換移液管）。管）。 取取3 3支支1 1毫升移液管分別從毫升移液管分別從1010-8-8、1010-7-7、1010-6-6菌懸液中吸取菌懸液中吸取1 1毫升菌懸液，分別注入編號(hào)毫升菌懸液，分別注入編號(hào)1010-8-8、1010-7-7和和1010-6-6的培養(yǎng)皿內(nèi)，同一稀釋液重的培養(yǎng)皿內(nèi)，同一稀釋液重復(fù)做復(fù)做3 3個(gè)培養(yǎng)皿。個(gè)培養(yǎng)皿。n將溫度為將溫度為4550的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入上述各培的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（將培

20、養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28左右），每天觀左右），每天觀察培養(yǎng)基表面有無微生物菌落察培養(yǎng)基表面有無微生物菌落。（稀釋倒平板法）。（稀釋倒平板法）經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上長出菌落，根據(jù)菌經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)后，培養(yǎng)基上長出菌落，根據(jù)菌落特征，初步判斷屬于何種類型的微生物，并在顯落特征，初步判斷屬于何種類型的微生物，并在顯微鏡下檢查，若菌體形態(tài)一致，則可認(rèn)為是初步分微鏡下檢查，若菌體形態(tài)一致，則可認(rèn)為是初步分離到純菌種。離到純菌種。將分離培養(yǎng)所得的純菌種，從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試將分離培養(yǎng)所得的純菌種，從平板培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。需要使用的儀器需要使用的儀器震蕩機(jī)震蕩機(jī)

21、吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液吸取充分均勻后的菌液吸取充分均勻后的菌液 取含有取含有 9mL9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液置入，此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。將菌液置入，此時(shí)試管須做記號(hào)為第一次稀釋。將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻?qū)⒃嚬苡谡鹗帣C(jī)上，使菌液混合均勻 取出試管中的第一次十倍稀釋菌液取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL1mL，加入另一個(gè)新的含加入另一個(gè)新的含9mL9mL無菌水的試管中。無菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。 從最后稀釋菌液中吸取從最后稀釋菌液中吸取 0.1mL0.1

22、mL菌液，菌液，置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。將三角玻璃棒浸于酒精中將三角玻璃棒浸于酒精中 將三角玻璃棒在火焰上燃燒將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒） 使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。數(shù)推算出菌液濃度。 （涂布平板法）（涂布平板法） 純種分離培養(yǎng)條件的控制純種分離培養(yǎng)條件的控制n1、營養(yǎng)成分控制、營養(yǎng)成分控制n2、控制培養(yǎng)基的酸堿度、控制培

23、養(yǎng)基的酸堿度n3、添加抑制劑、添加抑制劑n4、熱處理、熱處理n5、控制培養(yǎng)溫度、控制培養(yǎng)溫度n6、通氣條件控制、通氣條件控制（四）（四） 生產(chǎn)能力的考察生產(chǎn)能力的考察 一般采用兩步法：一般采用兩步法： 初篩：以量為主，包括平板篩選和搖瓶初篩：以量為主，包括平板篩選和搖瓶 發(fā)酵篩選，篩選出少量生產(chǎn)能力發(fā)酵篩選，篩選出少量生產(chǎn)能力 較高的菌株。較高的菌株。 復(fù)篩：以質(zhì)為主，一個(gè)菌株復(fù)篩：以質(zhì)為主，一個(gè)菌株3-53-5個(gè)平行，培個(gè)平行，培養(yǎng)養(yǎng) 后的發(fā)酵液必需采用精確分析方法測后的發(fā)酵液必需采用精確分析方法測 定。復(fù)篩出的菌株作為進(jìn)一步誘變育定。復(fù)篩出的菌株作為進(jìn)一步誘變育 種的出發(fā)菌株。種的出發(fā)菌株

24、。微生物平板選擇分離的方法微生物平板選擇分離的方法n1、變色圈法、變色圈法n2、透明圈法、透明圈法n3、生長圈法、生長圈法n4、抑菌圈法、抑菌圈法變色圈法：變色圈法：n變色圈法：對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，變色圈法：對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí)，用含能被快速鑒別出來。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時(shí)，用含0.2%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對(duì)含微生物樣果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對(duì)含微生物樣品進(jìn)行分離，待菌落長成后，加入品進(jìn)行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果

25、紅溶液剛果紅溶液染色染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會(huì)出現(xiàn)絳紅，具有分解果膠能力的菌落周圍便會(huì)出現(xiàn)絳紅色水解圈。在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加色水解圈。在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán)，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在入溴百里酚藍(lán)，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6.27.6，當(dāng)，當(dāng)pH在在6.2以下時(shí)為黃色，以下時(shí)為黃色，pH7.6以上以上為藍(lán)色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會(huì)變成黃為藍(lán)色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會(huì)變成黃色，可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。色，可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。變色圈法變色圈法變色圈法變色圈法透明圈法n透明圈法：在平

26、板培養(yǎng)基中加入溶解性透明圈法：在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，物的微生物便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較力。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會(huì)在含有底物的選擇性培養(yǎng)酶產(chǎn)生菌都會(huì)在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。基平板上形成肉眼可見的透明圈。 透明圈法透明圈法透明圈法透明圈法透明圈法透明圈法透明圈法透明圈法生長圈法

27、n生長圈法：生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對(duì)應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會(huì)形成一個(gè)混濁的生長圈。如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（如E.coliP264）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。營養(yǎng)缺陷型n營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)過人工誘變或者自然突變失去合成某種營養(yǎng)（氨基酸，維生素，核酸等）的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補(bǔ)充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長，成為營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）。n營養(yǎng)缺陷型是一種生

28、化突變株，它的出現(xiàn)是由基因突變引起的。 生長圈法抑菌圈法抑菌圈法n抑菌圈法：常用于抗生素產(chǎn)生菌的抑菌圈法：常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選，工具菌采用抗生素的敏分離篩選，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會(huì)在該菌落周圍形成工具菌不能生長的該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，很容易被鑒別出來。抑菌圈，很容易被鑒別出來。 抑菌圈法抑菌圈法2課時(shí)結(jié)束 二、誘變育種二、誘變育種 利用各種利用各種誘變劑誘變劑處理微生物細(xì)胞，提處理微生物細(xì)胞，提高基因的隨機(jī)突變頻率，擴(kuò)大變異幅度，高基因的隨機(jī)突變頻率，擴(kuò)大

29、變異幅度，通過一定的篩選方法獲取所需要優(yōu)良菌株通過一定的篩選方法獲取所需要優(yōu)良菌株的過程，稱為的過程，稱為誘變育種誘變育種。誘變劑誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)。：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)。誘變劑誘變劑 物理：紫外線，快中子，射線物理：紫外線，快中子，射線化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍 （一）誘變育種的一般步驟（一）誘變育種的一般步驟（1 1）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液 誘變誘變（2 2）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株，）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株， 選出性能優(yōu)良的正變異株選出性能優(yōu)良的正變異株篩選篩選（二）誘變育種應(yīng)注意的問題（

30、二）誘變育種應(yīng)注意的問題n1、出發(fā)菌株的選擇、出發(fā)菌株的選擇n2、誘變因素的選擇、誘變因素的選擇n3、誘變劑劑量的選擇、誘變劑劑量的選擇n4、單孢子（或單細(xì)胞）懸液的制備、單孢子（或單細(xì)胞）懸液的制備1、出發(fā)菌株的選擇、出發(fā)菌株的選擇 挑選原則：具備特別生產(chǎn)性能和潛挑選原則：具備特別生產(chǎn)性能和潛能、對(duì)誘變劑敏感。變異幅度廣。能、對(duì)誘變劑敏感。變異幅度廣。（1）野生型菌株）野生型菌株（2）生產(chǎn)選育個(gè)高產(chǎn)菌株）生產(chǎn)選育個(gè)高產(chǎn)菌株（3）已經(jīng)誘變過的菌株：復(fù)雜，較）已經(jīng)誘變過的菌株：復(fù)雜，較 易產(chǎn)生負(fù)突變。易產(chǎn)生負(fù)突變。2、誘變因素的選擇、誘變因素的選擇1、物理誘變劑：紫外線（、物理誘變劑：紫外線（U

31、V），伽馬射線），伽馬射線2、化學(xué)誘變劑：硫酸二乙酯，亞硝基胍（、化學(xué)誘變劑：硫酸二乙酯，亞硝基胍（NTG） 1、單一誘變劑處理、單一誘變劑處理 2、復(fù)合誘變劑處理、復(fù)合誘變劑處理誘變劑誘變劑誘變方法誘變方法3、誘變劑劑量的選擇、誘變劑劑量的選擇n誘變劑劑量與致死率有關(guān)，而致死率和誘變劑劑量與致死率有關(guān)，而致死率和誘變率有一定關(guān)系，因此，可用致死率誘變率有一定關(guān)系，因此，可用致死率作為各種誘變劑的相對(duì)劑量，目前誘變作為各種誘變劑的相對(duì)劑量，目前誘變劑處理劑量一般選擇死亡率為劑處理劑量一般選擇死亡率為70-80的劑量，多核細(xì)胞有時(shí)也用的劑量，多核細(xì)胞有時(shí)也用90以上以上的高劑量，可減少回復(fù)突變。

32、的高劑量，可減少回復(fù)突變。 4、單孢子（或單細(xì)胞）、單孢子（或單細(xì)胞） 懸液的制備懸液的制備n誘變育種要求所處理的細(xì)胞必須是處于對(duì)數(shù)生長期同步生長的細(xì)胞，并且是均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液。n菌懸液制備方法：玻璃珠振蕩打散后再用脫脂棉花或?yàn)V紙過濾，細(xì)胞濃度一般控制為：孢子或酵母細(xì)胞106-107個(gè)/mL；放線菌或細(xì)菌108個(gè)/mL，菌懸液一般用0.85的生理鹽水稀釋，化學(xué)誘變劑處理時(shí)用0.1mol/L磷酸緩沖溶液稀釋。（三）常用的物理誘變劑處理方法（三）常用的物理誘變劑處理方法n1、紫外線誘變、紫外線誘變 紫外線誘變一般采用紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，紫外線殺菌燈，波長為波長為253.7nm

33、燈與處理物的距離為燈與處理物的距離為1530cm，照射時(shí)間依菌種而異，一，照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在率控制在7080%為宜。為宜。n被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為108個(gè)個(gè)mL左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106107個(gè)個(gè)mL。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約要求照射液不要太深，約0.51.0cm厚，厚，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使

34、照射均勻。使照射均勻。n由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。紫外誘變的操作步驟紫外誘變的操作步驟（1 1）制備菌懸液）制備菌懸液 將細(xì)菌培養(yǎng)液以將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000r3000rminmin離心離心5min5min，傾，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。將菌懸液放入一巳滅菌水再離心洗滌。將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動(dòng)，的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動(dòng)，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏

35、斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá)一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá)10108 8個(gè)個(gè)mLmL左右，作為待處理菌懸液。左右，作為待處理菌懸液。（2）紫外線照射）紫外線照射 取取2 24m14m1制備的菌液加到直徑制備的菌液加到直徑7cm7cm培培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、置磁力攪拌器上、15W15W紫外線下紫外線下30cm30cm處。處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線在正式照射前，應(yīng)先開紫外線20min20min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正

36、式在攪拌下照射一定時(shí)間。操作均應(yīng)在紅燈下拌下照射一定時(shí)間。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。（3）后培養(yǎng)與稀釋涂布）后培養(yǎng)與稀釋涂布 照射完畢后將菌懸液在適宜溫度照射完畢后將菌懸液在適宜溫度下下暗暗培養(yǎng)培養(yǎng)1-2h1-2h，取未照射的制備，取未照射的制備菌液和照射菌液按一定稀釋度進(jìn)菌液和照射菌液按一定稀釋度進(jìn)行稀釋，然后吸取稀釋液涂平板，行稀釋，然后吸取稀釋液涂平板，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。挑取菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。挑取菌落進(jìn)行篩選。（教材實(shí)訓(xùn)四）篩選。（教材實(shí)訓(xùn)四）2 2、伽馬射線誘變、伽馬射線誘變 常用的微生物誘變輻射源。劑量單常用的微生物誘變輻射源

37、。劑量單位以倫琴（位以倫琴（R R）表示，穿透力強(qiáng)，致死）表示，穿透力強(qiáng)，致死作用比紫外線強(qiáng)烈，不宜反復(fù)照射。作用比紫外線強(qiáng)烈，不宜反復(fù)照射。 3 3、太空育種、太空育種 利用微重力等太空因素引發(fā)突變。利用微重力等太空因素引發(fā)突變。（四）常用的化學(xué)誘變劑處理方法（四）常用的化學(xué)誘變劑處理方法n1、亞硝酸誘變、亞硝酸誘變n2、亞硝基胍（、亞硝基胍（NTG）誘變）誘變n3、硫酸二乙酯（、硫酸二乙酯（DES）誘變）誘變亞硝基胍（亞硝基胍（NTG）誘變）誘變 N N甲基甲基N N- -硝基硝基-N-N-亞硝基亞硝基胍胍(NGN(NGN，MNNGMNNG或或TG)TG)對(duì)真核或原核微對(duì)真核或原核微生物都

38、有強(qiáng)烈的誘變作用，有生物都有強(qiáng)烈的誘變作用，有“超超誘變劑誘變劑”之稱，能使細(xì)胞發(fā)生一次之稱，能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變，誘變效果好，尤其適或多次突變，誘變效果好，尤其適用于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株。注意用于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株。注意不同的水溶液不同的水溶液pHpH值影響誘變效應(yīng)。值影響誘變效應(yīng)。亞硝基胍（亞硝基胍（NTG）誘變操作步驟）誘變操作步驟1 1單孢子懸液制備：單孢子懸液制備： 取斜面，加入取斜面，加入6ml 6ml 0.1mol0.1molL pH6.oL pH6.o的磷酸緩沖液，用接種的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，

39、由此制得單孢子懸液，若紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá)孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá)l06l06個(gè)個(gè)mlml，此為待處理孢子懸液。，此為待處理孢子懸液。 2 2NTGNTG溶液的制備溶液的制備 用分析天平稱取用分析天平稱取2mg2mg，加入加入2ml 0.1mol2ml 0.1molL pH 6.0L pH 6.0磷酸緩沖液，磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解于暗處振蕩溶解。3 3誘變處理誘變處理 吸取吸取NTGNTG溶液溶液lmllml，加入到，加入到1m11m1孢子孢子懸液中，懸液中，3030振蕩振蕩30min30min，立即稀釋，立即稀釋10001000倍停倍停止作用

40、，然后以止作用，然后以1010-2-2，1010-4-4兩個(gè)稀釋度分離培兩個(gè)稀釋度分離培養(yǎng)，養(yǎng)，30 330 3天后計(jì)數(shù)。天后計(jì)數(shù)。 4 4死亡率計(jì)算死亡率計(jì)算 將未處理的孢子液將未處理的孢子液1ml1ml加入加入1ml1ml磷酸緩沖液中，同上逐級(jí)稀釋分離，磷酸緩沖液中，同上逐級(jí)稀釋分離， 3030下下培養(yǎng)培養(yǎng)3 3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。死亡率。 5 5挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選亞硝基胍（亞硝基胍（NTG）誘變注意事項(xiàng)）誘變注意事項(xiàng)nNTGNTG是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，操作時(shí)是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，操作

41、時(shí)一定要穿工作服，戴橡皮手套、口一定要穿工作服，戴橡皮手套、口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，凡接觸過中進(jìn)行，凡接觸過NTGNTG的器皿必需及的器皿必需及時(shí)、單獨(dú)處理，可用自來水大量沖時(shí)、單獨(dú)處理，可用自來水大量沖洗或用洗或用1-2mol/L1-2mol/L的的NaOH NaOH 浸泡過夜，浸泡過夜，洗凈。洗凈。三、雜交育種三、雜交育種n雜交育種雜交育種一般指兩個(gè)基因型不同的菌株通一般指兩個(gè)基因型不同的菌株通過結(jié)合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組過結(jié)合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。雜交

42、育種可以消除菌株經(jīng)長期誘變處株。雜交育種可以消除菌株經(jīng)長期誘變處理出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，通過雜交理出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，通過雜交可以改變產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至形成新品可以改變產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，甚至形成新品種，近年普遍采用的雜交方法是種，近年普遍采用的雜交方法是原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合融合。原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合（protoplast fusion） 1. 1.標(biāo)記菌株的篩選標(biāo)記菌株的篩選 2. 2.原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 3. 3.原生質(zhì)體的融合與再生原生質(zhì)體的融合與再生 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）脫水劑）脫水劑 助融劑助融劑 Ca Ca2+2+提高融合頻率提高融合頻率 4.4.融合子的選擇融合子的選擇 四、基因工程育種四、基因工程育種n基因重組育種：是運(yùn)用體外基因重組育種：是運(yùn)用體外DNA各種操作各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過細(xì)胞間的相內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過細(xì)胞間的相互作用，使一個(gè)細(xì)胞的優(yōu)秀性狀