第十七章藥物制劑的微生物檢驗

1、第一節(jié)第一節(jié) 體外抗菌試驗體外抗菌試驗 藥物的體外抗菌試驗包括用于區(qū)別藥物是抑藥物的體外抗菌試驗包括用于區(qū)別藥物是抑菌或殺菌藥物的菌或殺菌藥物的抑菌試驗抑菌試驗；測定藥物殺菌活性；測定藥物殺菌活性的的殺菌試驗殺菌試驗；以及檢查兩種藥物聯(lián)合作用的；以及檢查兩種藥物聯(lián)合作用的聯(lián)聯(lián)合抗菌試驗合抗菌試驗等。一般抑菌藥物只能抑制微生物等。一般抑菌藥物只能抑制微生物生長，不能殺死微生物，抑菌藥物被除去，微生長，不能殺死微生物，抑菌藥物被除去，微生物又可以恢復(fù)繼續(xù)生長。殺菌藥物能殺死微生物又可以恢復(fù)繼續(xù)生長。殺菌藥物能殺死微生物，殺菌藥物除去后，微生物仍然不能生長。生物，殺菌藥物除去后，微生物仍然不能生長。

2、 第十七章第十七章 藥物制劑的微生物檢驗藥物制劑的微生物檢驗 藥物的抑菌作用或殺菌作用是在一定條藥物的抑菌作用或殺菌作用是在一定條件下相對而言的。在我們檢測時，藥物的作件下相對而言的。在我們檢測時，藥物的作用受到用藥時培養(yǎng)基的組成、溫度、用受到用藥時培養(yǎng)基的組成、溫度、PHPH值及值及所用的菌種、菌量等各個因素有關(guān)。所用的菌種、菌量等各個因素有關(guān)。 雖然說體外抗菌試驗有很多優(yōu)點，但是雖然說體外抗菌試驗有很多優(yōu)點，但是由于體外抗菌試驗沒有復(fù)雜的體內(nèi)因素影響，由于體外抗菌試驗沒有復(fù)雜的體內(nèi)因素影響，因此藥物體外抗菌試驗和體內(nèi)抗菌試驗可能因此藥物體外抗菌試驗和體內(nèi)抗菌試驗可能會出現(xiàn)不一致的結(jié)果。所以

3、，一般我們在體會出現(xiàn)不一致的結(jié)果。所以，一般我們在體外對藥物進行測試后，有效的藥再要進行體外對藥物進行測試后，有效的藥再要進行體內(nèi)試驗，如果體內(nèi)試驗再次證實此藥有效的內(nèi)試驗，如果體內(nèi)試驗再次證實此藥有效的話，才能推薦應(yīng)用到臨床。話，才能推薦應(yīng)用到臨床。一、藥物的體外抑菌試驗一、藥物的體外抑菌試驗（一）體外抑菌試驗（一）體外抑菌試驗 藥物的體外抑菌試驗是常用抗菌試驗方法，其藥物的體外抑菌試驗是常用抗菌試驗方法，其中最常用的方法用系列稀釋法和瓊脂擴散法。中最常用的方法用系列稀釋法和瓊脂擴散法。 1 1、連續(xù)稀釋法、連續(xù)稀釋法 稀釋法有稀釋法有液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法和固體液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法和固體稀釋

4、法稀釋法（斜面法）兩種。這兩種方法都可以（斜面法）兩種。這兩種方法都可以用來測定藥物的最小抑菌濃度（用來測定藥物的最小抑菌濃度（MICMIC）：是）：是指該藥物能抑制細菌生長的最低濃度，通常指該藥物能抑制細菌生長的最低濃度，通常用用gmlgml或或U/mlU/ml表示。表示。 （1）液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法）液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法 2. 2.瓊脂擴散法瓊脂擴散法 利用藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴散，并在一定利用藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴散，并在一定濃度范圍內(nèi)抑制細菌生長的原理進行的。一般濃度范圍內(nèi)抑制細菌生長的原理進行的。一般用于細菌和酵母菌的藥敏試驗。用于細菌和酵母菌的藥敏試驗。1 1） 濾紙片法（紙碟法）濾紙

5、片法（紙碟法） 濾紙片法是最常用的方法，適用于新藥的初篩濾紙片法是最常用的方法，適用于新藥的初篩試驗（初步藥物是否有抗菌作用）及臨床的藥敏試試驗（初步藥物是否有抗菌作用）及臨床的藥敏試驗。驗。 濾紙片分濕、干兩種，可以在試驗時用無菌紙濾紙片分濕、干兩種，可以在試驗時用無菌紙片沾取藥物溶液放在含菌的平板表面，也以預(yù)先做片沾取藥物溶液放在含菌的平板表面，也以預(yù)先做成一定濃度的干燥紙片。一般來說預(yù)先做成的干燥成一定濃度的干燥紙片。一般來說預(yù)先做成的干燥紙片實用一些而且準確一些。紙片實用一些而且準確一些。世界衛(wèi)生組織規(guī)定了抗菌藥物的敏感性評定標準，在標準實驗條世界衛(wèi)生組織規(guī)定了抗菌藥物的敏感性評定標準

6、，在標準實驗條件下根據(jù)抑菌圈大小來判斷，比如：件下根據(jù)抑菌圈大小來判斷，比如：抗生素或化療藥物抗生素或化療藥物 抑菌圈直徑（抑菌圈直徑（mmmm） 耐藥耐藥 中敏中敏 敏感敏感氯霉素氯霉素 12 13-17 1812 13-17 18紅霉素紅霉素 13 14-17 1813 14-17 18四環(huán)素四環(huán)素 14 15-18 1914 15-18 19卡那霉素卡那霉素 13 14-17 1813 14-17 18(2)挖溝法挖溝法(3)打孔法打孔法（二）體外殺菌試驗（二）體外殺菌試驗 殺菌試驗是用來評價藥物對微生物的致殺菌試驗是用來評價藥物對微生物的致死活性的。死活性的。 1 1、最低殺菌濃度（、

7、最低殺菌濃度（MBCMBC）（最小致死濃）（最小致死濃度度MLCMLC）的測定）的測定 按液體培養(yǎng)基稀釋法的操作方法測定藥按液體培養(yǎng)基稀釋法的操作方法測定藥物的物的MICMIC。然后把未長出菌的各個試管培養(yǎng)液。然后把未長出菌的各個試管培養(yǎng)液分別移種到無菌平板上，培養(yǎng)后凡是平板上分別移種到無菌平板上，培養(yǎng)后凡是平板上無菌生長的藥物最低濃度就是最小致死濃度無菌生長的藥物最低濃度就是最小致死濃度（MLCMLC）。如果是細菌的話可以稱為最小殺菌）。如果是細菌的話可以稱為最小殺菌濃度（濃度（MBCMBC）。）。2 2、 活菌計數(shù)法活菌計數(shù)法 將定量的試驗菌加入到一定濃度的定量藥將定量的試驗菌加入到一定濃

8、度的定量藥物中，作用一定時間后，取樣進行活菌數(shù)計數(shù)，物中，作用一定時間后，取樣進行活菌數(shù)計數(shù)，從存活的微生物數(shù)量計算出藥物對試驗菌的致從存活的微生物數(shù)量計算出藥物對試驗菌的致死率，從而判斷藥物的殺菌能力。死率，從而判斷藥物的殺菌能力。 活菌計數(shù)一般是將定量的藥物與試驗菌作活菌計數(shù)一般是將定量的藥物與試驗菌作用后混合液稀釋后，混入瓊脂培養(yǎng)基做成平板，用后混合液稀釋后，混入瓊脂培養(yǎng)基做成平板，培養(yǎng)后數(shù)平板上形成的菌落數(shù)，由于一個菌落培養(yǎng)后數(shù)平板上形成的菌落數(shù)，由于一個菌落是由一個細菌繁殖而來的，所以可以用菌數(shù)乘是由一個細菌繁殖而來的，所以可以用菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，計算出混合液中存活的細菌數(shù)。以稀釋倍

9、數(shù)，計算出混合液中存活的細菌數(shù)。3 3、酚系數(shù)測定（石炭酸系數(shù)測定）、酚系數(shù)測定（石炭酸系數(shù)測定） 酚系數(shù)是以酚為標準，將待測的化學(xué)消毒劑酚系數(shù)是以酚為標準，將待測的化學(xué)消毒劑與殺菌效力相比較，所得的就是殺菌效力的比值。與殺菌效力相比較，所得的就是殺菌效力的比值。 由于各種化學(xué)消毒劑殺菌原理各不相同，因由于各種化學(xué)消毒劑殺菌原理各不相同，因而這種方法僅僅適用于酚類消毒劑殺菌效力的測而這種方法僅僅適用于酚類消毒劑殺菌效力的測定。定。 具體的測定方法是分別將酚及待測化學(xué)消毒具體的測定方法是分別將酚及待測化學(xué)消毒劑按不同比例稀釋，各取劑按不同比例稀釋，各取5ml5ml放到試管中，再加放到試管中，再加

10、入經(jīng)入經(jīng)2424小時培養(yǎng)后的菌懸液各小時培養(yǎng)后的菌懸液各0.5ml0.5ml，混勻后放，混勻后放入入 2020水浴中，水浴中，5 5、1010、1515分鐘分別取一接種環(huán)分鐘分別取一接種環(huán)混合液移種到另一支混合液移種到另一支5 ml5 ml的肉湯培養(yǎng)基中，的肉湯培養(yǎng)基中，3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時記錄生長情況。小時記錄生長情況。（三）聯(lián)合抗菌試驗（三）聯(lián)合抗菌試驗 聯(lián)合抗菌試驗主要用于測定兩種抗菌藥聯(lián)合抗菌試驗主要用于測定兩種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用時的相互影響。兩種抗菌藥聯(lián)合物聯(lián)合應(yīng)用時的相互影響。兩種抗菌藥聯(lián)合應(yīng)用時抗菌作用加強的稱為協(xié)同作用；抗菌應(yīng)用時抗菌作用加強的稱為協(xié)同作用；抗菌作用減弱的

11、稱為拮抗作用；相互無影響的稱作用減弱的稱為拮抗作用；相互無影響的稱為無關(guān)。常用的聯(lián)合抗菌試驗的方法有以下為無關(guān)。常用的聯(lián)合抗菌試驗的方法有以下幾種。幾種。棋盤棋盤法的設(shè)計 棋盤棋盤法的主要優(yōu)點在于甲、乙兩藥的每個藥物濃度都有單獨的和與另一個藥物不同濃度的聯(lián)合，因此能精確測定兩種抗菌藥物在適當濃度的比例下所產(chǎn)生的相互作用。 在進行棋盤棋盤法之前應(yīng)先測定兩種抗菌藥物單獨對受試菌的MIC，然后以兩藥MIC的8倍、4倍、2倍、1倍以及MIC的1/2、1/4、1/8濃度（或4倍、2倍、1倍、1/2、1/4濃度）分別進行聯(lián)合。可見舉例，如表1的青霉素G與鏈霉素聯(lián)合藥敏實驗。藥物及濃度 青霉素G(IUm1)

12、 鏈霉素單藥對照 4 2 1 0.5 0.25鏈霉素（gml） 64 - - - - - - 32 - - - - - - 16 - - - - - - 8 - - - + + + 4 - - - + + + 青霉素G單藥對照 - - - + + 細菌對照-：無細菌生長 +：有細菌生長FIC指數(shù)=11+1616=2無關(guān) 2. 2.紙條試驗紙條試驗在含菌平板上垂直放兩條浸有不同藥液的濾紙在含菌平板上垂直放兩條浸有不同藥液的濾紙條，培養(yǎng)后觀察兩藥形成的抑菌區(qū)的圖形來判條，培養(yǎng)后觀察兩藥形成的抑菌區(qū)的圖形來判斷兩藥聯(lián)合應(yīng)用時，是無關(guān)、協(xié)同還是拮抗作斷兩藥聯(lián)合應(yīng)用時，是無關(guān)、協(xié)同還是拮抗作用。用。 二

13、、二、藥物的體內(nèi)抗菌試驗藥物的體內(nèi)抗菌試驗 藥物的體內(nèi)抗菌試驗又稱為動物實驗治療試驗或藥物的體內(nèi)抗菌試驗又稱為動物實驗治療試驗或保護力試驗。當抗菌藥物進入機體后，其效力的發(fā)揮保護力試驗。當抗菌藥物進入機體后，其效力的發(fā)揮要受體內(nèi)各種因素的影響。如血液及組織內(nèi)的蛋白質(zhì)要受體內(nèi)各種因素的影響。如血液及組織內(nèi)的蛋白質(zhì)或磷脂、膿汁內(nèi)的核酸均與藥物結(jié)合，降低藥物的活或磷脂、膿汁內(nèi)的核酸均與藥物結(jié)合，降低藥物的活性；壞死組織內(nèi)的酸性環(huán)境也能影響藥物的活性。機性；壞死組織內(nèi)的酸性環(huán)境也能影響藥物的活性。機體內(nèi)的微生物，代謝活動較低，對藥物的敏感性降低，體內(nèi)的微生物，代謝活動較低，對藥物的敏感性降低，有時還可

14、形成細胞壁缺陷型細菌，對某些藥物不敏感。有時還可形成細胞壁缺陷型細菌，對某些藥物不敏感。機體內(nèi)各組織中藥物的吸收，分布不同，使藥物的濃機體內(nèi)各組織中藥物的吸收，分布不同，使藥物的濃度難以恒定。因此在評定新藥的藥效時除做體外抗菌度難以恒定。因此在評定新藥的藥效時除做體外抗菌試驗外還需要做體內(nèi)的抗菌試驗。試驗外還需要做體內(nèi)的抗菌試驗。 三、影響抗菌試驗的因素三、影響抗菌試驗的因素 1 1、試驗菌種、試驗菌種在抗菌試驗中所用到的菌種，必需是國家在抗菌試驗中所用到的菌種，必需是國家衛(wèi)生部生物制品檢定所菌種保藏中心專門提供衛(wèi)生部生物制品檢定所菌種保藏中心專門提供的標準菌株。在特殊情況下，也可以采用臨床的

15、標準菌株。在特殊情況下，也可以采用臨床新分離的并經(jīng)過鑒定、純化及合理保藏的菌株。新分離的并經(jīng)過鑒定、純化及合理保藏的菌株。而且我們要用到的試驗菌種應(yīng)該選擇是對數(shù)期而且我們要用到的試驗菌種應(yīng)該選擇是對數(shù)期生長的菌。因為那時菌種生命力最旺盛，這對生長的菌。因為那時菌種生命力最旺盛，這對于我試驗測定的結(jié)果也會準確些。于我試驗測定的結(jié)果也會準確些。2 2、 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 試驗所有到的培養(yǎng)基應(yīng)按各試驗菌的營養(yǎng)試驗所有到的培養(yǎng)基應(yīng)按各試驗菌的營養(yǎng)要求進行配制，嚴格控制各種原料、成分的質(zhì)要求進行配制，嚴格控制各種原料、成分的質(zhì)量及培養(yǎng)基的配制過程。要注意當有些藥物具量及培養(yǎng)基的配制過程。要注意當有些藥物具有抗代謝作用時，培養(yǎng)基應(yīng)不能存在代謝物，有抗代謝作用時，培養(yǎng)基應(yīng)不能存在代謝物，否則抑菌作用將會被消除。培養(yǎng)基內(nèi)如果含有否則抑菌作用將會被消除。培養(yǎng)基內(nèi)如果含有血清等蛋白質(zhì)時，有可能與某些抗菌藥物結(jié)合，血清等蛋白質(zhì)時，有可能與某些抗菌藥物結(jié)合，使抗菌藥物失去，所以就要避免培養(yǎng)基混進這使抗菌藥物失去，所以就要避免培養(yǎng)基混進這類營養(yǎng)物。類營養(yǎng)物。 3