第三章樣品前處理技術(shù)

1、第三章第三章 農(nóng)藥殘留分析的前處理技術(shù)農(nóng)藥殘留分析的前處理技術(shù)3.1 樣品制備目的和原理樣品制備目的和原理 3.2 樣品制備常規(guī)技術(shù)樣品制備常規(guī)技術(shù) 3.3 樣品制備新技術(shù)樣品制備新技術(shù)3.1 樣品制備的目的和原理樣品制備的目的和原理 樣品制備（樣品制備（sample preparation）是農(nóng)藥殘留分析方法的重要部分。包括從樣品中提取殘留農(nóng)藥，濃縮提取液和去除提取液中干擾性雜質(zhì)的分離凈化等步驟，是將實(shí)驗(yàn)室樣品處理成適合測(cè)定的檢測(cè)溶液的過程。 v樣品制備的目的樣品制備的目的 1）提高靈敏度和降低檢測(cè)限。）提高靈敏度和降低檢測(cè)限。 2）提高測(cè)試精度。）提高測(cè)試精度。 3）提高方法的選擇性。（衍

2、生化）提高方法的選擇性。（衍生化） 4）延長(zhǎng)儀器的使用壽命。）延長(zhǎng)儀器的使用壽命。樣品制備原理樣品制備原理 主要是利用殘留農(nóng)藥與樣品基質(zhì)的物理化學(xué)特性差異，使其從對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)有干擾作用的樣品基質(zhì)中提取分離出來。 農(nóng)藥的極性極性和溶解性溶解性是選擇提取和凈化條件的重要依據(jù)，在殘留農(nóng)藥的溶劑提取中常采用“相似相溶相似相溶”原理原理：使用與農(nóng)藥極性相近的溶劑為提取劑，使殘留農(nóng)藥在溶劑中達(dá)到最大溶解度。 1）極性）極性：共價(jià)鍵電子密度不均衡分布結(jié)果產(chǎn)生了鍵偶極。 常用溶劑的極性大小常用溶劑的極性大?。?己烷（石油醚）苯乙醚氯仿二氯甲烷丙酮乙酸乙酯乙腈二甲亞砜甲醇水 2）溶解性）溶解性 指農(nóng)藥在水相和有機(jī)

3、相中的溶解能力。 溶解度的大小很大程度上取決于農(nóng)藥分子所含官能團(tuán)的種類、數(shù)量、溶劑的性質(zhì)和其他外部因素。 農(nóng)藥的水溶性還受溫度、含鹽量、有機(jī)質(zhì)、PH值的影響。3.2 樣品制備常規(guī)技術(shù)樣品制備常規(guī)技術(shù)提取技術(shù)提取技術(shù) 提?。ㄌ崛。╡xtraction）是指通過溶解、吸著或揮發(fā)等方式將樣品中的殘留農(nóng)藥分離出來的操作步驟，也稱為萃取。提取原則提取原則：根據(jù)農(nóng)藥理化性質(zhì)按“相似相溶”原理進(jìn)行。 溶劑的選擇是關(guān)鍵。 1. 溶劑的極性（“相似相溶”原理） 2. 溶劑的純度（分析純以上） 3. 溶劑的沸點(diǎn)（4580之間）。v常用的提取溶劑：常用的提取溶劑： 石油醚、正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲

4、醇、水等v提取方法提取方法- 振蕩提取法振蕩提取法v振蕩浸提法是最常用的一種方法。它是將樣品粉碎后置于具塞三角瓶中，加入一定量的提取溶劑，用振蕩器振蕩13次，每次振蕩0.51h，過濾出溶劑后，再用溶劑洗滌濾渣一次或數(shù)次，合并提取液后進(jìn)行濃縮凈化。v適用于土壤、谷物等 樣品中農(nóng)藥的提取。組織搗碎法組織搗碎法v組織搗碎法也是一種常用的方法。它是將樣品先進(jìn)行適當(dāng)?shù)那兴?，再放入組織搗碎機(jī)中，加入適當(dāng)?shù)娜軇焖贀v碎35min，過濾后進(jìn)行濃縮凈化。v適用于蔬菜、水果等新鮮動(dòng)植物組織 樣品中農(nóng)藥的提取。超聲波法超聲波法v目前一般是用超聲波清洗超聲波清洗機(jī)來進(jìn)行超聲波提取。在超聲波清洗槽中裝入一定量的水，將

5、裝有樣品和提取溶劑的玻璃瓶放入其中，提取溶劑的液面要與槽中水面齊平。索式提取法索式提取法v用適當(dāng)?shù)奶崛∪軇┰谒魇教崛∑髦羞B續(xù)回流提取幾小時(shí)，獲得提取液。v提取效率高，但耗時(shí)長(zhǎng)8h以上）v適用于勻漿法等難提取樣品中 殘留農(nóng)藥的提取或是作為其他 提取方法提取效率的參照標(biāo)準(zhǔn)。 不適合于熱不穩(wěn)定農(nóng)藥的提取。 吹掃捕集法吹掃捕集法v主要用于水樣中揮發(fā)性有機(jī)物的分析。v主要構(gòu)件有吹沸器、捕集管，氣相色譜儀v操作步驟： 吹沸 捕集 解吸 GC分析v常用的二相溶劑對(duì)二相溶劑對(duì)系統(tǒng)有：乙酸乙酯-水、二氯甲烷-水，石油醚-水、石油醚-丙酮等。v液液分配提取效率的高低取決于化合物與提取溶劑的親和性親和性、二相的體積

6、比二相的體積比和提取次數(shù)提取次數(shù)三個(gè)因素。v影響提取效率的因素影響提取效率的因素： 1. 提取溶劑的選擇 2. 水相的鹽濃度 3. 水相的PH值乳化現(xiàn)象乳化現(xiàn)象 有機(jī)相、水相、乳化物和外力是乳化形成的主要因有機(jī)相、水相、乳化物和外力是乳化形成的主要因素。素。 破除乳化的方法破除乳化的方法：v離心(2000rpm，2min）v過濾（濾紙或無水硫酸鈉）v在水相中加入一定量的鹽（氯化鈉或其水溶液）v加入少量不同的有機(jī)溶劑（無水乙醇） v在振搖時(shí)，采用輕緩地向一個(gè)方向振搖的方式。 凈化技術(shù)凈化技術(shù) 凈化（cleanup）是指通過物理的或化學(xué)的方法除去提取物中對(duì)測(cè)定有干擾作用的雜質(zhì)的過程。主要是利用分析

7、物與基體中干擾物質(zhì)的理化特性的差異，將干擾物質(zhì)的量減少到能正常檢測(cè)目標(biāo)殘留農(nóng)藥的水平。主要干擾雜質(zhì)及性質(zhì)主要干擾雜質(zhì)及性質(zhì)類別化合物及其性質(zhì)脂類色素蠟質(zhì)肽、氨基酸碳水化合物木質(zhì)素脂肪、油脂（動(dòng)物動(dòng)物樣品），不溶于水，溶于多少有機(jī)溶劑葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素等（植物植物樣品），不溶于水，能溶于乙醇、丙酮丙酮和石油醚石油醚蠟質(zhì)（許多蔬菜蔬菜），易溶于有機(jī)溶劑含氮氮，對(duì)NPD、FPD檢測(cè)器有干擾糖、淀粉等，對(duì)低揮發(fā)性和高水溶性農(nóng)藥有干擾酚類及其衍生物，影響氨基甲酸酯類和苯氧羧酸類農(nóng)藥酚類代謝物的分析常用凈化方法常用凈化方法v柱層析法柱層析法v濃硫酸處理法濃硫酸處理法（水解脂類和色素，如凈化含有機(jī)氯類

8、樣品）v低溫冷凍（低溫冷凍（-80）法）法（凈化動(dòng)物樣品，除去脂肪和某些色素）柱層析法柱層析法 柱層析法是應(yīng)用最普遍的傳統(tǒng)凈化方法。 原理是將提取液中的農(nóng)藥和雜質(zhì)一起通過一支裝有吸附劑吸附劑的層析柱，它們即被吸附在具有表面活性的吸附劑上，然后用溶劑進(jìn)行淋洗，以達(dá)到目標(biāo)物與雜質(zhì)分離的目的。 吸附劑的基本要求吸附劑的基本要求：具有較大的比表面比表面；適宜的表面孔徑和吸附活性吸附活性；粒度分布粒度分布范圍盡量窄，并具有一定的強(qiáng)度。常用四種吸附劑的比較常用四種吸附劑的比較吸附劑名稱主要成分活性強(qiáng)弱活化處理方法弗羅里硅土弗羅里硅土（Florisil)硫酸鎂與硅酸鈉作用生成的沉淀物適合脂肪含量高的樣品的凈

9、化650烘烤3h ，干燥器存放。使用前再于130 活化1-2h。氧化鋁氧化鋁(alumina)氧化鋁（酸性、中性中性、堿性）對(duì)色素、脂肪、蠟質(zhì)有較強(qiáng)吸附能力先550 加熱4h，用前130 活化1-2h。加入5%10%重量的水水，混勻，放置過夜。硅膠硅膠硅酸鈉溶液加入鹽酸而制得的溶膠沉淀物對(duì)糖等極性雜質(zhì)有較強(qiáng)吸附能力先110 加熱1h，再加入0%10%重量的水，混勻后使用?；钚蕴炕钚蕴刻亢趯?duì)植物色素有很強(qiáng)的吸附能力，對(duì)脂肪、蠟質(zhì)吸附不強(qiáng)常與弗羅里硅土或氧化鋁按一定比例配合使用。柱層析法操作步驟：柱層析法操作步驟： v裝柱（濕法或干法干法，一般210g）：用適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ鯓O性）預(yù)淋柱子，讓柱處于濕

10、潤(rùn)和適于接受溶液的狀態(tài)。v上樣：將用溶劑稀釋的樣品溶液加在柱上，使樣品通過柱子。v洗脫：以洗脫分析物而讓雜質(zhì)保留的溶劑（一般為混合淋洗液）梯度洗脫柱子，回收分析物。樣品濃縮技術(shù)樣品濃縮技術(shù) 樣品濃縮的目的樣品濃縮的目的是使檢測(cè)溶液中待測(cè)物達(dá)到分析儀器靈敏度以上的濃度。 常用的濃縮方法有：v 減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法v K-D濃縮法v 氮?dú)獯蹈煞p壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法v減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法是利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在較低溫度下使大體積（50500mL）提取液得到快速濃縮的方法，操作方便，但殘留農(nóng)藥容易損失，且樣品還須轉(zhuǎn)移、定容。v原理是利用旋轉(zhuǎn)濃縮瓶對(duì)濃縮液起攪拌作用，并在瓶壁上形成液膜，擴(kuò)大蒸發(fā)面積

11、，同時(shí)又通過減壓，使溶劑的沸點(diǎn)降低，從而達(dá)到高效率濃縮目的。K-D濃縮法濃縮法vK-D濃縮法濃縮法是利用K-D濃縮器直接濃縮到刻度試管中的方法，適合于中等體積(1050mL)提取液的濃縮。v特點(diǎn)特點(diǎn)是可有效減少濃縮過程中農(nóng)藥 的損失，且能直接定容測(cè)定，無需 轉(zhuǎn)移樣品。但只適用于少量體積的 的樣品，且操作較煩瑣。 氮?dú)獯蹈煞ǖ獨(dú)獯蹈煞╲氮?dú)獯蹈煞ǖ獨(dú)獯蹈煞ㄊ侵苯永玫獨(dú)?流輕緩吹拂提取液及提高水浴 溫度，加速溶劑的蒸發(fā)速度來 濃縮樣品，可以有效防止氧化 反應(yīng)但只適合于小體積濃縮。 3 樣品制備新技術(shù)樣品制備新技術(shù)v固相萃?。ü滔噍腿。╯olid phase extraction,SPE）v固相微

12、萃取（固相微萃?。?solid phase microextraction，SPME）v基質(zhì)固相分散（基質(zhì)固相分散（Matrix SolidPhase Dispersion, MSPD）vQuEChERS 法法v免疫親和層析（免疫親和層析（immunoaffinity chromatography, IAC）v凝膠滲透色譜（凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography, GPC）v加速溶劑萃?。铀偃軇┹腿。╝ccelerated solvent extraction, ASE）v超臨界流體萃?。ǔR界流體萃取（supercritical fluid extract

13、ion, SFE）固相提取法（固相提取法（SPE）vSPE利用顆粒細(xì)小的多孔固相吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物選擇性地吸附，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo) 化合物的目的。v只能分離性質(zhì)差別較大性質(zhì)差別較大的物質(zhì)。固相萃取分離模式固相萃取分離模式v正相萃取正相萃?。何絼O性大于洗脫液極性，用于萃取極性物質(zhì)。如硅膠、弗羅里硅土、氧化鋁、氨基等。 反相萃取反相萃?。何絼O性小于洗脫液極性，用于萃取中等極性到非極性化合物。如C18、C8等。 離子交換萃取離子交換萃取：吸附劑都是帶有電荷的離子交換樹脂，用于萃取帶有電荷的化合物。如SAX，SCX等。固相萃取流程固相萃取流程v吸附柱

14、的選擇吸附柱的選擇：根據(jù)待分離對(duì)象的特點(diǎn)選擇合適的吸附柱。v活化吸附劑活化吸附劑：萃取樣品前用適當(dāng)?shù)娜軇┝芟垂滔嘀?。v加樣加樣：將已經(jīng)濃縮后的樣品采用適當(dāng)溶劑溶解后加入到吸附小柱上。v洗去干擾雜質(zhì)洗去干擾雜質(zhì)：選擇合適的淋洗溶劑將干擾雜質(zhì)先淋洗出小柱，農(nóng)藥保留在小柱中。v洗脫分析物洗脫分析物：選擇合適的淋洗溶劑將保留在小柱中的目標(biāo)農(nóng)藥洗脫出來并收集。 影響萃取效率的因素影響萃取效率的因素 吸附劑選擇吸附劑選擇：盡量選擇與目標(biāo)化合物極性相似的吸附劑。 淋洗劑選擇淋洗劑選擇：與目標(biāo)化合物性質(zhì)及吸附劑有關(guān)。 流速流速：樣品溶液的流速一般不超過5mL/min。 固相萃取的優(yōu)缺點(diǎn)固相萃取的優(yōu)缺點(diǎn) 高的回

15、收率和富集系數(shù)高的回收率和富集系數(shù) 不需要大量溶劑不需要大量溶劑 萃取時(shí)間短萃取時(shí)間短（是液液萃取的1/2） 操作簡(jiǎn)單操作簡(jiǎn)單、快速、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：復(fù)雜樣品有時(shí)會(huì)堵塞填料空隙； 復(fù)雜樣品的雜質(zhì)干擾等固相微萃?。ü滔辔⑤腿。⊿PME）vSPME是在SPE基礎(chǔ)上發(fā)展起來高效的樣品預(yù)處理技術(shù)。它是利用固相提取的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離和凈化，但所用的固相材料和分離機(jī)制不同。vSPME不是將待測(cè)物全部分離出來，而是通過殘留農(nóng)藥在樣品與固相涂層之間的平衡來達(dá)到分離目的。v其固相是一支覆蓋著一層高聚物固定相（聚丙烯酸酯）的熔融石英纖維。浸入樣品中，待測(cè)組分?jǐn)U散吸附到石英纖維表面的涂層，當(dāng)吸附平衡后，

16、與GC或HPLC聯(lián)用進(jìn)行分析測(cè)定。固相微萃取流程固相微萃取流程v 吸附吸附：萃取過程中應(yīng)用磁力攪拌、超聲振蕩等方式，可縮短達(dá)到平衡的時(shí)間。v 解吸解吸：高溫解吸（GC）或溶劑洗脫（HPLC）v 纖維的老化和清洗纖維的老化和清洗：使用前都需要0.5-4h的老化。 固相微萃取的影響因素固相微萃取的影響因素v固相涂層的性質(zhì)固相涂層的性質(zhì)：非極性固相涂層（聚二甲基硅氧烷）；極性固相涂層（聚丙烯酸酯）v液膜厚度液膜厚度：液膜越厚，吸附量越大，但平衡時(shí)間越長(zhǎng)。v攪拌效率攪拌效率：有利于縮短平衡時(shí)間。v溫度溫度：有利于縮短平衡時(shí)間，但會(huì)減少吸附量。v鹽的作用和溶液酸度鹽的作用和溶液酸度：可改變被分離物質(zhì)在水

17、中的溶解度，提高靈敏度。 SPME的優(yōu)缺點(diǎn)的優(yōu)缺點(diǎn) 操作時(shí)間短操作時(shí)間短(一般只需15min，是液液萃取的30%) 操作簡(jiǎn)便操作簡(jiǎn)便 無需萃取溶劑無需萃取溶劑 所需樣品量少 適用范圍廣泛 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：石英纖維非常脆弱，易折斷，重復(fù)性石英纖維非常脆弱，易折斷，重復(fù)性較差。較差?；|(zhì)固相分散萃取基質(zhì)固相分散萃?。∕SPD）vMSPD是將樣品與吸附填料（與SPE吸附材料一致）一起混合研磨，得到半干狀態(tài)的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將各種待測(cè)物洗脫下來。v反相吸附劑，如C8，C18，主要用來分離親脂性物質(zhì)v正相吸附劑，用于分離極性較大的農(nóng)藥優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v樣品分析時(shí)間短樣品分析時(shí)間

18、短v溶劑用量少溶劑用量少v避免了避免了樣品均化、轉(zhuǎn)溶、乳化等帶來的損失樣品均化、轉(zhuǎn)溶、乳化等帶來的損失缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：v取樣量小造成檢測(cè)限較高檢測(cè)限較高v雜質(zhì)凈化雜質(zhì)凈化方面不不如其他提取技術(shù)理想理想QuEChERS 法法vQuEChERS法是利用固相分散材料與樣品或樣品提取液充分接觸，吸附其中的雜質(zhì)而得到凈化的目的，或者是利用固相吸附劑吸附目標(biāo)分析物，再進(jìn)行解析而凈化。v其核心技術(shù)是凈化材料或萃取劑能夠選擇性地吸附樣品溶液中的目標(biāo)化合物或干擾物質(zhì)，以達(dá)到凈化樣品的目的，PSA優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v快速、快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠、安全簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠、安全（Quick, easy, cheap,

19、effective, rugged and safe）缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：vPSA價(jià)格較貴，不適合大批量農(nóng)藥殘留的檢測(cè)v 濃縮倍數(shù)小，需要靈敏度高的檢測(cè)儀器，如濃縮倍數(shù)小，需要靈敏度高的檢測(cè)儀器，如UPLC-MS-MS免疫親和層析（免疫親和層析（IAC）vIAC是以抗原抗體抗原抗體中的一方作為配基，親和吸附另一方的分離系統(tǒng)。是將抗體與惰性微珠惰性微珠（如，瓊脂糖、，瓊脂糖、纖維素纖維素）共價(jià)結(jié)合，然后裝柱，將抗原溶液過免疫親和柱，非目標(biāo)化合物不保留，最后用洗脫緩沖液洗脫抗原，從而得到純化的抗原。 免疫親和層析流程免疫親和層析流程v 裝填親和層析柱裝填親和層析柱v 加樣本加樣本v 樣本和抗體反應(yīng)樣本和抗

20、體反應(yīng)v 洗去未結(jié)合的物質(zhì)洗去未結(jié)合的物質(zhì)v 再洗去疏松結(jié)合的物質(zhì)再洗去疏松結(jié)合的物質(zhì)v 洗脫和抗體緊密結(jié)合的部分洗脫和抗體緊密結(jié)合的部分免疫親和柱的優(yōu)缺點(diǎn)免疫親和柱的優(yōu)缺點(diǎn)v特異性強(qiáng)、凈化效率高特異性強(qiáng)、凈化效率高v過程簡(jiǎn)單、統(tǒng)一過程簡(jiǎn)單、統(tǒng)一缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：v載體價(jià)格昂貴載體價(jià)格昂貴v特異性抗體難得特異性抗體難得凝膠滲透色譜（凝膠滲透色譜（GPC） GPC又稱為體積排阻色譜，是按溶質(zhì)分子的大小進(jìn)行分離的一種色譜技術(shù)。其原理是根據(jù)多孔凝膠對(duì)不同大小分子的排阻效應(yīng)進(jìn)行分離，樣品中的大分子先被洗脫出來，小分子后被洗脫出來。v凝膠類型凝膠類型： 交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20 ) 交聯(lián)聚

21、苯乙烯凝膠（Bio-Beads S-X）。v溶劑的選擇溶劑的選擇：所選用的溶劑應(yīng)該 對(duì)目標(biāo)物有良好的溶解度，并對(duì) 凝膠有一定的膨脹力。 常用的洗脫溶劑有：二氯甲烷、 氯仿、乙酸乙酯、己烷等。.優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：v自動(dòng)化程度高自動(dòng)化程度高v凈化效率高凈化效率高v回收率高回收率高v柱子可以重復(fù)使用柱子可以重復(fù)使用缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：小分子的干擾物會(huì)與目標(biāo)化合物一起流出，有時(shí)須再增加凈化步驟。加速溶劑萃取（加速溶劑萃?。ˋSE）v1995年，推出的一種新的全自動(dòng)提取技術(shù)。v原理是選擇合適的溶劑、通過提高溫度(50200)和壓力（1.52.0MPa）來加快萃取速度，提高萃取效率。v適用于固體、半固體樣品的提取。 特

22、點(diǎn)：所需溶劑少(約15ml/10g)， 快速(20min)，提取效率高。 ASE的裝置和流程的裝置和流程v裝置裝置：由：由溶劑瓶、泵、氣路、加熱爐、萃取池和收集瓶等構(gòu)成。v流程流程：將樣品放入萃取池； 設(shè)定程序，自動(dòng)進(jìn)行。（泵液、加溫加壓、萃取5min、收集） 溶劑瓶：4個(gè)； 萃取池：24個(gè)； 收集瓶：26個(gè) 幾種萃取技術(shù)的比較幾種萃取技術(shù)的比較技術(shù)樣品大小/g溶劑體積/mL 平均萃取時(shí)間索氏提取1030300500448h超聲提取301003000.51h微波提取5300.51h振蕩提取103013014hASE103015451220minv已被美國(guó)環(huán)保局（EPA）選定為推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法（EPA 3545, 1999）。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：溶劑用量少、快速、提取效率高溶劑用量少、快速、提取效率高缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：選擇性不高，萃取液多采用固相萃取、凝膠滲透色譜等加以凈化后再進(jìn)儀器檢測(cè)